MAPK和PI3K信号通路在胃癌中的作用及意义

【目的】 已有研究表明MAPK和PI3K信号途径是两条重要的抑制凋亡和促进增殖的转导通路,与癌症的发生发展关系密切,本实验通过检测在Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB在胃癌及癌旁组织的表达,探讨MAPK和PI3K信号通路在胃癌发展过程中的作用及意义。 【方法】 收集50对胃癌组织及其相应的癌旁组织,应用免疫组织化学技术检测胃癌及癌旁组织中Akt、Erk、Bcl-2和NF-κB蛋白的表达情况并进行分析。 【结果】 胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因突变的累积过程。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路是细胞内两条重要的促增殖和抗凋亡通路。PI3K-Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)处于中心环节,活化的Akt可激活下游信号分子,包括抑制凋亡的Bcl-2蛋白和转录因子NF-κB。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与基因表达调控,细胞功能活动以及个各种生理病理过程。胞外信号调节激酶(ERK1/2)是哺乳动物中5条并行的MAPK信号通路之一,通过激活下游靶位,包括重要的转录因子NF-κB和细胞存活调节器Bcl-2,调控基因表达,从而发挥抑制凋亡的作用。本研究结果显示人胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,说明上调PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的活性与胃癌的发生发展过程密切相关。     

NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中作用的探讨

【立论依据】 呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关。建立感染RSV的支气管上皮细胞(NHBE)模型,检测NHBE的增值、凋亡情况及NF-κB的转位,阐明NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中的作用,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法和思路。 【设计思路】 建立感染RSV的NHBE模型,检测细胞增值、凋亡情况以及NF-κB是否转位,定性定量地探讨呼吸道合胞病毒(RSV)是否通过诱导NF-κB激活介导人支气管上皮细胞(NHBE)凋亡。 【实验内容】 培养人支气管上皮细胞(NHBE),建立并鉴定RSV感染NHBE的体外细胞模型(用定量RT-PCR法鉴定细胞模型是否成功;设正常组、水相处理组、RSV感染组,MTT比色法检测RSV对NHBE增殖的抑制作用,感染组以不同滴度分为1 000、500、100、50、10 TCID50 5个组,感染12、48、72、96、120 h);用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测RSV诱导体外培养的NHBE的凋亡;以免疫荧光法和蛋白质印迹法检测经RSV处理的人支气管上皮细胞NF-κB的激活和对细胞凋亡的影响。 【材料】 人支气管上皮细胞(NHBE)细胞;RSV A亚型原型株Long株;细胞胞浆胞核蛋白提取试剂盒;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒;兔抗NF-κB抗体;电泳仪。 【可行性】 (1)呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关,感染RSV的人支气管上皮细胞模型容易建立成功。(2)本组成员长期跟随老师进行呼吸合胞病毒、流感病毒的研究,具有一定的科研基础和实验能力。(3)所需试剂、仪器、材料,医学基础实验中心基本都有配备,学校同时具备SPF级实验中心。 【创新性】 (1)首次从NF-κB角度探讨感染RSV的NHBE模型,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法思路。(2)分别使用免疫荧光法和蛋白质印迹法定性与定量检测RSV是否通过诱导NF-κB激活介导NHBE凋亡。     

TLR2/NF⁃κB通路介导MPP+诱导的RSC96细胞凋亡与自噬

目的：探讨1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenyl-pyridinium,MPP⁺ ）诱导的RSC96细胞凋亡与自噬功能障碍与TLR2/NF-κB信号通路的关系。方法：将RSC96细胞分为PBS组、MPP⁺ 组和MPP⁺ +CU-CPT22组;CCK-8检测不同MPP⁺ 浓度 （0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L）处理后细胞存活率;TUNEL检测细胞凋亡水平;RT-qPCR检测Toll样受体2（TLR2）mRNA转录水平;Western blot检测凋亡相关指标Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3/caspase-3,自噬相关指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和P62,以及TLR2、p-NF- κB/NF-κB蛋白表达水平。结果：与PBS组相比,MPP⁺ 组细胞存活率下降且呈浓度依赖性,TUNEL染色阳性细胞数增多,Bcl-2/ Bax蛋白比值水平下降,cleaved caspase-3/caspase-3比值增高。同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降,P62表达增加,p-NF-κB/NF-κB比值表达增加。RT-qPCR和Western blot结果显示,MPP⁺ 上调TLR2的表达。此外,与MPP⁺ 组相比,MPP⁺ +CU-CPT22组TUNEL阳性细胞数目减少,Bcl-2/Bax比值升高,cleaved caspase-3/caspase-3比值降低;同时,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升,P62水平下降。结论： MPP⁺ 刺激诱导RSC96细胞凋亡和自噬水平失衡,发生机制可能与TLR2/NF-κB通路的激活有关。     

