JAM-A表达与肺腺癌侵袭转移的关系及机制

【立论依据】 JAM-A是上皮细胞紧密连接结构的重要成分,在紧密连接装配、白细胞迁移、血小板活化和血管生成等细胞过程中发挥重要作用,参与调节炎症反应,并与细胞极性和渗透性的调节有关。目前发现JAM-A参与肿瘤的进展过程,其过量表达可能与患者的不良预后有关。但JAM-A在肿瘤进展中的功能尚存争议,JAM-A在肺腺癌中侵袭和转移中作用及机制尚未阐明。 【设计思路】 本实验在组织、细胞和动物三个层面探究肺癌中JAM-A蛋白在肺腺癌侵袭、转移和预后中的作用,证实JAM-A过表达促进肺腺癌进展。 【实验内容】 (1)组织实验:量子点免疫荧光检测200例肺腺癌组织JAM-A表达,观察JAM-A表达情况与临床病理因素及预后的关系。(2)细胞实验:培养人肺腺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,①用siRNA分别转染细胞系使JAM-A基因沉默;②质粒转染细胞系建立JAM-A基因高表达的模型;③对两个系列的肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞均用共聚焦显微镜、蛋白质印迹法和直接测定TER观察细胞紧密连接结构变化,Transwell小室方法检测细胞侵袭和迁移能力,MTT法检测细胞增殖能力。(3)动物实验:建立JAM-A(-)裸鼠和正常同种裸鼠构建肺腺癌荷瘤模型,检测肿瘤细胞JAM-A的表达情况并比较两组肿瘤的生物学特征。 【材料】 肺腺癌组织,肺腺癌细胞系,JAM-A(-)裸鼠,JAM-A抗体,质粒转染试剂盒,量子点试剂盒等。 【可行性】 前期工作已明确JAM-A在肺腺癌中表达与一些临床病理参数相关。指导教师课题组一直从事肿瘤侵袭转移机制研究并取得一定成绩,本组成员有较扎实的基础理论知识以及较熟练的实验操作技能。 【创新性】 (1)探讨肺腺癌组织中JAM-A表达与临床病理参数及预后的关系。(2)证实JAM-A过表达与肺腺癌的侵袭转移有关,并探究其机制。     

SOCS1、SHP1在JAK2V617F突变阳性骨髓增殖性肿瘤中的表达及鲁索替尼的调控作用

目的 研究JAK2V617F突变阳性骨髓增殖性肿瘤（MPN）组织中JAK2V617F突变量与磷酸化Janus激酶2（p-JAK2）、细胞因子信号转导抑制蛋白1（SOCS1）、含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP1）表达的关系,并探讨JAK2抑制剂鲁索替尼（ruxolitinib）对JAK2V617F突变阳性人红白血病细胞系HEL细胞的增殖和HEL细胞中SOCS1、SHP1表达的影响。方法 纳入2012年7月至2016年8月于河北省人民医院和保定市第一医院就诊的48例JAK2V617F突变阳性的MPN患者为MPN组,同期24例贫血患者为对照组。采用免疫组织化学法检测骨髓组织标本中p-JAK2、SOCS1和SHP1的蛋白表达水平。SOCS1、SHP1蛋白表达量与JAK2V617F突变量的相关分析采用Spearman等级相关分析。用不同浓度（50、100、250、500、1 000 nmol/L）的鲁索替尼处理HEL细胞后,采用CCK-8法检测HEL细胞的活力,qPCR法检测MPN组织和HEL细胞中JAK2V617F突变量以及HEL细胞中JAK2、SOCS1、SHP1 mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测HEL细胞中JAK2、p-JAK2、SOCS1、SHP1的蛋白表达水平。结果 （1）MPN组织中JAK2V617F/JAK2比值为（57.33±20.82）%,对照组为0%。MPN患者骨髓细胞质中p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白质表达量与对照组相比差异均有统计学意义（P均<0.01）。（2）MPN组织中SOCS1、SHP1蛋白表达量均与JAK2V617F突变量呈负相关（r=-0.648、-0.692,P均<0.05）。JAK2V617F/JAK2比值<50% MPN患者的SOCS1、SHP1蛋白表达水平高于JAK2V617F/JAK2比值≥ 50%的MPN患者（P均<0.01）,p-JAK2的蛋白表达水平低于JAK2V617F/JAK2比值≥ 50%者（P<0.01）。（3）250 nmol/L鲁索替尼处理24、48、72 h后,HEL细胞活力分别为（60.06±3.87）%、（52.05±2.88）%、（36.43±2.01）%。随着鲁索替尼浓度的增加,HEL细胞中JAK2的mRNA和蛋白表达与p-JAK2的蛋白表达水平逐渐降低（P<0.01,P<0.05）,SOCS1和SHP1的mRNA和蛋白表达逐渐增加（P均<0.01）。结论 鲁索替尼能够抑制HEL细胞中JAK2的mRNA和蛋白表达及其磷酸化水平,增加SOCS1、SHP1 mRNA和蛋白表达,降低HEL细胞的活力。     

