MiR-124通过调控Smad4促进C6胶质瘤细胞凋亡的研究

【立论依据】 胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。由于外科技术难以做到病理学上的全切除,术后复发率非常高。在前期实验中我们发现C6胶质瘤细胞miR-124含量显著低于与正常大鼠大脑组织,且转染miR-124 后,C6胶质瘤细胞数明显减少。我们应用microRNA靶基因信息软件查到smad4的mRNA与miR-124-3p有3个结合位点,smad4可能是miR-124的靶基因。由此推测miR-124可能通过抑制smad4的蛋白表达对胶质瘤细胞起作用。 【设计思路】 本实验以大鼠C6胶质瘤细胞为研究对象,通过人为转染miR-124,分析其对smad4蛋白表达的影响,并确定smad4为miR-124新靶基因,从而探索miR-124对促进C6胶质瘤细胞凋亡的新作用机制。 【实验内容】 (1)通过qRT-PCR检测正常大鼠大脑、C6胶质瘤细胞、转染后的C6胶质瘤细胞中miR-124的表达水平。(2)转染外源miR-124观察C6胶质瘤细胞的生长状态。(3)结合蛋白质印迹和TUNEL assay方法,比较分析miR-124转染前和后C6胶质瘤细胞凋亡差异。(4)通过qRT-PCR检测比较分析转染miR-124 前后C6胶质瘤细胞中smad4 mRNA的表达变化。(5)用蛋白质印迹检测转染miR-124前后的C6胶质瘤细胞中Smad4表达变化。(6)以siRNA-Smad4 抑制smad4基因的表达后,再转染 miR-124 mimic,通过蛋白质印迹和细胞荧光染色方法比较分析细胞增殖的变化。 【材料】 C6胶质瘤细胞,Lipo2000脂质体,miR-124 mimic,实时PCR仪,超净台,孵箱,相差显微镜,荧光显微镜,PCR相关试剂,蛋白质印迹相关试剂,TUNEL assay试剂盒,Smad4抗体等。 【可行性】 前期研究已证实人工转染miR-124后其细胞数明显降低,smad4的蛋白水平下调;通过microRNA靶基因信息软件查到smad4可能是miR-124的另一个靶基因;项目组成员已熟练掌握研究所需要各种实验技术;实验设备齐全,具有完成上述实验的基本仪器设备。 【创新性】 我们将证明:miR-124通过抑制smad4的蛋白表达,调控smad4,抑制胶质瘤细胞的增殖且促进死亡。已有研究表明miR-124通过抑制靶基因STAT3 的蛋白表达对胶质瘤起作用,但目前尚无关于miR-124与 smad4之间作用关系的报道。     

双酚A暴露经DNA甲基化途径影响滋养细胞功能的机制探讨

【目的】 本研究采用双酚A(bisphenol A,BPA)暴露的人滋养细胞模型(绒毛外滋养层细胞系HTR-8和合体化滋养层细胞系Bewo),分析滋养细胞分化及功能相关的重要基因的甲基化修饰及相应基因表达的改变,探索BPA暴露对滋养细胞的影响,从而为BPA高暴露人群提供科学的优生和生殖健康指导。 【方法】 蛋白质印迹法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GCM-1、systin-1等蛋白的表达;免疫荧光检测蛋白表达与定位;甲基化测序(BGS)验证DNA甲基化差异基因;Transwell实验检测滋养细胞侵袭能力;RT-PCR检测滋养细胞功能相关基因mRNA水平。 【结果】 粘附相关标志蛋白E-cadehrin在人滋养细胞侵袭模型HTR-8滋养细胞系中弱表达,其编码基因CDH1基因启动子呈超甲基化状态。BPA暴露后,E-cadherin的表达随BPA浓度增加呈梯度上调, 侵袭能力标志蛋白N-cadherin的表达呈梯度下调。Transwell实验显示HTR-8细胞的侵袭能力随BPA浓度增加而逐渐减弱;重亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequence,BSP)结果显示,BPA暴露后人基因组长重复序列LINE-1甲基化程度明显减少,人基因组短重复序列ALU甲基化程度无明显变化。蛋白质印迹和免疫荧光结果显示, BPA暴露的人滋养细胞合体化模型Bewo细胞系中,合体化标志蛋白systin-1和GCM-1的表达随BPA浓度增加而逐渐减弱。 【结论】 BPA暴露可使人滋养细胞侵袭模型HTR-8细胞系中粘附、侵袭相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达分别上调和下调,合体化模型Bewo细胞系中功能相关蛋白表达降低,这表明随BPA浓度增加,HTR-8细胞侵袭能力逐渐减弱,Bewo细胞合体化能力也逐渐减弱;伴随人基因组长重复序列LINE-1甲基化程度明显降低。研究结果显示,BPA可能通过DNA甲基化途径影响人滋养层细胞侵袭和合体化功能。     

宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型方法的建立

【立论依据】 高危型HPV在感染过程中产生的病毒源性癌蛋白E6、E7在宿主细胞中呈过度表达,是致宫颈癌的关键因素。已经证实,病毒基因组整合到宿主染色体是HPV致癌的重要因素。HPV DNA的整合不但改变整合位点及临近宿主基因的表达,而且可使HPV衣壳蛋白基因(L1和L2)片段缺失,这严重限制了目前临床上使用的基于L1基因序列的HPV检测及分型。本研究拟选择宫颈癌组织高表达的E6、E7基因序列,设计特异性探针及引物,优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,可快速对宫颈癌组织中高危型HPV进行检测和分型。 【设计思路】 设计HPV不同型别E6/E7特异性探针及引物,优化PCR条件,扩增宫颈肿瘤组织标本中高危型HPV E6/E7基因,结合测序,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,对宫颈癌组织高危型HPV进行检测和分型,并与目前临床上广泛使用的检测方法比较,验证该方法的敏感性和特异性。 【实验内容】 收集低度上皮内瘤变(LSIL)、高度上皮内瘤变(HSIL)和宫颈癌组织样本等不同类型的宫颈肿瘤组织标本,抽提DNA;根据高危型HPV早期基因 E6/E7基因序列,在同源性分析的基础上,设计HPV不同型别的E6/E7特异性探针及引物, PCR扩增宫颈肿瘤组织标本DNA,通过基因测序验证PCR扩增的特异性;进一步优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,检测宫颈肿瘤组织标本中HPV感染及型别,并与目前临床上使用的检测试剂盒比较,分析检测的灵敏性和特异性。 【材料】 LSIL组织样本、HSIL组织样本和宫颈癌组织样本各30例; HPV16+Siha细胞、HPV18+Hela细胞;不同型别HPV的E6/E7特异性探针及引物;高保真PCR酶及反应体系;琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳检测系统等。 【可行性】 本项目立论依据充分,标本来源丰富,前期预实验已运用此方法对高危型HPV16/18完成初步分型。 【创新性】 迄今尚无相关研究报道。本检测方法的建立为我国高危型HPV流行检测及宫颈癌疫苗的推广奠定基础。     

LCVS1002诱导大鼠视网膜变性

【立论依据】 Müller细胞的胶质化是很多视网膜变性疾病共有的病理过程,抑制胶质化能够保护视网膜。课题组前期研究表明LCVS1002在早期实验性糖尿病视网膜(diabetic retinopathy)病变大鼠的玻璃体中明显升高,我们推测LCVS1002可能参与了DR的视网膜变性。 【设计思路】 体内试验:检测正常SD大鼠和STZ诱导的糖网病大鼠的视网膜组织中LCVS 1002和GFAP的表达;在SD大鼠过表达LCVS1002以及在DR大鼠视网膜knockdown－LCVS1002检测其视网膜结构和功能的变化。体外试验:以661w细胞为研究对象,检测LCVS1002对神经视网膜作用的可能机制。 【实验内容】 (1)选用正常SD大鼠,采用视网膜免疫荧光方法检测出生后1~6周视网膜LCVS1002、GFAP的表达。(2)选用正常SD大鼠,对照组腹腔注射枸橼酸缓冲液,实验组注射链脲佐菌素(STZ),采用视网膜组织免疫荧光检测造模成功后的第1~7天视网膜LCVS 1002和GFAP的表达。(3)选用正常SD大鼠,在出生后10 d实验组视网膜下腔注射LCVS1002腺相关病毒(AAV2/8),对照组注射相同滴度空病毒载体,采用视网膜电生理、组织免疫荧光和TUNEL方法在4、6周分别检测视功能、LCVS1002、GFAP、Recoverin的表达和视网膜细胞的凋亡情况。(4)LC3-II腺病毒感染661W细胞后24 h,用LCVS1002处理,检测自噬。 【材料】 体内实验材料:雄性SD大鼠,由同济大学医学院实验动物中心提供。体外实验材料:661W细胞系。 【可行性】 实验所用病毒由公司商品化提供,实验所用技术包括视网膜下腔注射、免疫荧光、细胞培养是实验常规技术,能够保证实验顺利开展。 【创新性】 首次证明LCVS1002能够引起DR视网膜变性,参与DR早期的病变,有望作为一个DR的生物标记物(biomarker)。     