去乙酰化酶SIRT1调控PFOA诱导小鼠肝损伤的作用及机制研究

【立论依据】 流行病学调查发现,全氟辛酸(PFOA)和人类多种疾病密切相关。我们前期研究发现PFOA可通过氧化应激、炎症反应和诱导凋亡引起小鼠肝脏毒性损伤。去乙酰化酶SIRT1在细胞应激反应中具有关键作用,可引起多种转录因子去乙酰化,从而促进细胞存活,抑制凋亡。因此,我们提出:“SIRT1的去乙酰化修饰可能对PFOA诱导的小鼠肝损伤起保护作用”。 【设计思路】 在前期研究的基础上,探讨PFOA肝脏毒性与SIRT1表达和反应活性的相关性;利用SIRT1激活剂以及SIRT1抑制剂观察SIRT1信号通路对PFOA诱导的肝脏毒性损伤的调控作用;通过检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的表达和乙酰化水平,分析SIRT1系统调控PFOA肝脏毒性的分子机制,是否与SIRT1对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰有关。 【实验内容】 (1)Real-time PCR和蛋白质印迹方法检测SIRT1的表达,免疫共沉淀法检测SIRT1的反应活性,对比正常对照和PFOA染毒小鼠,明确PFOA肝脏毒性与SIRT1的相关性;(2) PFOA染毒小鼠给予SIRT1激活剂SRT1720以及SIRT1抑制剂尼克酰胺,石蜡切片HE染色观察肝组织病理学改变;全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALP及LDH的血清水平;酶联免疫分析IL-6、COX-2及CRP的肝组织水平;免疫组化检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG的产生;比色法检测MDA生成及SOD、CAT和GSH-PX的活性;TUNEL染色法观察细胞凋亡;real-time PCR和蛋白质印迹方法检测Bcl-2、Bax、Fas、FasL等凋亡相关基因的表达,明确SIRT1通路的激活或抑制对PFOA诱导肝脏损伤的调控作用;(3)应用乙酰化赖氨酸抗体通过蛋白质印迹方法检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的乙酰化水平,分析SIRT1是否通过对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰调控PFOA诱导的肝脏毒性损伤。 【材料】 本项目以小鼠为实验动物,实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、全自动DNA扩增仪、紫外可见分光光度计、石蜡切片机、高速低温离心机、蛋白电泳系统、电转仪、全自动生化分析仪等。 【可行性】 本项目充分分析了国内外研究现状和发展前景,并取得了较好的前期研究基础。 【创新性】 SIRT1对PFOA肝脏毒性的调控作用尚未见报道,本实验项目研究SIRT1对PFOA诱导肝损伤的保护作用及其分子机制,为预防和治疗全氟化合物引起的肝脏损伤寻找新靶点。     