淫羊藿苷对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮间质转分化的作用及机制

[目的] 观察淫羊藿苷对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮-间质转化的作用以及对Smad信号通路的影响。[方法] 将肾小管上皮细胞(HK-2)分为空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+淫羊藿苷(10、20、40 μmol/L)组。采用CCK-8法检测10、20、40 μmol/L的淫羊藿苷干预10 μg/L TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的增殖影响; 使用实时定量聚合酶链式反应法检测检测上皮间质转化分管关键因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)mRNA的表达量; 采用Western blot检测α-SMA、E-cadherin、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达量; 划痕实验和侵袭迁移小室法(Transwell小室)分别检测HK-2细胞的迁移和侵袭能力。[结果] 与空白对照组比较, TGF-β1组的HK-2细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增高(P<0.05), α-SMA、vimentin蛋白和mRNA以及p-Smad2/3蛋白表达量显著增加(P<0.05), 而E-cadherin、Smad2/3蛋白和mRNA表达量显著降低(P<0.05)。与TGF-β1组比较, TGF-β1+淫羊藿苷(10、20、40 μmol/L)组的HK-2细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低(P<0.05), α-SMA、vimentin蛋白和mRNA以及p-Smad2/3蛋白表达量显著降低(P<0.05), 而E-cadherin、Smad2/3蛋白和mRNA表达量显著增加(P<0.05)。淫羊藿苷对TGF-β1诱导HK-2细胞抑制增殖、迁移和侵袭能力以及上皮间质转化无剂量依赖性。[结论] 淫羊藿苷可以抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的上皮-间质转化的分化, 可能与抑制Smad信号通路有关。     

SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用

【立论依据】 SRPX1(别名drs/EXT1),在人类的多种肿瘤细胞系(包括结肠、膀胱、睾丸、肺等)以及癌组织中drs mRNA的表达量显著降低,暗示了drs基因在抑制肿瘤形成过程中所发挥的作用。由drs基因介导的细胞凋亡和自我吞噬反应可以作为其肿瘤抑制作用的分子基础。 【设计思路】 以正常卵巢组织为对照进行临床病例分析:设5个实验组:正常卵巢组织、卵巢良性黏液性肿瘤组、卵巢交界性黏液性肿瘤组、卵巢恶性黏液性肿瘤组(腺癌,原发灶)、卵巢恶性黏液性肿瘤组(腺癌,转移灶)。应用免疫组化的方法,检测SRPX1表达状况,探索SRPX1基因与肿瘤发生及患者生存率和复发率等临床参数的关系;采用代表性的HO-8910(低转移性的人卵巢癌细胞株)、HO-8910pm(高转移性的人卵巢癌细胞株)为研究对象,用免疫组化和蛋白质印迹法检测SRPX1蛋白表达情况;采用基因敲除技术,特异性的敲除正常卵巢组织细胞的SRPX1基因,用免疫组化和蛋白质印迹法检测SRPX1蛋白表达情况,并观察正常卵巢组织细胞的生长情况。 【实验内容】 为了阐述SRPX1基因在上皮型卵巢癌的发生、转移中所发挥的作用,本研究通过临床病例分析,细胞培养和特异性的敲除正常卵巢组织细胞的SRPX1基因,检测和分析SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用。 【材料】 临床病理组织,细胞培养基,试剂,抗体,操作器械,实验仪器。 【可行性】 和正常卵巢上皮组织对比,SRPX1蛋白在人卵巢癌细胞株中表达明显降低,与恶性程度相关,在高转移的细胞系表达减低。 【创新性】 本项目所要阐明的实验现象和机制,即对SRPX1基因在卵巢癌组织的表达和作用分析后,为开发新的肿瘤治疗药物提供理论依据。本课题基于我们最新的发现基础上,目前国际上还没有这方面的研究报告,据有很好的创新性和前沿性。     