JAM-A表达与肺腺癌侵袭转移的关系及机制

【立论依据】 JAM-A是上皮细胞紧密连接结构的重要成分,在紧密连接装配、白细胞迁移、血小板活化和血管生成等细胞过程中发挥重要作用,参与调节炎症反应,并与细胞极性和渗透性的调节有关。目前发现JAM-A参与肿瘤的进展过程,其过量表达可能与患者的不良预后有关。但JAM-A在肿瘤进展中的功能尚存争议,JAM-A在肺腺癌中侵袭和转移中作用及机制尚未阐明。 【设计思路】 本实验在组织、细胞和动物三个层面探究肺癌中JAM-A蛋白在肺腺癌侵袭、转移和预后中的作用,证实JAM-A过表达促进肺腺癌进展。 【实验内容】 (1)组织实验:量子点免疫荧光检测200例肺腺癌组织JAM-A表达,观察JAM-A表达情况与临床病理因素及预后的关系。(2)细胞实验:培养人肺腺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,①用siRNA分别转染细胞系使JAM-A基因沉默;②质粒转染细胞系建立JAM-A基因高表达的模型;③对两个系列的肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞均用共聚焦显微镜、蛋白质印迹法和直接测定TER观察细胞紧密连接结构变化,Transwell小室方法检测细胞侵袭和迁移能力,MTT法检测细胞增殖能力。(3)动物实验:建立JAM-A(-)裸鼠和正常同种裸鼠构建肺腺癌荷瘤模型,检测肿瘤细胞JAM-A的表达情况并比较两组肿瘤的生物学特征。 【材料】 肺腺癌组织,肺腺癌细胞系,JAM-A(-)裸鼠,JAM-A抗体,质粒转染试剂盒,量子点试剂盒等。 【可行性】 前期工作已明确JAM-A在肺腺癌中表达与一些临床病理参数相关。指导教师课题组一直从事肿瘤侵袭转移机制研究并取得一定成绩,本组成员有较扎实的基础理论知识以及较熟练的实验操作技能。 【创新性】 (1)探讨肺腺癌组织中JAM-A表达与临床病理参数及预后的关系。(2)证实JAM-A过表达与肺腺癌的侵袭转移有关,并探究其机制。     

