晚期糖基化终产物诱导内皮细胞通透性增高的机制

【立论依据】 晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可通过[Ca²⁺]通道诱导细胞凋亡,而AGEs是否也能通过该通道诱导内皮细胞通透性增高尚不清楚,若我们能够证实,将对于糖尿病防治及其并发症的控制具有重大指导意义。 【设计思路】 用EGTA抑制外钙内流,研究[Ca²⁺]在AGEs介导的肌动蛋白骨架的改变,通透性的增高以及moesin磷酸化中所起的作用。 【实验内容】 探讨AGEs介导肌动蛋白丝F-actin改变的剂量和时间效应;证实 EGTA对AGEs介导内皮细胞骨架肌动蛋白改变的抑制作用;探讨AGEs引起内皮细胞通透性增高的时间和剂量效应;证实AGEs介导内皮细胞通透性的改变是[Ca²⁺]依赖性的;探讨AGEs引起moesin蛋白磷酸化的时间和剂量效应;验证AGEs引起moesin蛋白磷酸化是[Ca²⁺]依赖性的。 【材料】 激光共聚焦显微镜,跨上皮细胞电阻检测仪,倒置显微镜,垂直电泳仪,Transwell培养皿,低温离心机,Petri Dish培养皿,HUVECS细胞株,胰蛋白酶,Moesin抗体及磷酸化Moesin抗体,罗丹明-鬼笔环肽,胎牛血清,磷酸盐缓冲液,0.5% TritonX-100,4%多聚甲醛固定液,FITC标记的右旋糖干,EGTA标准溶液,细胞裂解液,封闭缓冲液,Tris盐缓冲液,TBST缓冲液,电泳加样缓冲液,Tris溶液。 【可行性】 本项目假设有类似文献支持,有一定的理论基础。本研究团队近年来一直在休克微循环实验室从事AGEs和内皮细胞通透性方面的工作。经过多次试验,已掌握一定的技术手段和研究数据。我们的预实验结果已经显示AGEs刺激脐静脉内皮细胞呈浓度和时间效应,且EGTA能有效地抑制了AGEs在第8小时诱导的通透性的增高。 【创新性】 本研究将首次阐述AGEs是否依赖于[Ca²⁺]导致内皮细胞通透性的增高,目前国内外还未有论文涉及此话题,研究结果将进一步揭示AGEs在糖尿病并发症、动脉粥样硬化相关疾病的机制。     

野西瓜正丁醇萃取物对HepG2细胞线粒体膜电位和［Ca2+］i的影响

目的 研究野西瓜正丁醇萃取物诱导人肝癌细胞 HepG2 细胞凋亡的机制,观察其对 HepG2 线粒体膜电位和细胞内 Ca²⁺ 浓度［Ca²⁺］_i 的影响。方法 经流式细胞仪观察野西瓜正丁醇萃取物对线粒体膜电位的影响;激光共聚焦显微镜检测野西瓜正丁醇萃取物作用前后,HepG2 细胞［Ca²⁺］_i 的变化。结果 野西瓜正丁醇萃取物可不同程度降低 HepG2 细胞线粒体跨膜电位,此外,中、高剂量的野西瓜正丁醇萃取物还可以显著升高［Ca²⁺］_i,造成钙稳态平衡。结论 野西瓜正丁醇萃取物降低线粒体膜电位,开放 MPTP 孔道,造成细胞内 Ca²⁺ 超载,诱导 HepG2 细胞凋亡。     

维生素E经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路抑制oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤

【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。     

Nesfatin-1对帕金森病模型多巴胺能神经元的保护作用及其机制研究

【立论依据】 帕金森病(PD)是一种严重危害中老年人健康的神经退行性疾病,但至今尚无有效的药物或方法能阻止或逆转PD的病情发展。Nesfatin-1是2006年发现的,由82个氨基酸组成的能够抑制摄食的脑肠肽。研究发现nesfatin-1可通过抗凋亡及抗炎机制发挥神经保护作用,但是nesfatin-1能否对多巴胺(DA)能神经元发挥保护作用尚不清楚。本室前期研究证实nesfatin-1能够改变DA能神经元的放电频率,因此,本研究拟在鱼藤酮制备的PD模型上,观察nesfatin-1对DA能神经元的保护作用,并探讨其机制。 【设计思路】 鱼藤酮是一种制备PD模型的环境毒素,是线粒体复合物I的特异性抑制剂,通过损伤线粒体途径导致细胞凋亡。因此本实验拟在鱼藤酮诱导的PD细胞和大鼠模型上,观察nesfatin-1对鱼藤酮诱导的线粒体功能损伤及其介导的细胞凋亡的影响,并进一步研究其分子机制,阐明nesfatin-1可能通过Gs-cAMP-PKA通路影响Bad蛋白的磷酸化水平从而发挥其保护线粒体及抗凋亡的作用。 【实验内容】 在鱼藤酮制备的PD细胞模型上,应用MTT法、流式细胞仪技术、激光共聚焦显微镜等方法,检测nesfatin-1对鱼藤酮所致的细胞存活率、线粒体复合物I的活性、线粒体跨膜电位差、活性氧、PKA蛋白水平、Bad蛋白磷酸化、线粒体细胞色素C的释放、caspase-3活性及细胞凋亡形态学变化的影响。此外,在鱼藤酮制备的PD大鼠模型上,应用免疫组织化学,蛋白质印迹、TUNEL染色等方法进一步研究nesfatin-1对黑质DA能神经元的保护作用。 【材料】 MTT、罗丹明123、H2DCFDA、PKA抗体、磷酸化Bad蛋白抗体、TH抗体(Sigma公司),细胞色素C单克隆抗体(Clontech公司),Caspase-3抗体凋亡试剂盒(BD公司),Hoechst33258(Beyotime公司),TUNEL试剂盒(Roche公司)。 【可行性】 前期研究已证实500 nmol/L鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,细胞存活率降低,线粒体跨膜电位差降低,nesfatin-1预孵育能拮抗鱼藤酮诱发的改变。实验所在学科为国家生理学重点(培育)学科,具备完成实验所需实验技术和设备。 【创新性】 证实nesfatin-1对DA能神经元的损伤具有保护作用,并阐明了介导的细胞信号转导通路和分子机制,为研制新的预防和治疗PD的药物提供一定的实验依据。     

龙葵碱对雄性小鼠睾丸支持细胞毒性的初步研究

目的 初步探讨龙葵碱对睾丸支持细胞的毒性。方法 原代培养睾丸支持细胞,MTT 法检测不同浓度龙葵碱对于支持细胞的毒性作用;激光共聚焦显微镜观察细胞内线粒体膜电位的变化以及［Ca²⁺］_i 的改变。结果 龙葵碱作用于睾丸支持细胞 72 h 的 IC₅₀ 为 22.29 μmol/L。随着剂量的增大,细胞内线粒体膜电位降低,［Ca²⁺］_i 升高。结论 龙葵碱通过损伤小鼠睾丸支持细胞线粒体,升高细胞 ［Ca²⁺］_i,从而对睾丸支持细胞产生毒性作用。     

致婴幼儿腹泻星状病毒非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制

星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。     

羊栖菜多糖SFPS-B1诱导SGC-7901细胞凋亡及对细胞［Ca2+］i和pH值的影响

目的 研究羊栖菜多糖 SFPS-B1 诱导人胃癌细胞 SGC-7901 凋亡作用及对细胞［Ca²⁺］_i 和 pH 值的影响。方法 采用 MTT 法检测 SFPS-B1 对细胞增殖的影响;采用荧光显微镜观察细胞凋亡形态;采用激光共聚焦显微镜观察 SFPS-B1 对 SGC-7901 细胞［Ca²⁺］_i 和 pH 值的影响。结果 SFPS-B1 对 SGC-7901 细胞增殖有抑制作用,可使细胞体积缩小、出现凋亡小体。药物作用后细胞［Ca²⁺］_i 明显上升,pH 值明显降低。结论 SFPS-B1 具有抑制人胃癌 SGC-7901 细胞增殖并诱导凋亡作用,对细胞［Ca²⁺］_i 和 pH 值的影响在其诱导 SGC-7901 细胞凋亡中发挥了作用。     