人疱疹病毒6型DR7蛋白在神经胶质瘤发生中的作用研究

【立论依据】 神经胶质瘤是人类最常见的颅内原发性肿瘤,恶性程度高,对人类健康造成严重威胁。近年来有关神经胶质瘤和病毒感染相关的证据逐渐增多。人疱疹病毒6型 (human herpesvirus 6, HHV-6)是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒,分为HHV-6A和6B两个亚型。HHV-6是一种肿瘤相关病毒,近年来国内外文献均报道在胶质瘤标本中 HHV-6DNA和蛋白的阳性率明显高于对照组,表明HHV-6感染在神经胶质瘤的发生中具有重要作用,但是起关键作用的病毒基因及机制仍不十分清楚。HHV-6 DR7基因是潜在的转化基因,其表达产物是一种转录激活子。文献报道DR7蛋白能导致NIH3T3细胞体外转化以及裸鼠皮下成瘤,DR7蛋白还可以和肿瘤抑制基因p53结合导致p53功能缺失。为探究 DR7在神经胶质瘤发生中的作用,我们通过免疫组化检测了神经胶质瘤组织中DR7的表达,发现神经胶质瘤组织中DR7的阳性率明显高于瘤旁及正常组织。 【设计思路】 首先明确DR7蛋白对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和转移的影响,然后深入研究引起上述变化的分子机制,并在体内进一步证实DR7蛋白对神经胶质瘤肿瘤形成能力的影响。 【实验内容】 (1)构建 DR7过表达载体,建立DR7过表达稳定转染细胞系。(2)细胞水平上研究DR7蛋白对细胞增殖,侵袭和转移等生物学功能的影响。(3)运用基因芯片,real-time PCR和蛋白质印迹等技术确定引起上述变化的机制。(4)体内验证DR7蛋白对神经胶质瘤细胞肿瘤形成能力的影响。 【材料】 HHV-6标准株,U87细胞株,real-time PCR试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体,裸鼠。 【可行性】 (1)理论依据充分。HHV-6是嗜神经的DNA病毒,可长期潜伏于中枢神经系统。潜伏期的HHV-6基因组可整合于宿主染色体,一旦宿主免疫力下降则再激活,激活的HHV-6表达多种病毒蛋白,其中DR7是具有反式激活能力的转化基因。(2)有前期结果。我们已成功建立了DR7过表达稳定转染细胞系,MTT和Transwell实验均表明DR7蛋白能明显促进U87细胞的增殖和侵袭。 【创新性】 本研究基于临床,运用分子生物学的相关技术,首次研究HHV-6DR7在神经胶质瘤发生发展中的作用,将为神经胶质瘤的预防及治疗提供新靶点。     

肝刺激因子表达下调通过ERK促进肝癌细胞转移的研究

【目的】 肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)能促进肝细胞增殖、抑制肝细胞凋亡,是细胞内重要的存活因子。本课题组前期研究发现多种促癌因素可下调肝癌细胞中HSS的表达,其表达水平的降低可以促进肝癌细胞发生转移侵袭,但相关机制尚不明了。研究表明细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肝癌转移,因此本研究旨在阐明HSS表达降低与EMT的关系并探究其中的分子机制。 【方法】 利用实验室已经构建好的稳定低表达HSS的HepG2细胞(shRNA)和稳定高表达HSS的HepG2细胞(HSS)作为研究对象,首先应用蛋白质印迹方法检测不同细胞的上皮细胞分子标志物(如E-cadherin和ZO-1)和间质细胞分子标志物(例如vimentin、fibronectin)表达的变化,确定HSS表达改变与EMT的关系;选择在EMT中发挥重要作用的激酶磷酸化抗体,利用蛋白质印迹的方法,筛选参与HSS表达下调诱导EMT发生的激酶,并应用特定激酶抑制剂,通过Transwell转移和侵袭实验,检测细胞迁移侵袭能力的改变,进一步确定候选激酶的作用;最后运用脾注射肝转移实验分析HSS表达下降与裸鼠生存率的关系。 【结果】 蛋白质印迹结果显示shRNA细胞的间质细胞分子标志物表达明显增高,上皮细胞分子标志物表达明显降低,说明HSS表达降低后肝癌细胞发生EMT。AKT和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在EMT的发生过程中具有重要作用,蛋白质印迹结果显示shRNA细胞中AKT磷酸化水平没有明显改变,但ERK的磷酸化水平明显增高;使用不同浓度的ERK抑制剂PD98059后进行trans-well迁移和侵袭实验,结果显示shRNA细胞无论迁出小孔还是穿过铺有基质胶的小孔的数目都明显减少,而且随着抑制剂浓度的增加,发生迁移侵袭的细胞数目随之减少,具有剂量依赖性,说明ERK在HSS表达降低诱导的EMT过程中具有关键的作用。脾注射shRNA细胞4周后,裸鼠体重明显下降,腹部变黑并明显增大,不足9周全部死亡,而注射HSS细胞后,裸鼠体重下降不明显,10周后才开始出现死亡,说明HSS表达降低后促进细胞的迁移侵袭使裸鼠生存时间明显缩短。 【结论】 肝刺激因子表达降低激活ERK,诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化从而促进肝癌的转移。     