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗流感病毒分子机制的研究

【目的】 流感病毒感染是严重威胁人类健康的传染性疾病,抗病毒药物的研究已成为人们关注的焦点。前期研究发现EGCG可显著降低流感病毒感染后细胞氧化应激水平及流感病毒感染后细胞自噬水平。因此,我们推测EGCG的抗病毒机制与药物自身抗氧化特性及与宿主细胞调控作用存在一定相关性。本研究通过体外流感病毒感染模型,进一步揭示EGCG抗流感病毒的分子机制。 【方法】 (1)通过MTS法评价EGCG、天然抗氧化剂、氧化应激激活剂的细胞毒性。(2)蛋白质印迹法检测流感病毒感染时ERK等通路的激活与转录因子NF-κB、重要促炎因子上调的关系;以ERK特异性抑制剂为对照,以细胞p-ERK1/2磷酸化水平、病毒滴度等为指标,研究药物对流感病毒感染后细胞ERK通路的影响。(3)选择天然抗氧化剂与活性氧激活剂,通过MTS法、实时定量PCR等方法评价其对EGCG的抗流感病毒作用,并通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞内活性氧水平。(4)用激光共聚焦显微镜、FCM检测药物对流感病毒感染后的EGFP-LC3质粒转染细胞表达的影响,病毒感染与药物处理前后自噬小体的水平,蛋白质印迹法检测自噬蛋白LC3等的表达,自噬标记物-NBR1和p62水平。 【结果】 (1)EGCG可显著降低宿主细胞内氧化应激的水平(54%),与病毒对照组相比较有统计学差异(P<0.05)。(2)给予不同浓度EGCG处理后的病毒感染细胞,蛋白质印迹法检测发现ERK2表达受到了明显抑制。(3)天然抗氧化剂能加强EGCG对甲型流感病毒的抑制作用,并降低宿主细胞内氧化应激水平的程度,这一作用与抗氧化剂的类型相关。(4)氧化应激激活剂对EGCG的抗病毒作用、降低氧化应激水平程度起拮抗作用。(5)甲型流感病毒感染A549细胞导致自噬蛋白LC3-II上调,而EGCG可显著降低细胞自噬水平。 【结论】 EGCG可通过抗氧化作用调控氧化应激,降低细胞自噬水平,从而抑制流感病毒导致的细胞凋亡,发挥抗病毒作用。     

基于NF-κB探究苗医验方四大血调控佐剂性关节炎大鼠TNF-α表达的作用机制

【立论依据】 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的致残率在关节病中高居首位。四大血流传于西南苗族地区,在风湿类疾病的治疗中应用广泛。研究显示,炎症因子(如:TNF-α、IL-1β等)及信号通路(如:NF-κB等)的上调及激活与RA发病密切相关,且RA临床症状的改善与炎症因子的下调及信号通路的抑制有关。因而我们提出猜想:四大血能否下调TNF-α、IL-1β表达、抑制NF-κB激活?若能下调,该作用是否与抑制NF-κB有关? 【设计思路】 首先用四大血作用于RA模型动物及关节滑膜细胞,观察其能否下调TNF-α、IL-1β表达;若能,则对另一组RA模型动物及滑膜应用NF-κB抑制剂,去除NF-κB在四大血作用RA过程中的影响;之后,应用四大血观察TNF-α、IL-1β的表达水平是否下调,若未下调,说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用只与其抑制NF-κB有关,若部分下调(与应用NF-κB抑制剂之前相比,下调幅度减少),说明四大血下调TNF-α、IL-1β与抑制NF-κB部分有关,若完全下调(下调幅度与应用NF-κB作用前相同),说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用与其抑制NF-κB无关。 【实验内容】 (1)建立RA动物模型——佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠用于体内实验,并培养AA大鼠滑膜细胞用于体外实验;(2)灌胃给予AA大鼠及滑膜细胞一定浓度四大血;(3)观察给药后TNF-α、IL-1β变化情况;(4)若TNF-α、IL-1β下调,则用NF-κB抑制剂(BMS345541)对另一组AA大鼠及滑膜细胞进行预处理;(5)预处理后的AA大鼠及滑膜细胞给予一定浓度四大血;(6)观察TNF-α、IL-1β的表达水平。 【材料】 试剂:四大血、TNF-α、IL-1β等。动物及组织:SD大鼠、滑膜细胞。仪器:酶标仪、细胞培养箱等。 【可行性】 (1)本实验组前期成功建立AA大鼠模型并通过测量大鼠足跖肿胀度及病理形态学观察,证实了四大血最RA确切的治疗作用,具有较为扎实的实验基础;(2)所需实验器材易于获取;(3)采用常规实验手段,方法稳定可靠;(4)小组成员掌握所需实验技术手段,技能可靠。 【创新性】 (1)本实验研究对象为西南民族草药,具有地域性、民族性、特色性;(2)应用信号通路抑制剂,从而在去除NF-κB的基础上,单方面的探讨四大血对TNF-a、IL-1β的作用。     