H-2Kb/OVA257-264复合体的原核表达、折叠、纯化与鉴定

【目的】 目前pMHC复合体(即MHC分子与抗原肽的复合体)常被用来检测特异性T细胞的数量,还是T细胞功能分析、抗原表位验证以及T细胞靶向治疗等诸多方面的有力工具。但是其制备技术复杂,复性、折叠和纯化等步骤受多种因素限制,产出效率较低。国内目前尚无生产厂家,一定程度上限制了我国基础与临床免疫学的更快发展。本实验旨在制备小鼠H-2K^b/OVA_257-264复合体,验证其正确构象和与特异性T细胞TCR有效结合的功能,为在小鼠模型中进行移植排斥和肿瘤的生物治疗研究提供靶向工具。 【方法】 利用IPTG诱导编码小鼠H-2K^b蛋白重链的重组质粒和OVA-β2m 融合蛋白的重组质粒在大肠杆菌BL21中表达;通过超声粉碎、洗涤、化学纯化等方法收集两种重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度和分子大小;再经稀释复性法在体外折叠并超滤浓缩;利用尺寸排阻层析法在FPLC系统中纯化收集H-2K^b/OVA复合体,经BCA法蛋白定量后分装保存;通过包被细胞大小的PLGA微球,用H-2K^b分子构象特异性单抗进行荧光染色,经流式分析验证该复合体的空间构象;利用OVA抗原特异性的OT-1细胞株和流式细胞术分析检测该自制分子与TCR的结合能力。 【结果】 两种重组质粒在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析分子量同预计大小相等;复性、折叠、FPLC系统纯化洗脱后得到3个峰,其中第一个洗脱峰经SDS-PAGE鉴定证实含有重链蛋白和轻链蛋白,为H-2K^b/OVA复合体峰;流式荧光染色分析显示:该复合体包被PLGA后能与构象特异性抗体呈有效结合,提示构象正确;用该分子制备的PE-标记的H-2K^b/OVA四聚体染色OT-1转基因鼠的脾细胞,经流式检测:OT-1细胞占脾细胞群的16.35%。 【结论】 利用大肠杆菌成功表达了小鼠H-2K^b分子的重组重链和轻链,并经体外折叠和纯化成功制备了构象正确、能与特异性TCR结合的H-2K^b/OVA复合体。     

菱角提取物诱导 HL-60 细胞凋亡的机制探讨

目的 探讨菱角提取物对人早幼粒细胞性白血病细胞株 HL-60 细胞增殖和凋亡的影响及凋亡的分子机制。方法 采用 MTT 法检测菱角提取物对 HL-60 细胞的增殖抑制作用;吖啶橙染色和 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体膜电位的变化;比色法测定 Caspase-3、9 蛋白活性。结果 菱角提取物能抑制 HL-60 细胞的增殖,其作用呈明显的时间和剂量依赖性。菱角提取物可诱导 HL-60 细胞凋亡并显示一定的剂量依赖关系。与对照组比较,菱角提取物可明显降低 HL-60 细胞线粒体膜电位,上调 Caspase-3、9 蛋白活性。结论 菱角提取物可抑制 HL-60 细胞的增殖,其机制与降低线粒体膜电位、激活 Caspase-3、9 蛋白继而诱导 HL-60 细胞凋亡有关。     

苯己异硫氰酸酯通过抑制组蛋白去乙酰化和诱导去甲基化来抑制MDS细胞生长

目的 为了探索治疗骨髓增生异常综合征（mylodysplasia syndrome,MDS）新的一类靶向药物,笔者研究了苯己异硫氰酸酯（phenylhexyl isothiocyanate,PHI）,1种合成的萝卜硫素（sulforphate,SFN）衍生物对MDS细胞作用。方法 MDS细胞株SKM-1经过不同浓度PHI处理3个平行孔后使用台盼蓝拒染法测定细胞活力,流式细胞术分析细胞周期相,荧光染料JC-1检测线粒体膜电位改变;甲基化特异性PCR检测去甲基化改变,Western blot法蛋白印迹分析p15基因表达和组蛋白乙酰化程度,以及ELISA法测定细胞培养上清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的含量。结果 经过5μmol/L PHI处理后MDS细胞增殖受到抑制和产生凋亡,在诱导浓度低至10μmol/L细胞增殖减少了50%,和细胞周期分析显示MDS细胞停滞在细胞G₁期,PHI诱导p15基因去甲基化呈现浓度依赖性,进一步证明也以浓度依赖方式PHI诱导组蛋白H3高乙酰化。同时也表明,PHI抑制MDS细胞中VEGF产生,以及通过破坏线粒体膜电位诱导细胞凋亡。结论 PHI可以诱导p15基因去甲基化和组蛋白H3高乙酰化,具有对MDS p15基因去甲基化和组蛋白高乙酰化的双重表观遗传效应,从而启动了靶向途径抑制MDS细胞增殖。     