Fucoidan干预小鼠肝癌淋巴道转移及其分子机制研究

【立论依据】 我国有辽阔的海域,海洋药物资源丰富,开发潜力巨大。随着陆地资源的日益枯竭,海洋药物开发研究已迫在眉睫。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是从Undaria pinnatifida孢子叶中提取富含L-岩藻糖和硫酸根的天然水溶性胞外杂聚糖,研究表明其具有抗凝血、抗肿瘤、降血脂等作用。恶性肿瘤患者的死亡主要是由于肿瘤的转移造成的,其中淋巴道转移是肿瘤转移的重要方式。HGF、C-Met及VEGF-C、VEGFR-3是转移通路中重要的细胞蛋白和膜表面受体蛋白,在转移中起着极其重要的作用。 【设计路思】 本实验以探究Fucoidan对小鼠肝癌淋巴道转移的影响为目的,检测了药物处理后肿瘤细胞转移相关蛋白VEGFR-3、C-Met及细胞外分泌因子VEGFC、HGF的变化,为临床肿瘤转移药物的开发应用提供前期基础研究依据。 【实验内容】 本研究以小鼠肝癌细胞系Hca-F为细胞模型,采用蛋白质印迹法、酶联免疫吸附剂测定法、聚合酶链式反应法、Transwell法等,检测药物对Hca-F细胞的转移、侵袭相关蛋白表达以及基因转录的影响。 【材料】 大连海域自然生长的裙带菜(Undaria pinnatifida)孢子叶、小鼠肝癌Hca-F细胞系、细胞和分子生物学实验所需试剂、抗体、Transwell小室等。 【可行性】 本课题组从裙带菜孢子叶中提取Fucoidan,对其进行纯化及理化性质分析,并对其抗肿瘤、免疫调节等活性进行研究,已完成对Hca-F细胞生长因子受体VEGFR-3和C-Met表达,以及生长因子VEGF-C和HGF的分泌进行检测。本实验设计合理,具有可行性。 【创新性】 目前对Fucoidan的研究主要集中于诱导肿瘤细胞凋亡,对其抗肿瘤侵袭转移的研究却鲜有报道。本实验以Hca-F细胞株为研究对象,探究Fucoidan对小鼠高淋巴道转移细胞Hca-F侵袭转移的影响,具有一定创新性。     

PEDF抑制乳腺癌转移机制:通过p-ERK和p-AKT途径介导减少纤连蛋白表达

【目的】 色素上皮细胞衍生因子(PEDF)是一种多功能分泌性糖蛋白,具有神经营养、抑制新生血管和抗肿瘤的作用。PEDF通过降低微血管密度从而抑制肿瘤的作用已有研究,但其在乳腺癌转移中的确切作用和机制尚不明了。 【方法】 体内实验中,我们使用稳定表达PEDF的MDA-MB-231乳腺癌细胞原位肿瘤模型评估裸鼠乳腺癌的肝转移和肺转移。体外实验中,在MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞过表达PEDF,用Boyden小室检测其的侵袭和转移能力。此外,PEDF对乳腺癌细胞EMT相关的Maker、纤连蛋白(fibronectin)及p-AKT、p-ERK分别用qRT-PCR、蛋白质印迹法和荧光免疫细胞化学法测定。肿瘤血管新生密度用MVD分析。 【结果】 实验发现,体外实验和在体实验中,PEDF均明显抑制了乳腺癌的转移。PEDF抑制肿瘤转移是通过抑制fibronectin表达,而非逆转EMT途径,而增加fibronectin可抵消PEDF的抑制乳腺癌的作用。此外,PEDF抑制fibronectin蛋白的表达是通过层黏连蛋白受体(laminin receptor)及后续的p-ERK 和p-AKT信号通路起作用的。 【结论】 实验结果证实了PEDF在乳腺癌生长和转移中发挥重要作用,并且发现,PEDF是通过层黏连蛋白受体介导和抑制fibronectin表达得以实现的。这为今后的乳腺癌治疗提供了新的思路。     