CRNDE靶向调控miR-186影响胶质瘤干细胞生物学行为的分子机制

【目的】 存在于脑胶质瘤组织中的胶质瘤干细胞(GSCs)与恶性脑胶质瘤的发生、发展和复发密切相关。长链非编码RNA (lncRNA)的转录和功能失调能够参与肿瘤的发生发展。结直肠肿瘤差别表达基因(CRNDE)属于lncRNA,有报道CRNDE在胶质瘤组织中的表达上调。本项目旨在研究GSCs中异常表达的CRNDE是否影响GSCs的生物学行为及相关的分子机制。 【方法】 Real-time PCR检测GSCs和non-GSCs中CRNDE和miR-186的表达水平以及CRNDE对miR-186的成熟体、初级转录本和前体表达的影响。双荧光素酶报告基因实验验证CRNDE与miR-186以及miR-186与靶基因间存在靶向结合。RIP和RNA pull-down实验检测CRNDE与miR-186和Ago2之间的相互作用。CCK-8细胞活力检测、流式细胞术、transwell迁移、侵袭实验验证CRNDE和miR-186对GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。建立GSCs裸鼠移植瘤模型验证Lv-shCRNDE和Lv-miR-186单独或联合应用对人GSCs裸鼠移植瘤的生长及荷瘤鼠生存时间的影响。 【结果】 GSCs中CRNDE的表达较non-GSCs组显著上调;GSCs中miR-186的表达水平较non-GSCs组显著下调。沉默CRNDE显著抑制了GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭。通过生物信息学软件分析,预测到CRNDE与miR-186存在结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验证明了CRNDE与miR-186的结合作用,明确了结合位点。在GSCs中,CRNDE能够结合Ago2,并与miR-186存在相互作用。下调GSCs中CRNDE的表达能显著上调miR-186的成熟体表达,而初级转录本和前体的表达均未见明显变化。过表达miR-186显著抑制了与GSCs增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白XIAP、noggin、MAPK1和PAK7的表达;沉默miR-186则显著上调了上述蛋白的表达。miR-186能够靶向结合XIAP、noggin、MAPK1和PAK7基因的3'非翻译区。沉默CRNDE后通过上调miR-186的表达,促进miR-186对靶基因XIAP、Noggin、MAPK1和PAK7的负性调控,抑制了GSCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭;过表达CRNDE结果则与之相反。与Lv-shCRNDE和Lv-miR-186单用相比,两者联合应用能够显著抑制人GSCs裸鼠移植瘤的生长,延长荷瘤鼠生存时间。 【结论】 CRNDE通过结合并负性调控miR-186的表达,减弱miR-186对靶基因XIAP、Noggin、MAPK1、PAK7的调节,影响GSCs的生物学行为。该研究能够为脑胶质瘤的治疗和药物研发提供新策略。     

慢病毒介导靶向PRL-3 基因的siRNA 抑制肝癌细胞的侵袭性

 【目的】 探讨肝再生磷酸酶-3(PRL-3)的表达对肝癌细胞侵袭能力的影响&#65377;【方法】 设计&#65380;合成4对针对PRL-3 基因siRNA 的寡核苷酸序列,分别构建质粒,转染293T 细胞,据其对PRL-3 的抑制率,筛选最有效的PRL-3 基因RNAi 靶序列,设计并合成其siRNA 的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL-GFP 线性化载体连接产生重组慢病毒质粒LV-PRL3-SiRNA,并行PCR 和测序鉴定&#65377;将LV-PRL3-SiRNA,pHelper 1.0 和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平经孔稀释法测定病毒滴度&#65377;重组慢病毒感染肝癌SMCC7721 细胞,行real time-PCR和western-blot验证PRL-3基因的沉默效果&#65377;用Transwell侵袭试验检测SMCC7721细胞体外侵袭力的改变&#65377;【结果】 成功构建PRL-3 基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为6 × 108 Tu/mL&#65377;和对照组相比,RNA 干扰组SMMC7721 细胞PRL-3 基因的mRNA 水平和蛋白水平的抑制率分别为75%和63%;其穿过人工基底膜的平均数(14.2 ± 0.8)明显少于空白对照组(33.0 ± 1.6)及非特异性siRNA感染组(31.2 ± 0.8),侵袭抑制率为58% (P < 0.01)&#65377;【结论】 降低PRL-3 的表达可抑制肝癌细胞的侵袭能力&#65377;     

人疱疹病毒6型感染与神经胶质瘤关系的初步研究

目的:研究人疱疹病毒6型(human herpesvirus-6,HHV-6)感染与神经胶质瘤的关系?方法:巢式PCR法检测40例神经胶质瘤样本和13例正常脑组织样本中HHV-6?人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)?HHV-7 DNA序列?免疫组化染色法检测神经胶质瘤样本和正常脑组织样本中HHV-6?HCMV?HHV-7抗原的表达?结果:巢式PCR法检测结果显示,神经胶质瘤组织HHV-6 DNA阳性率为42.5%,正常脑组织HHV-6 DNA阳性率为7.7%(P = 0.020),神经胶质瘤组织HCMV?HHV-7 DNA阳性率分别为20.0%和5.0%,正常脑组织未检测到HCMV和HHV-7 DNA(P值分别为0.087和0.566)?进一步用免疫组化染色法检测HHV-6早期抗原p41的表达,神经胶质瘤组织阳性率为27.5%,正常脑组织未见阳性表达(P = 0.030)?同时检测HHV-6晚期抗原gp116/64/54的表达,神经胶质瘤组织阳性率为32.5%,正常脑组织未见阳性表达(P = 0.014)?用HCMV pp65抗体进行免疫组化染色后发现其在神经胶质瘤中阳性率为12.5%,正常脑组织未见阳性表达(P = 0.229)?HHV-7 pp85抗原在神经胶质瘤样本和正常脑组织样本中均未检出阳性表达?结论:根据PCR和免疫组化的检测结果,HHV-6感染在神经胶质瘤和正常脑组织中具有显著性差异,HHV-6感染在神经胶质瘤的病因和发展过程中起了一定作用?     