虾青素对脊髓压迫性损伤脱髓鞘病变的治疗作用及其机制的研究

【立论依据】 在临床上,脊髓压迫性损伤(CSCI)十分常见,但目前尚缺乏有效的治疗方法。在CSCI过程中脊髓血液循环障碍,缺血使细胞内产生大量ROS,自由基同膜脂质不饱和脂肪酸作用致膜脂质过氧化,一方面导致内质网应激,激活内质网caspase12, caspase12在无Cyt-C的参与下激活下游的caspase9和caspase3,级联反应发生;另一方面内质网应激释放大量Ca²⁺,引起胞浆Ca²⁺超载,而大量Ca²⁺从胞浆进入线粒体导致其膜的结构及通透性改变,其结果是Cyt-C的过度释放,进而激活caspase9和caspase3,级联反应发生,引起少突胶质细胞凋亡。研究表明,CSCI中少突胶质细胞(OL)凋亡是诱发脱髓鞘病变的重要原因之一,而脱髓鞘病变是CSCI继发性损伤的重要病理改变之一。因此,如何抑制少突胶质细胞凋亡,是控制CSCI病情发展的关键。虾青素是目前发现的最强的天然抗氧化物质,具有强大的自由基清除和抗凋亡能力,但关于虾青素对CSCI脱髓鞘病变的影响尚未见报道。 【设计思路】 本实验通过自制脊髓压迫器,建立脊髓压迫性损伤大鼠模型,对虾青素抗OL凋亡及其机制进行研究。 【实验内容】 (1)建立CSCI大鼠模型,根据BBB评分法进行神经行为学评定。(2)LFB染色观察脱髓鞘病变,并用神经纤维髓鞘计数法计数。(3)分别利用TUNEL和化学发光法检测OL凋亡数量和自由基含量的变化。(4)利用荧光双标分别检测少突胶质细胞中Cyt-C、caspase-12和caspase-3的表达变化,利用Ca²⁺荧光剂测量细胞内游离Ca²⁺的浓度,激光共聚焦检测线粒体内Ca²⁺的浓度,在分子生物学层面上对CSCI中OL的凋亡机制以及虾青素的作用途径进行研究。 【材料】 雄性SD大鼠,脊髓压迫器,高纯度虾青素等。 【可行性】 (1)本课题组成功研制脊髓压迫器,并取得专利ZL:200520009289X;稳定性高,可靠性强。(2)LFB染色显示虾青素治疗组脱髓鞘病变显著低于CSCI组,初步证明虾青素可明显减轻CSCI后所导致的脱髓鞘病变。 【创新性】 (1)首次将虾青素应用于CSCI的研究和治疗,并取得初步成果;(2)对少突胶质细胞凋亡的内质网途径和线粒体途径进行研究,并把两条途径联系起来。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

泰山银杏外种皮多糖对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

【目的】 探讨泰山银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides,GBEP)对体外培养的食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 【方法】 通过沸水浸提,有机溶剂沉淀,并通过sevage法除去蛋白,获得GBEP。利用MTT法检测不同浓度的GBEP对食管癌细胞EC-9706增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的分布;Annexin-V/PI双染分析凋亡率;蛋白质印迹法检测与细胞周期及细胞凋亡相关的蛋白表达变化。 【结果】 GBEP显著抑制EC-9706细胞的增殖,并呈时间、剂量依赖性。其半数抑制浓度(IC50)为138.9 μg/mL。细胞周期分析结果表明,GBEP处理后G1期细胞比例由52.25%增加至69.76%,蛋白质印迹结果显示细胞周期蛋白D1的表达呈浓度依赖性下降。说明GBEP诱导EC-9706细胞G1期阻滞。流式细胞术分析结果表明,GBEP诱导的EC-9706细胞凋亡随剂量和作用时间增加而增加。同时GBEP抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加促凋亡蛋白Bax的表达,促进caspase3的激活和PARP的剪切。 【结论】 泰山银杏外种皮多糖抑制食管癌细胞的增殖,诱导细胞G1期阻滞,并激活内源性细胞凋亡。     

NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中作用的探讨

【立论依据】 呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关。建立感染RSV的支气管上皮细胞(NHBE)模型,检测NHBE的增值、凋亡情况及NF-κB的转位,阐明NF-κB在感染合胞病毒的人支气管上皮细胞凋亡中的作用,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法和思路。 【设计思路】 建立感染RSV的NHBE模型,检测细胞增值、凋亡情况以及NF-κB是否转位,定性定量地探讨呼吸道合胞病毒(RSV)是否通过诱导NF-κB激活介导人支气管上皮细胞(NHBE)凋亡。 【实验内容】 培养人支气管上皮细胞(NHBE),建立并鉴定RSV感染NHBE的体外细胞模型(用定量RT-PCR法鉴定细胞模型是否成功;设正常组、水相处理组、RSV感染组,MTT比色法检测RSV对NHBE增殖的抑制作用,感染组以不同滴度分为1 000、500、100、50、10 TCID50 5个组,感染12、48、72、96、120 h);用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测RSV诱导体外培养的NHBE的凋亡;以免疫荧光法和蛋白质印迹法检测经RSV处理的人支气管上皮细胞NF-κB的激活和对细胞凋亡的影响。 【材料】 人支气管上皮细胞(NHBE)细胞;RSV A亚型原型株Long株;细胞胞浆胞核蛋白提取试剂盒;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒;兔抗NF-κB抗体;电泳仪。 【可行性】 (1)呼吸道合胞病毒(RSV)易致呼吸道上皮细胞受损凋亡,NF-κB与细胞凋亡密切相关,感染RSV的人支气管上皮细胞模型容易建立成功。(2)本组成员长期跟随老师进行呼吸合胞病毒、流感病毒的研究,具有一定的科研基础和实验能力。(3)所需试剂、仪器、材料,医学基础实验中心基本都有配备,学校同时具备SPF级实验中心。 【创新性】 (1)首次从NF-κB角度探讨感染RSV的NHBE模型,为临床治疗呼吸道疾病提供新的方法思路。(2)分别使用免疫荧光法和蛋白质印迹法定性与定量检测RSV是否通过诱导NF-κB激活介导NHBE凋亡。     

巨噬细胞PPARγ缺陷抑制凋亡细胞吞噬清除致小鼠伤口愈合延迟

【目的】 伤口愈合对损伤组织结构重塑和功能恢复至关重要,巨噬细胞在促进伤口愈合中起重要作用,其功能障碍导致伤口愈合延迟,给患者身心和经济造成沉重负担。但伤口愈合中巨噬细胞功能调控机制目前尚不明确,已知过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)可通过多种机制调控巨噬细胞功能,但在伤口愈合中巨噬细胞是否表达PPARγ、以及可能如何参与伤口愈合过程并不清楚,我们采用巨噬细胞特异PPARγ敲除小鼠进行了研究。 【方法】 Cre-LoxP重组酶系统构建巨噬细胞特异PPARγ缺陷小鼠,建立小鼠皮肤切创模型,组织学技术检测伤口愈合、炎症细胞浸润和分子表达定位, RT-PCR、蛋白质印迹和ELISA法比较相关分子表达高低,流式细胞术检测细胞凋亡和巨噬细胞对凋亡细胞吞噬。 【结果】 伤口愈合过程中巨噬细胞PPARγ表达上调,提示巨噬细胞PPARγ可能影响伤口愈合;巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口愈合延迟,肉芽组织生成、胶原沉积和新生血管减少,并且伤口TNF-α表达显著升高;抗TNF-α抗体(aTNF-α)局部治疗显著改善巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口愈合延迟,提示TNF-α升高是导致伤口延迟愈合重要原因;巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口中,巨噬细胞TNF-α表达显著升高,但体外实验表明PPARγ无直接抑制巨噬细胞分泌TNF-α功能;进一步体外实验表明巨噬细胞PPARγ缺陷导致其在吞噬凋亡细胞过程中TNF-α表达显著增加,并且对凋亡细胞吞噬能力显著下降,同时体内实验发现巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠伤口中巨噬细胞吞噬凋亡细胞功能降低,并且局部凋亡细胞聚集;进一步实验发现巨噬细胞PPARγ缺陷小鼠腹腔和伤口巨噬细胞吞噬相关分子表达显著降低;而采用PPARγ激动剂可促进小鼠伤口愈合、降低伤口凋亡细胞聚集和局部TNF-α水平。 【结论】 巨噬细胞PPARγ可通过促进伤口凋亡细胞吞噬清除,降低局部TNF-α水平,而调控伤口愈合过程。PPARγ激动剂可显著促进伤口愈合,PPARγ可望成为促伤口愈合的重要靶点。     