石斛碱调节JNK信号通路对白血病细胞存活和上皮间质转化的影响

【目的】探讨石斛碱对体外培养的白血病细胞存活和转移特性的影响。【方法】用不同浓度石斛碱处理HuT-78细胞,选择无明显细胞毒性的浓度进行后续实验。以细胞计数盒8(CCK8)法测定细胞存活率;流式细胞术测定细胞凋亡水平;Transwell法测定细胞侵袭能力;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞增殖、凋亡、上皮间质转化及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路蛋白表达水平。【结果】石斛碱浓度高于5μg/mL可对HuT-78细胞产生明显的细胞毒性;石斛碱剂量依赖性地抑制HuT-78细胞克隆数、上皮间质转化能力,促进细胞凋亡,并调节增殖、凋亡和上皮间质转化相关蛋白表达水平;且石斛碱能部分逆转JNK抑制剂SP600125对细胞增殖、凋亡和上皮间质转化相关蛋白表达水平的干预作用。【结论】石斛碱对白血病细胞存活和转移的抑制作用,与促JNK通路磷酸化激活有关。     

EB病毒编码的LMP2A通过激活MTA1介导鼻咽癌上皮间质转化作用的机理研究

【目的】 研究转移性肿瘤抗原1 (MTA1)在鼻咽癌中的表达及其对鼻咽癌发生发展的影响;明确Epstein-Barr病毒编码的潜伏膜蛋白2A (LMP2A)和MTA1的关系及其机制。 【方法】 利用免疫组化检测鼻咽癌和正常鼻黏膜组织中的MTA1蛋白和EMT相关蛋白的表达情况,并结合临床病理特征和EMT相关蛋白进行相关性分析。构建MTA1过表达和干扰表达的鼻咽癌细胞系,蛋白质印迹和transwell实验检测MTA1对鼻咽癌细胞侵袭和EMT发生的影响。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测Wnt通路和β-catenin核转位研究MTA1发挥功能的机制。以免疫组化检测鼻咽癌组织中LMP2A和MTA1的相关性,慢病毒技术构建LMP2A表达而MTA1缺失的细胞系,蛋白质印迹和transwell实验检测其侵袭能力和EMT的变化。进而建立裸鼠尾静脉注射和左心室注射模型,体内实验研究MTA1对鼻咽癌转移的影响。使用mTOR下游调控通路4EBP1的抑制剂INK-128和siRNA干扰c-myc表达,研究LMP2A激活MTA1表达的通路机制。 【结果】 免疫组化分析发现MTA1高表达与鼻咽癌TNM分期的N和M分期呈正相关。在鼻咽癌组织中MTA1高表达于癌巢和癌浸润发生部位。MTA1的高表达与E-cadherin表达呈负相关,和Vimentin的表达呈正相关。低表达MTA1的细胞系CNE-1过表达MTA1后,侵袭能力增强,EMT表型增加。高表达MTA1的细胞系CNE-2干扰其表达后,侵袭能力减弱,EMT表型减少。裸鼠左心室注射,CNE-1-MTA1细胞转移能力增强,CNE-2-siMTA1细胞转移能力下降。CNE-1的MTA1过表达促进了Wnt1的表达,促使β-catenin的入核。LMP2A和MTA1的过表达具有正相关性。LMP2A促进了CNE-1和CNE-2细胞系表达MTA1。在LMP2A表达的细胞系中,干扰MTA1的表达能抑制肿瘤侵袭和EMT的发生。动物模型亦显示CNE-1-LMP2A的MTA1表达干扰抑制了肿瘤转移的发生。过表达LMP2A的CNE-1细胞系中mTOR和4EBP1-eIF4E axis通路活化。与Rapamycin相比较,INK-128药物能特异性抑制4EBP1-eIF4E axis的活化,降低CNE-1-LMP2A的侵袭能力、β-catenin的入核及EMT的发生。对C-myc的干扰表达,能部分降低MTA1的表达及CNE-1-LMP2A的侵袭能力。 【结论】 MTA1通过Wnt1通路活化促进了鼻咽癌的转移和EMT发生;LMP2A能激活mTOR和GSK-3β通路,4EBP1-eIF4E axis的活化参与了MTA1 mRNA的稳定性等转录后调控,也参与C-myc对MTA1的转录调控,从而增强鼻咽癌侵袭转移能力并促进EMT发生。     