17-AAG抑制piRNA-PIWI通路对神经母细胞瘤“干性”影响的研究

【理论依据】 piRNA是细胞内三大非编码RNA(nocodingRNA)之一,参与到干细胞干细胞“干性”的维持之中,同时与PIWI蛋白组成piRNA-PIWI通路,在大量不同类型的肿瘤细胞中高表达。类比miRNA领域取得的研究成果,例如组织工程学应用、抗肿瘤靶点等,探讨piRNA-PIWI通路是否具备相同的应用与靶点价值是本实验设计的核心所在。 【设计思路】 热休克蛋白90(hot shock protein 90)参与了piRNA负载到PIWI蛋白的关键过程,通过使用其抑制剂17-AAG能够间接的抑制piRNA-PIWI通路,同时以神经母细胞瘤的肿瘤干细胞为实验对象,探讨抑制piRNA-PIWI通路对于肿瘤干细胞“干性”的影响 【实验内容】 以小儿最常见的颅外实体瘤神经母细胞为实验对象:(1)神经母细胞瘤干细胞的富集:使用依托泊苷处理肿瘤细胞,进行肿瘤干细胞的富集。(2)实验对象的分组:①维甲酸组作为对照组;②17-AAG组;③RNAi-PIWIL2组。(3)实验检测指标:①PIWIL2 mRNA的检测;②细胞干性的评价:检测相关基因OCT4、SOX2、C-MYC与N-MYC基因的表达,甲基化相关酶(DNMT1、DNMT3)的表达,同时进行形态学观察、细胞凋亡以及细胞周期的监测。③piRNA-PIW通路功能的检测:检测代表性的转座子Line-1、IAP的表达,以及PIWIL2蛋白的表达。 【材料】 神经母细胞瘤细胞系IMR-32、SK-N-SH、SH-SY5Y;HSP90抑制剂17-AAG。 【可行性】 本实验室已在神经母细胞瘤的相关研究中取得研究成果,发表SCI论文,同时本实验的参与团队在校学习期间深入实验室研究过程之中,掌握了一定的实验技能。 【创新性】 探讨使用piRNA-PIWI通路的间接抑制剂17-AAG,从而研究抑制该通路对于神经母细胞瘤干细胞“干性”所造成的影响,为研究靶向抑制piRNA-PIWI通路作为抗肿瘤治疗新靶点奠定理论基础,同时亦为未来开发基于piRNA的组织工程学重编程细胞的新靶点进行前瞻性研究。     