番茄红素对脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应的作用及其分子机制

 【目的】 探讨番茄红素对脂多糖(LPS)所诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子生成的影响及其作用的分子机制。【方法】 分别用1、5、10 μmol/L 的番茄红素孵育细胞1 h,再用1 μg/mL LPS 处理细胞不同时间,分别用Griess法和ELISA法检测RAW264.7巨噬细胞培养基中NO及IL-6的含量,用Western-blot检测核因子-κB(NF-κB) p65、磷酸化和非磷酸化I-κBα、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的蛋白表达量。【结果】 番茄红素能有效地降低炎性因子NO和IL-6分泌,进一步研究显示番茄红素能够抑制LPS诱导I-κBα磷酸化和降解、NF-κB核转移,阻断ERK1/2和p38 MAPK激活,而对JNK活化没有影响。【结论】 番茄红素能够通过抑制ERK1/2 和p38 MAPK信号通路的激活而抑制巨噬细胞NF-κB依赖的炎症因子NO和IL-6生成,这可能是番茄红素防治一些炎症相关性疾病的作用机制之一。     

NF-κB信号通路介导楤木皂甙抗宫颈癌作用及机制研究

目的 探讨楤木皂苷对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和迁移的抑制作用,揭示核因子-κB(NF-κB)在楤木皂苷抑癌过程中的分子机制.方法 以体外培养的人宫颈癌细胞HeLa系为研究对象,实验分为对照组、楤木皂苷(200μg/mL)处理组(观察组),48 h后观察两组HeLa细胞增殖能力的改变.运用Western blot检测NF-κB的表达及酵母自噬基因Atg5/Vps30的同源基因(Beclin 1)、自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)的改变.结果 楤木皂苷能够显著抑制HeLa细胞的增殖;楤木皂苷能够抑制NF-κB信号通路及促进自噬相关蛋白Beclin 1、Atg 5、LC3B的表达.结论 楤木皂苷能够抑制NF-κB信号通路,进而诱导自噬的发生影响宫颈癌细胞HeLa的增殖和迁移.     

白细胞介素-33对肿瘤组织中髓系抑制性细胞功能的调控及机制

【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。     

冬凌草甲素对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的拮抗作用及其机制研究

目的 探讨冬凌草甲素体内外对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的拮抗作用及其机制。方法 通过大剂量冲击法,诱导制备耐紫杉醇的人卵巢癌HO-8910PM细胞株（HO-8910PM/PIX）,用不同浓度冬凌草甲素处理HO-8910PM/PIX细胞;或在冬凌草甲素作用HO-8910PM/PIX细胞前以NF-κB激活剂TPA进行预处理。给药后,细胞经DAPI染色,荧光显微镜下观察细胞形态变化;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blotting检测卵巢癌细胞中NF-κB蛋白的表达。建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型。接种后8周,观察冬凌草甲素对裸鼠皮下移植瘤生长的影响;免疫组织化学法检测肿瘤组织中NF-κB的阳性表达。结果 与对照组相比,冬凌草甲素呈浓度相关性抑制卵巢癌HO-8910PM/PIX细胞增殖,显著诱导细胞凋亡,而TPA可显著削弱冬凌草甲素诱导细胞凋亡的作用。与HO-8910PM细胞相比,NF-κB在HO-8910PM/PIX细胞中表达显著上调,冬凌草甲素可抑制HO-8910PM/PIX细胞中NF-κB的表达。冬凌草甲素可显著抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长,明显减弱移植瘤组织中NF-κB的阳性表达。结论 冬凌草甲素体内外对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性具有拮抗作用,该作用可能通过抑制NF-κB的表达而实现。     