铜绿假单胞菌中c-di-gmp相关的突变菌株的研究

【立论依据】 作为一种新型而广泛存在的第二信使,环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)调控细菌的运动性、生物膜合成、细菌毒性、细胞周期等多种生理过程;而这些功能均与细菌的致病性及耐药性密切相关。在细菌中,环鸟苷二磷酸的代谢及胞内水平是由两种催化功能相反的酶共同起作用:鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase, DGCs)将两分子GTP转化生成一分子c-di-GMP; 而环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶 (phosphodiesterase,PDEs)则将c-di-GMP分解为pGpG,并最终水解为GMP。鸟苷酸环化酶具有高度保守的GGDEF蛋白结构域, 环鸟苷二磷酸特异的磷酸二酯酶则具有EAL结构域或较为少见的HD-GYP结构域,这些蛋白统称为环鸟苷二磷酸代谢蛋白(c-di-GMP metabolizing proteins)。铜绿假单胞菌模式菌株PAO1中有多达38个含GGDEF及EAL结构域的蛋白;然而,环鸟苷二磷酸是水溶性的小分子化合物;细胞内却存在如此多的担负环鸟苷二磷酸代谢功能的基因,这些具有“重叠性”的基因功能及其相互协调的机制完全不清楚。 【设计思路】 基因突变将导致表型变化,由此将表型与基因型相联系,从而使得对特定基因功能进行分析成为可能。 【实验内容】 本项研究利用细菌表型分析及PCR手段,比较不同的基因在细菌的生物膜合成及泳动性中的作用。 【材料】 以课题组拥有的多个GGDEF及EAL结构域突变的铜绿假单胞菌突变菌株为主要研究对象。 【可行性】 (1)已经拥有多个环鸟苷二磷酸代谢相关的突变菌株,实验材料有所保证;(2)涉及到的实验方法,例如细菌培养及PCR,均较为规范和易于掌握。 【创新性】 本项研究中涉及到的多个基因均未见详细的分析、鉴定;我们将以野生型为对照,在确定基因型的基础上,对突变体菌株的表型进行较为精细的分析、比较,由此为未来进一步的研究工作奠定基础。     

Notch-1与顺铂诱导的胃癌细胞上皮间质转化的关系研究

目的 研究化疗药物顺铂对胃癌细胞侵袭性的影响以及Notch-1及其下游转录因子Snail与胃癌细胞上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT) 的关系.方法 以顺铂作用后的人胃癌细胞MGC-803为研究对象,用MTT比色法、蛋白免疫印迹、半定量聚合酶链反应、细胞划痕实验、流式细胞术分别检测药物作用前后相关指标.结果 顺铂作用后细胞逐渐向间质细胞形态转化,随着药物作用时间延长,胃癌细胞的上皮标记蛋白E-cadherin表达下调,间质标记蛋白vimentin和目的蛋白Notch-1及其下游转录因子Snail表达上调,细胞划痕实验观察发现胃癌细胞迁移能力增强,流式细胞术检测发现药物作用后凋亡率明显增加,S期细胞减少,而G₂期细胞明显增加.结论 化疗药物顺铂对胃癌细胞有着明显的杀伤作用,短期内可诱导胃癌细胞发生EMT、Notch-1以及下游转录因子Snail与胃癌细胞EMT呈正相关.     

微纤维相关蛋白5调控上皮-间质转化相关基因促进膀胱癌细胞迁移和侵袭

目的 探讨微纤维相关蛋白5（MFAP5）在膀胱癌中的表达水平及其对膀胱癌细胞的生物学作用。方法 收集上海交通大学附属第一人民医院确诊的膀胱癌患者手术切除标本,通过免疫组织化学染色检测MFAP5的表达情况。分别从膀胱肿瘤组织和正常膀胱组织分离纯化得到肿瘤相关成纤维细胞（CAF）和正常成纤维细胞（NF）,通过qRT-PCR检测CAF、NF及人膀胱癌细胞系（T24、5637、UMUC3、J82）中MFAP5 mRNA的相对表达量。通过美国癌症基因组图谱（TCGA）数据库及基因表达汇编（GEO）数据库GSE13507数据集中的膀胱癌表达谱数据,分析MFAP5表达与膀胱癌进展和恶性程度的相关性。用重组人MFAP5蛋白处理膀胱癌细胞系T24、5637,检测其对细胞迁移和侵袭能力及迁移相关蛋白表达的影响。结果 MFAP5在膀胱癌组织中主要表达于肿瘤间质,其表达水平与膀胱癌T分期和肿瘤分级有关（P均<0.05）,并且CAF中MFAP5 mRNA相对表达量高于NF、T24、5637、UMUC3、J82细胞（P均<0.01）。TCGA和GSE13507数据库分析结果均显示,高表达MFAP5的膀胱癌患者总生存期短于低表达患者（P均<0.05）。基因集差异分析结果显示MFAP5表达水平随肿瘤恶性程度的升高而升高（P<0.01）,并与上皮-间质转化相关基因钙黏蛋白2、Twist1、基质金属蛋白酶9（MMP9）、E盒结合锌指蛋白1（ZEB1）密切相关（P均<0.01）。重组人MFAP5蛋白刺激能促进T24、5637细胞中包括N-钙黏蛋白、MMP9、ZEB1、Twist在内的上皮-间质转化相关蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,同时增强细胞的迁移和侵袭能力（P均<0.01）。结论 MFAP5可能是预测膀胱癌发生侵袭进展的潜在分子标志物。     