人类疱疹病毒6A亚型DR7基因对神经胶质瘤细胞U87增殖､迁移､侵袭能力的影响

目的:构建含人类疱疹病毒6A亚型DR7基因的慢病毒,研究DR7基因表达对神经胶质瘤细胞U87增殖?迁移?侵袭能力的影响?方法:PCR扩增DR7基因,克隆至慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP,构建pLenti6.3-DR7-IRES2-EGFP重组慢病毒载体,经293T细胞包装重组病毒转染至神经胶质瘤细胞U87,经blasticidin筛选建立稳定表达株,通过细胞增殖实验?细胞周期实验?细胞划痕及Transwell实验研究稳定表达DR7基因对U87细胞的增殖?迁移及侵袭能力的影响?结果:成功构建了pLenti6.3-DR7-6 × His-IRES2-EGFP慢病毒表达载体,筛选了稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞株,CCK-8细胞增殖实验显示,稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞与阴性对照细胞U87-NC-EGFP?U87细胞相比,细胞增殖活性明显增高,差异具有统计学意义(P < 0.001)?细胞周期检测发现U87-DR7-EGFP细胞S?G2/M期细胞所占比例多于U87-NC-EGFP?U87细胞:S期的比例分别为(34.73 ± 1.12)%?(24.89 ± 0.93)%?(25.39 ± 0.96)%,差异具有统计学意义(P < 0.001);G2/M期分别为(17.35 ± 1.61)%?(11.36 ± 1.50)%?(13.17 ± 1.95)%,差异具有统计学意义(P < 0.05)?细胞划痕实验表明,U87-DR7-EGFP细胞愈合能力明显强于U87-NC-EGFP?U87细胞,划痕6 h愈合率分别为:(33.55 ± 2.83)%?(23.50 ± 3.18)%?(22.03 ± 1.47)%,差异具有统计学意义(P < 0.01);划痕12 h愈合率分别为(70.50 ± 5.39)%?(53.60 ± 4.67)%?(55.09 ± 2.83)%,差异具有统计学意义(P < 0.001)?Transwell实验表明,U87-DR7-EGFP细胞的穿膜数量明显多于U87-NC-EGFP?U87细胞,分别为:(543.00 ± 22.94)?(387.00 ± 15.63)?(412.00 ± 20.30)个,差异具有统计学意义(P < 0.001)?结论:人类疱疹病毒6A亚型DR7基因表达能在体外促进人神经胶质瘤细胞U87增殖?迁移及侵袭,提示其在神经胶质瘤的发生和发展中可能起一定作用?     

丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

脑胶质瘤组织中Tip60蛋白表达与预后关系

目的 揭示脑胶质瘤组织中Tip60蛋白表达与临床病理特征及长期预后的关系。方法 收集108例脑胶质瘤肿瘤标本,采用免疫组织化学方法检测神经胶质瘤组织Tip60蛋白表达,统计分析Tip60蛋白表达与患者性别、年龄、组织学分级、肿瘤部位、肿瘤类型、肿瘤直径和KPS评分等临床病理特征及5年总生存时间的关系。结果 脑胶质瘤组织中Tip60蛋白表达与肿瘤级别密切相关,高级别胶质瘤比低级别胶质瘤Tip60蛋白表达显著减少(P<0.001)。Tip60蛋白低表达组患者平均5年总生存时间25.3个月(95%CI:20.9~29.8),Tip60蛋白高表达组患者平均5年总生存时间38.9个月(95%CI:32.9~45.0);经Log-rank检验,低表达组平均5年总生存时间显著短于高表达组(P=0.001)。多因素COX回归分析显示,Tip60蛋白低表达是5年总生存时间缩短的独立危险因素(HR=1.762,95%CI:1.028~3.020,P=0.039)。结论 Tip60蛋白与神经胶质瘤恶性程度密切相关,Tip60蛋白低表达是神经胶质瘤长期预后不良的独立危险因素。     

SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用

【立论依据】 SRPX1(别名drs/EXT1),在人类的多种肿瘤细胞系(包括结肠、膀胱、睾丸、肺等)以及癌组织中drs mRNA的表达量显著降低,暗示了drs基因在抑制肿瘤形成过程中所发挥的作用。由drs基因介导的细胞凋亡和自我吞噬反应可以作为其肿瘤抑制作用的分子基础。 【设计思路】 以正常卵巢组织为对照进行临床病例分析:设5个实验组:正常卵巢组织、卵巢良性黏液性肿瘤组、卵巢交界性黏液性肿瘤组、卵巢恶性黏液性肿瘤组(腺癌,原发灶)、卵巢恶性黏液性肿瘤组(腺癌,转移灶)。应用免疫组化的方法,检测SRPX1表达状况,探索SRPX1基因与肿瘤发生及患者生存率和复发率等临床参数的关系;采用代表性的HO-8910(低转移性的人卵巢癌细胞株)、HO-8910pm(高转移性的人卵巢癌细胞株)为研究对象,用免疫组化和蛋白质印迹法检测SRPX1蛋白表达情况;采用基因敲除技术,特异性的敲除正常卵巢组织细胞的SRPX1基因,用免疫组化和蛋白质印迹法检测SRPX1蛋白表达情况,并观察正常卵巢组织细胞的生长情况。 【实验内容】 为了阐述SRPX1基因在上皮型卵巢癌的发生、转移中所发挥的作用,本研究通过临床病例分析,细胞培养和特异性的敲除正常卵巢组织细胞的SRPX1基因,检测和分析SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用。 【材料】 临床病理组织,细胞培养基,试剂,抗体,操作器械,实验仪器。 【可行性】 和正常卵巢上皮组织对比,SRPX1蛋白在人卵巢癌细胞株中表达明显降低,与恶性程度相关,在高转移的细胞系表达减低。 【创新性】 本项目所要阐明的实验现象和机制,即对SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用分析后,为开发新的肿瘤治疗药物提供理论依据。本课题基于我们最新的发现基础上,目前国际上还没有这方面的研究报告,据有很好的创新性和前沿性。     