去甲斑蝥素抗骨髓瘤作用及其机制研究

目的 探讨去甲斑蝥素（norcantharidin,NCTD）抗骨髓瘤作用及其相关机制。方法 MTT法检测NCTD对人骨髓瘤细胞株RPMI 8226增殖的抑制作用,并观察其对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测核因子-κB（NF-κB）p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制因子IkBα、磷酸化IkBα（p-IkBα）、IkB激酶α（IKKα）以及Survivin、Bcl-2、Bax蛋白表达水平,分光光度法检测Caspase-3活性,RT-PCR检测NF-κB mRNA表达。结果 NCTD抑制RPMI 8226细胞增殖,促进其凋亡;其剂量为20、40 mg/kg时对荷瘤小鼠的抑瘤率分别为29.8%、53.5%。NCTD抑制胞核NF-κB p65、p-NF-κB p65以及胞浆p-IkBα、IKKα的表达,增加胞浆IkBα的表达,对胞浆NF-κB p65的表达无显著影响。NCTD还抑制Survivin、Bcl-2蛋白的表达,促进Bax的表达和RPMI 8226细胞Caspase-3的活化,Caspase-3抑制剂能部分拮抗NCTD引起的RPMI 8226细胞凋亡（P＜0.05）。结论 NCTD对RPMI 8226细胞有抗增殖和促凋亡作用,其机制可能与NF-κB信号通路有关。     

苯并芘通过NF-κB诱导RAW264.7细胞MMPs的表达

目的 探讨烟雾主要成分苯并芘(BaP)对RAW264.7单核-吞噬细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的影响,为研究吸烟与腹主动脉瘤的关联提供相关依据。方法 应用免疫印迹法观察BaP对体外培养的RAW264.7单核-吞噬细胞基质金属蛋白酶-2/9/12(MMP-2/9/12)的影响,并验证其是否通过NF-κB信号通路。结果 BaP暴露使培养巨噬细胞NF-κB活化,同时伴随MMP-9、MMP-12表达升高,而PDTC,核转录因子NF-κB的抑制剂,可抑制NF-κB活化,同时伴随MMP-9、MMP-12表达下降。结论 BaP可通过NF-κB通路诱导RAW264.7单核-吞噬细胞MMP-9、MMP-12表达升高。     

NF-κB在Jak2/STAT3通路增加大鼠心肌缺血再灌注致脑损伤中的作用

目的 探讨NF-κB在Jak2/STAT3通路增加大鼠心肌缺血再灌注致脑损伤中的作用机制。方法 雄性SD大鼠随机分为3组（n=8）：假手术组（Sham）、心肌缺血/再灌注组（MIR）、心肌缺血/再灌注+AG490组（MIR+AG）。结扎大鼠冠状动脉左前降支30min再灌注120min建立心肌缺血/再灌注模型。取大鼠脑组织HE染色观察大鼠病理学结果,Western blot法检测凋亡相关蛋白及Jak2、STAT3的表达,Western blot法检测核蛋白中NF-κB/p65的含量。结果 与Sham组比较,MIR组脑组织凋亡水平增加：Bax及Cytc表达增多,Bcl-2表达降低;p-Jak2、p-STAT3表达较高,脑组织核蛋白中p65含量增多,反映NF-κB活性增高（P<0.05）;与MIR组比较,MIR+AG组脑组织的凋亡水平降低：Bax及Cytc表达减少,Bcl-2表达升高;p-Jak2、p-STAT3表达减少,NF-κB活性降低（P<0.05）。结论 抑制Jak2/STAT3通路可下调NF-κB活性并对心肌缺血再灌注起到保护作用。则Jak2/STAT3通路可能通过活化NF-κB增加脑组织凋亡水平。     