肿瘤间质细胞分泌成纤维生长因子10促进结肠癌细胞侵袭

目的 确定结肠肿瘤间质细胞的旁分泌因子FGF10对肿瘤细胞侵袭的影响。方法 体外分离培养结肠肿瘤间质细胞,ELISA检测其FGF10的表达,并与结肠癌细胞系HCT116和SW480共培养。同时设添加人重组FGF10培养结肠癌细胞系作为试验对照组。Real-time-PCR检测HCT116细胞侵袭相关基因的表达变化。Western blot法检测共培养后结肠癌细胞系中上皮-间质蛋白表达变化。显微镜下计数透过Matrigel包被Transwell膜的细胞数量检测细胞的侵袭能力。结果 结肠肿瘤间质细胞高表达FGF10生长因子。结肠癌细胞系HCT116和SW480与TAFs共培养系统中,HCT116和SW480细胞中Twist、Snail、Slug、ZEB1基因的表达上调,Vimentin蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达下降,侵袭能力较正常培养细胞显著增强。同时添加人重组FGF10培养结肠癌细胞系表现出同样的表型变化。结论 肿瘤微环境中肿瘤相关间质细胞分泌的FGF10能够增强结肠肿瘤细胞的侵袭能力。     

microRNA-372靶向SDC1抑制人胰腺癌上皮间质转化及侵袭

目的 探讨microRNA-372（miR-372）靶向调控SDC1基因表达抑制人胰腺癌上皮间质转化及侵袭的机制研究。方法 收集人胰腺癌及癌旁组织手术标本;qRT-PCR和免疫组化法检测组织中miR-372和SDC1表达;筛选miR-372表达水平最高的人胰腺癌细胞系进行分组和转染,实验分成6组,即空白对照组、阴性对照组、miR-372 mimic组、miR-372 inhibitor组、siRNA-SDC1组和miR-372 inhibitor+siRNA-SDC1组;双荧光素酶报告基因试验验证miR-372和SDC1基因的靶向关系;CCK8法、流式细胞术、划痕试验及Transwell试验分别检测各组细胞转染后增殖能力、凋亡情况、迁移及侵袭能力;qRT-PCR和Western blot法检测各组细胞转染后SDC1和上皮细胞标志物E-cadherin及间质表型细胞标志物Vimentin的表达水平。结果 SDC1蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织（P<0.05）。胰腺癌中miR-372、SDC1表达与肿瘤分化程度、转移和TNM分期显著相关（P<0.05）。双荧光素酶报告基因试验结果显示SDC1是miR-372的靶基因。与空白对照组和阴性对照组比较,miR-372 mimic组和siRNA-SDC1组细胞的生长、迁移和侵袭受到抑制,凋亡率增加,SDC1和Vimentin的表达水平明显降低,E-cadherin的表达水平明显升高（P均<0.05）;而miR-372 inhibitor组的趋势与miR-372 mimic组和siRNA-SDC1相反（P均<0.05）;然而,miR-372 inhibitor+siRNA-SDC1组与空白对照组和阴性对照组比较,各项指标差异均无统计学意义。结论 miR-372可能通过靶向抑制SDC1基因表达,抑制人胰腺癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化。     

MyoD对癌症骨骼肌转移的抑制作用研究

【立论依据】 国内外研究表明:(1)骨骼肌,淋巴管分布广泛,血供丰富,但未有癌症转移到骨骼内生长。(2) MyoD是骨骼肌成肌调节因子,有以下作用:让某些细胞转化为骨骼肌细胞。人工合成高亲和力的MyoD,可与分化抑制因子ID结合,抑制癌细胞增殖。预实验结果显示:骨骼肌细胞因子作用:(1)抑制癌细胞增殖; (2) 使癌细胞的生长形态变为梭状或细长状。 【设计思路】 猜想:MyoD是抑制癌细胞转移到骨骼肌内生长的内源性细胞因子。体外实验:(1)骨骼肌细胞与癌细胞共培养探索骨骼肌细胞对癌细胞的影响。(2)在癌细胞培养基中添加MyoD探索MyoD对癌细胞增殖及迁移能力的影响。(3)构建siRNA靶向沉默MyoD骨骼肌细胞株与癌细胞共培养探索其它细胞因子对癌细胞增殖的影响。体内实验:构建裸鼠肿瘤模型,肿瘤部位注射MyoD MyoD是内源性抑制肿瘤生长的因子。若实验假设不成立,则寻找新的细胞因子,进行新的探索。 【实验内容】 实验组:(1)在癌细胞培养基中添加MyoD。(2)骨骼肌细胞、siRNA靶向沉默骨骼肌细胞与癌细胞共培养24 h。(3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射骨骼肌细胞培养上清液、MyoD。对照组: (1)在癌细胞培养基中添加DMEM。(2)癌细胞与癌细胞共培养24h。 (3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射生理盐水。Brdu测细胞增殖率,流式、WB测蛋白表达,电镜、光学显微镜下观查细胞生长形态以及超微结构,称量体重等观察肿瘤生长。 【材料】 人骨骼肌细胞,人乳腺癌细胞(淋巴转移),人肝癌细胞(血道转移),人鼻咽癌细胞(高转移率),裸鼠。实验采用空隙为0.4 μm的Transwell嵌入式培养板。 【可行性】 本实验理论基础牢靠、前期研究充足,实验设计切合实际。 【创新性】 新思路、新分子,从骨骼肌转移癌低发生率出发,寻找内源性的癌症治疗分子或者靶点。     