人胶质瘤自杀基因细胞系的建立及其在胶质瘤治疗研究中的应用

目的 构建CD基因工程化人脑胶质瘤细胞并在此基础上进行胶质瘤治疗研究。方法 通过In-fusion基因克隆的方法,构建携带CD基因慢病毒载体;通过293T细胞体外包装获得慢病毒,并测定病毒效价;通过慢病毒体外感染细胞获得CD基因工程化人脑胶质瘤细胞;通过流式分选获得基因稳定表达细胞;通过CCK-8评价加入5-FC前药和(或)HSV-1后细胞存活率。结果 成功构建pLVX-CD-IRES-ZsGreen1慢病毒载体并体外包装获得相应慢病毒;慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞后获得携带CD基因的阳性细胞,并通过体外培养30天后流式分选获得稳定阳性细胞;加入前药5-FC和(或)HSV-1后对携带CD基因的U87细胞杀伤作用明显(P<0.01),其中5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞作用更加高效(P<0.01)。结论 成功获得携带CD基因的人脑胶质瘤细胞;前药5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞具有更加高效的杀伤疗效。     

Fucoidan干预小鼠肝癌淋巴道转移及其分子机制研究

【立论依据】 我国有辽阔的海域,海洋药物资源丰富,开发潜力巨大。随着陆地资源的日益枯竭,海洋药物开发研究已迫在眉睫。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是从Undaria pinnatifida孢子叶中提取富含L-岩藻糖和硫酸根的天然水溶性胞外杂聚糖,研究表明其具有抗凝血、抗肿瘤、降血脂等作用。恶性肿瘤患者的死亡主要是由于肿瘤的转移造成的,其中淋巴道转移是肿瘤转移的重要方式。HGF、C-Met及VEGF-C、VEGFR-3是转移通路中重要的细胞蛋白和膜表面受体蛋白,在转移中起着极其重要的作用。 【设计路思】 本实验以探究Fucoidan对小鼠肝癌淋巴道转移的影响为目的,检测了药物处理后肿瘤细胞转移相关蛋白VEGFR-3、C-Met及细胞外分泌因子VEGFC、HGF的变化,为临床肿瘤转移药物的开发应用提供前期基础研究依据。 【实验内容】 本研究以小鼠肝癌细胞系Hca-F为细胞模型,采用蛋白质印迹法、酶联免疫吸附剂测定法、聚合酶链式反应法、Transwell法等,检测药物对Hca-F细胞的转移、侵袭相关蛋白表达以及基因转录的影响。 【材料】 大连海域自然生长的裙带菜(Undaria pinnatifida)孢子叶、小鼠肝癌Hca-F细胞系、细胞和分子生物学实验所需试剂、抗体、Transwell小室等。 【可行性】 本课题组从裙带菜孢子叶中提取Fucoidan,对其进行纯化及理化性质分析,并对其抗肿瘤、免疫调节等活性进行研究,已完成对Hca-F细胞生长因子受体VEGFR-3和C-Met表达,以及生长因子VEGF-C和HGF的分泌进行检测。本实验设计合理,具有可行性。 【创新性】 目前对Fucoidan的研究主要集中于诱导肿瘤细胞凋亡,对其抗肿瘤侵袭转移的研究却鲜有报道。本实验以Hca-F细胞株为研究对象,探究Fucoidan对小鼠高淋巴道转移细胞Hca-F侵袭转移的影响,具有一定创新性。     

MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

宿主因子NF90调节流感病毒复制的研究

【目的】 研究流感病毒的宿主因子NF90对流感病毒复制的影响。 【方法】 从 293T细胞中提取总RNA,以Oligo(dT)反转录cDNA。根据Gen Bank 中NF90的基因序列,设计上下游引物。以转录出的cDNA为模板扩增出NF90基因。用EcoR I 和Not I两种核酸内切酶对NF90 PCR扩增产物和PCDNA3.1-V5-HIS载体进行双酶切,酶切产物用高效DNA连接酶连接,然后鉴定选取正确的重组质粒,并命名为PCDNA3.1-NF90-V5-HIS。把PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至293T细胞,转染36 h后感染流感病毒A/WSN/1933 Moi 0.01,感染16 h后提取293T细胞的总蛋白,用蛋白质印迹法检测PCDNA-NF90-V5-HIS 重组质粒和流感病毒NP蛋白的表达。 【结果】 PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至细胞后,NP蛋白表达下降,流感病毒复制减弱。 【结论】 宿主因子NF90可以抑制流感病毒的复制。     

D5 Stat5a对人类乳腺癌细胞钙粘蛋白表达的影响

【立论依据及设计思路】 Delta5 STAT5a是谭敦勇教授运用基因克隆等技术发现人类转录因子“STAT5a”的一种信使RNA剪切后的变体。大量前期工作证实D5 Stat5a在人类乳腺癌组织有异常表达,经腺病毒介导将D5 Stat5a cDNA转入培养的人乳腺癌细胞后,能显著促进癌细胞的增值与去分化。提示D5 Stat5a在乳腺癌的发生、发展及预后中,具有重要的病理学意义。E-cadherin位于上皮组织,是细胞与细胞之间相互连接的主要分子。在人的许多恶性肿瘤中E-cadherin表达减少或缺失与肿瘤发展,侵袭和转移密切相关,体外试验明确的证实了在培养状态下表达E-cadherin分子的肿瘤不侵入其附着的基质,但如果使E-cadherin表达缺失,肿瘤细胞获得侵袭能力。将E-cadherin的 cDNA 转染肿瘤细胞使其表达E-cadherin分子后,肿瘤丧失其侵袭能力。我们推测D5 Stat5a对癌细胞转移特性的影响与其调节E-cadherin等基因的表达有关。本课题拟通过采用腺病毒介导的基因转移技术转染人乳腺癌细胞,检测转染后E-cadherin表达的变化,以了解D5 Stat5a对人乳腺癌细胞E-cadherin的表达是否具有调节作用。 【实验内容】 培养乳腺癌细胞(MCF-7),分为空白组、阴性对照组和实验组。用腺病毒(Adv-D5)转染实验组乳腺癌细胞,同法构建不针对任何基因的阴性对照腺病毒。采用qRT-PCR、蛋白质印迹和细胞免疫荧光方法检测D5 Stat5a转染后E-cadherin在mRNA水平和蛋白水平的表达,将所得数据进行统计学处理并分析。 【材料】 D5 Stat5a和细胞系,RPMI 1640培养液10%胎牛血清,1%青链霉素,腺病毒(Adv-D5),Trizol试剂,E-cadherin的引物,PCR仪,逆转录反应试剂盒,36℃水浴箱,低速离心机,CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 E-cadherin是一类介导细胞间质同质粘附的钙依耐性跨膜糖蛋白,其下调可降低一个组织内细胞黏附的强度,导致细胞活动性增加。大量研究表明癌细胞中E-cadherin表达下调或异常表达。D5 stat5a可能是通过调控E-cadherin的表达来影响癌细胞的转移,实验的进展具有可预见性。 【创新性】 D5 stat5a作为一种刚被研究出来的STAT5a的基因变体,目前关于这种基因与E-cadherin在乳腺癌中的关系研究尚少,通过对比MCF-7与Adv-D5转染后MCF-7中E-cadherin的表达情况,探讨D5 stat5a对E-cadherin的影响,为D5 stat5a在乳腺癌的治疗中提供理论依据。