胃癌细胞中VD3对NF-κB通路的影响机制及与萜类化合物协同作用探究

【立论依据】 NF-κB信号转导途径在调节细胞增殖、分化、凋亡中起到重要作用; IκB-α是调节NF-κB信号转导途径的核心蛋白;VD₃可以通过影响IκB-α、转录因子等方式抑制NF-κB信号转导途径的激活;萜类化合物是目前医药研究中很有前景的化疗药物,NF-κB的抑制可以增强其抗肿瘤效应。 【设计思路】 选取低分化、中分化胃癌细胞与正常胃组织细胞,给予其不同VD₃作用环境(时间、浓度),从mRNA、蛋白水平上测定NF-κB途径的表达活性。通过阻断VD₃和IKKβ的相互作用,研究VD₃调控IκB-α含量的主导因素。协同施用二萜类化合物--紫杉醇与VD₃,探究两者的协同作用与最佳浓度。 【实验内容】 (1)将人胃癌中、低分化的细胞株系与正常胃组织细胞(空白对照),并分别用10^-9、10^-8、10^-7mol/L培养0、4、16、24 h后用RT-PCR检测IΚB-α的mRNA含量变化,用western blot检测IΚB-α蛋白的含量变化,以ChIP检测NF-κB转录因子与DNA结合活性。(2)降低IKKβ与VD₃的结合活性,阻断VD3对IκB-α降解的抑制,定量检测IκB-α的蛋白质和mRNA含量。(3)以不同浓度比例、作用时间方式的紫杉醇与VD₃刺激胃癌胃癌,检测其存活率与细胞周期分布。 【可行性】 预实验中已证实VD₃可以使胃癌细胞中IκB-α含量上升,且刺激时间为4h的组中最为显著。 【创新性】 (1)VD₃的部分作用机制仍不明确。我们猜想VD3可能通过抑制NF-κB通路上某些具体的信号分子而发挥作用,并期望在胃癌细胞中得以验证。(2)VD₃可以通过促进IκB-α的生成以及抑制IκB-α的降解来提高其在细胞中的含量,从而抑制细胞周期。但是哪种因素占主导作用却鲜有研究。我们设计IKKβ抑制实验来探究影响IκB-α含量的主导因素,从而为更有效地调节NF-κB信号通路提供实验依据。(3)选用萜类化合物中的紫杉醇,利用NF-κB通路为其与VD₃作用机制的交叉点,进行探究。如果确认VD₃对紫杉醇杀伤癌细胞产生增敏作用,将对胃癌的临床化疗提供一种有效的治疗方案。     

Bcl-2抑制剂S1诱导的卵巢癌细胞凋亡对自噬影响的实验研究

【目的】 凋亡与自噬密切相关,但二者之间的关系尚需进一步探究。本研究利用Bcl-2抑制剂S1建立卵巢癌细胞(SKOV3)凋亡模型,初步探究S1诱导的SKOV3细胞中凋亡对自噬的影响。 【方法】 培养SKOV3细胞。用MTT法检测S1对细胞生存率的影响。用流式细胞术检测细胞凋亡率。用蛋白质印迹方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3和自噬相关蛋白Beclin1、LC3的变化。用免疫荧光技术检测Beclin1及LC3蛋白的表达情况。在S1作用的基础上,应用广谱caspase抑制剂Z-VAD抑制caspase后,检测SKOV3细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3的变化。 【结果】 S1能够降低SKOV3细胞的生存率;增加SKOV3细胞的凋亡率。与对照组(0 h)相比,S1组(2、4、8、12、24、48 h)中的Bcl-2蛋白表达持续降低,Bax及caspase3蛋白表达持续增高,呈现出明显的时间依赖性;S1组(2、4、8、12、24、48 h)中自噬的发生也呈时间依赖性,但自噬并不是持续增强的,在12 h时,自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白表达水平最高,12 h后则呈下降趋势,Beclin1和LC3的荧光结果也表现出一致的现象。与S1单独作用(8、24 h)相比较,给予广谱caspase抑制剂Z-VAD,8 h结果显示 Beclin1及LC3蛋白的表达水平基本无变化,而24 h结果显示Beclin1及LC3蛋白的表达水平显著增高,同时荧光实验也显示出同样的结果。 【结论】 在SKOV3细胞中,S1通过抑制Bcl-2、促进Bax释放,诱导细胞发生凋亡,并呈时间依赖性增强。同时S1通过抑制Bcl-2,释放自噬起始基因Beclin1,诱导自噬发生。但是自噬并未始终呈时间依赖性增强,自噬水平在S1长时间作用下反而出现下降的趋势。据此推测,随着S1诱导凋亡的不断增强,大量活化的caspase可能通过裂解自噬起始基因Beclin1,从而抑制Beclin1诱导的自噬。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