CD70在肝细胞癌转移侵袭中作用的研究

【立论依据及设计思路】 CD70属于肿瘤坏死因子超家族成员,为II型跨膜蛋白,与淋巴细胞上CD27结合后发挥作用。其在包括肾癌在内的多种肿瘤中表达异常,与免疫逃离有关。但CD70在肝细胞癌中的表达及其作用目前尚不清楚,本课题组在前期实验中意外地获得了具有很强迁移侵袭能力的肝癌细胞,而在这种细胞中CD70表达显著下降,随后我们又分析了40例巴塞罗那(BCLC)不同分级肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织中CD70的表达,发现肿瘤出现转移后,CD70的表达明显下调,说明肝癌发生转移时CD70的表达确实出现改变。因此本实验旨在研究CD70表达变化与肝癌细胞转移侵袭间的关系,为肝癌病程提供新的潜在的转移标志物. 【实验内容】 (1)选择HepG2、Huh7、Hep3B和BEL-7402不同肝癌细胞系,利用流式细胞分选技术,分选CD70阳性和CD70阴性的细胞进行培养。(2)运用相差显微镜、扫描电镜及透射电镜观察CD70表达情况不同的细胞形态;应用MTT的方法检测不同细胞的细胞活力;利用transwell实验检测不同的细胞迁移和侵袭能力;最后根据实验结果,查询与迁移有关的蛋白质并利用蛋白质印迹的方法进行检测。(3)分别采用裸鼠尾静脉注射观察肺部转移瘤和脾脏注射观察肝转移瘤的方法,评价CD70表达变化与肿瘤转移及注射后裸鼠生存率的关系;通过皮下注射检测不同细胞的成瘤性并保留照片和组织,进行免疫组化以及蛋白检测。(4)选择新鲜人肝癌组织,用流式细胞技术对这些组织进行CD70表达的检测并分选,再将分选好的新鲜人肝癌细胞异体移植到裸鼠体内以检测其细胞特性是否与体外培养的细胞一致。 【材料】 HepG2、Huh7、Hep3B、及BEL-7402细胞系,流式分选仪,CD70的流式抗体BD Pharmingen 555834,BD Pharmingen 555835,裸鼠,新鲜人肝癌组织 【可行性】 前期工作已证实CD70在肝癌细胞转移后表达下调,提示CD70可能参与肝癌的转移;能熟练操作课题中所需的方法;所属实验室为“肝脏保护与再生调节北京市重点实验室”,与北京佑安医院具有合作关系,能获得新鲜人肝癌组织。 【创新性】 首次发现CD70在肝癌转移过程中表达下调,同时本课题首次提出CD70表达下调可能促进肝癌转移。     

MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

致婴幼儿腹泻星状病毒非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制

星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。     

ACTN4对胃癌细胞侵袭转移的影响

目的 研究α-辅肌动蛋白（alpha-actinin-4,ACTN4）在胃癌SGC7901细胞及正常胃黏膜上皮RGM-1细胞中的表达及对胃癌SGC7901细胞侵袭和转移的影响。方法 通过qRT-PCR技术及蛋白印迹技术检测ACTN4在胃癌SGC7901细胞及RGM-1正常胃黏膜上皮细胞中的表达;利用RNAi技术敲低SGC7901细胞中的ACTN4表达,并应用qRT-PCR及蛋白印迹技术检测SGC7901细胞中ACTN4的沉默效果;通过Transwell实验检测细胞侵袭及转移能力的变化。结果 ACTN4在胃癌SGC7901细胞中明显高表达;ACTN4-siRNA可有效敲低SGC7901细胞中ACTN4的表达,敲低ACTN4的表达可以明显降低胃癌SGC7901细胞的侵袭转移能力。结论 ACTN4在胃癌细胞发生侵袭转移中发挥着重要作用。