BAFF-R介导的NF-κB信号通路对多发性骨髓瘤细胞增殖及存活的作用研究

目的 研究B淋巴细胞刺激因子受体(BAFF-R)介导的NF-κB信号通路在多发性骨髓瘤(MM)中的作用,并进一步研究NF-кB信号通路对MM细胞存活的影响。 方法 应用Western blot法分析BAFF-R对NF-κB信号通路相关蛋白的激活情况;同时通过RT-PCR、ELISA、WST-1检测NF-κB信号通路抑制剂(BAY11-7082)干预前后BAFF-R mRNA和蛋白表达水平以及对MM细胞增殖的影响。 结果 BAFF-R阻断性抗体(0、1、5和15μg/ml)能够减少p52和p65蛋白的入核,增加IκB-α蛋白表达量,即BAFF-R能够激活NF-κB信号通路。BAY11-7082(1、2和4μmol/L)显著降低BAFF-R mRNA、蛋白表达水平,减少MM细胞增殖和存活。 结论 BAFF-R激活NF-κB信号通路促进多发性骨髓瘤细胞的增殖及存活,进而参与多发性骨髓瘤的发生、发展。     

姜黄素联合雷帕霉素诱导去势难治性前列腺癌Pten-CaP8细胞自噬及凋亡研究

目的 探讨姜黄素联合雷帕霉素对去势难治性前列腺癌（CRPC）Pten-CaP8细胞增殖、自噬及凋亡的影响。方法 将不同浓度的姜黄素单独或与雷帕霉素共同处理Pten-CaP8细胞24 h后,MTT法检测细胞增殖,光镜下观察细胞形态,Western blotting法检测相关蛋白表达。结果 姜黄素联合雷帕霉素可显著抑制Pten-CaP8细胞增殖（P＜0.05）,上调LC3-II/LC3-I表达,诱导PARP裂解,还可下调p-AKT（S473）、p-S6（S240/244）、AR（N-20）和Cyclin D1蛋白表达水平,使Pten-CaP8细胞形态变短且胞浆内出现空泡改变。结论 姜黄素联合雷帕霉素可共同诱导Pten-CaP8细胞自噬及凋亡且效果显著,两者协同抗癌机制与其拮抗PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。     

MicroRNA-146a对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞增殖及凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨microRNA-146a（miR-146a）对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞增殖及凋亡的影响，并分析相关机制。方法 体外诱导并培养急性胰腺炎MPC-83细胞，将急性胰腺炎MPC-83细胞分为阴性对照组（mimics-NC组）、过表达miR-146a组（miR-146a-mimics组），另以未经诱导处理的MPC-83细胞为空白对照组（NG组）。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组MPC-83细胞miR-146a，MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6），Western blotting检测增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、核转录因子-κB p65（NF-кB p65）蛋白的表达。结果 急性胰腺炎细胞模型建立成功，成功转染后，与NG组、mimics-NC组比较，miR-146a-mimics组细胞凋亡率，TNF-α、IL-6、Bax和NF-κB p65蛋白相对表达量降低（P <0.05），细胞存活率、PCNA和Bcl-2蛋白相对表达量升高（P <0.05）。结论 过表达miRNA-146a可抑制急性胰腺炎MPC-83细胞凋亡并促进细胞增殖，其作用可能通过抑制NF-кB通路活化来实现。     

姜黄素诱导人胃癌SGC7901细胞自噬性凋亡的研究

目的 观察姜黄素体外诱导人胃癌SGC7901细胞自噬性凋亡的作用,并探讨其可能的作用机制.方法 用不同浓度的姜黄素处理SGC7901细胞,MTT法检测细胞增殖;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)荧光染色和Hoechst33342荧光染色观察细胞自噬和凋亡的发生;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白NF-κB、自噬相关蛋白Beclin1及LC3Ⅱ的表达.结果 姜黄素可呈剂量依赖性明显抑制SGC7901的生长.MDC染色显示,40μmol/L姜黄素在作用12h后即可诱导SGC7901细胞发生自噬,24 h自噬减少;Hoechst33342荧光染色显示,40μmol/L姜黄素诱导凋亡在24 h最明显;流式细胞术显示,40μmol/L姜黄素作用24h时SGC7901细胞凋亡率明显增加.Western blot检测显示,姜黄素诱导SGC7901细胞自噬性凋亡过程中,凋亡相关蛋白NF-κB、自噬相关蛋白Beclin1及LC3的表达均上调.结论 姜黄素通过诱导自噬性凋亡抑制人胃癌细胞SGC7901的生长,其机制与NF-κB、Beclin1及LC3蛋白的表达上调有关.