Hedgehog信号通路介导乳腺癌干细胞药物敏感性的研究

【目的】 研究介导乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)药物抵抗的新机制。 【方法】 通过CCK-8 assay和球囊形成实验检测MCF-7细胞和(或)无血清非粘附悬浮培养得到富集BCSCs 的MCF-7 mammosphere(MCF-7 MS)对紫杉醇和盐霉素反应的差异。通过蛋白质印迹、免疫荧光或免疫组化检测MCF-7和MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中Hedgehog(Hh)通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,及紫杉醇或盐霉素处理后表达的改变。进一步应用CCK-8 assay和球囊形成实验考察Hh通路主要配体Shh或SMO抑制剂环巴明对盐霉素或紫杉醇抑制MCF-7 MS细胞增殖作用的影响。此外,动物水平也考察了MCF-7 MS细胞移植瘤内Hh通路活性与荷瘤鼠药物敏感性的关系。而且,在290例临床乳腺癌病理组织中,以免疫组化检测及卡方检验分析了SMO及Gli1的阳性表达与BCSCs特异标记物CD44⁺/CD24-表达的相关性。 【结果】 MCF-7 MS具有BCSCs的CD44⁺/CD24^-/low表型、高表达干细胞标记物OCT4、强的克隆形成能力、强的侵袭迁移能力、强的在体成瘤能力等干细胞特性。MCF-7 MS对紫杉醇不敏感,而对盐霉素高度敏感,不同于MCF-7细胞对紫杉醇敏感,而对盐霉素不敏感。MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中的Hh通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达均明显高于MCF-7细胞。盐霉素可明显抑制MCF-7 MS细胞中Hh通路这些因子的表达,而紫杉醇未见抑制作用,且盐霉素和紫杉醇均对MCF-7细胞中的这些蛋白的表达无抑制作用。进一步发现了Shh激活或环巴明抑制Hh通路分别下调或上调了MCF-7 MS对盐霉素或紫杉醇的敏感性。而且,在荷瘤鼠水平也发现了可抑制MCF-7 MS荷瘤鼠移植瘤生长的盐霉素也抑制了PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,而对荷瘤鼠移植瘤生长无明显抑制作用的紫杉醇对这些因子的表达也无明显的抑制作用。此外,在临床乳腺癌病理组织中,发现了SMO及Gli1的阳性表达与CD44⁺/CD24^-表达正相关。 【结论】 在细胞、裸鼠移植瘤水平及临床病理组织中,乳腺癌干细胞介导的药物敏感性与Hh通路活性改变相关。     

冬凌草甲素注射剂诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡及其机制研究

目的 研究冬凌草甲素注射剂诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡及与细胞内Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_i）的关系。方法 MTT法检测冬凌草甲素注射剂对SGC-7901细胞的细胞毒活性;倒置显微镜观察冬凌草甲素注射剂对细胞形态学的影响;流式细胞术测定细胞凋亡率;激光共聚焦显微术检测SGC-7901细胞[Ca²⁺]_i的变化;JC-1单染,激光共聚焦显微术检测SGC-7901细胞中线粒体膜电位的变化。结果 冬凌草甲素注射剂对SGC-7901细胞的IC₅₀为21.74 μmol/L;作用48 h后,细胞生长密度变疏,细胞皱缩,其中冬凌草甲素注射剂高浓度组大部分细胞破碎。冬凌草甲素注射剂5.5、11、22 μmol/L作用24 h后SGC-7901细胞凋亡率分别为7.07%、18.57%、22.96%;钙离子荧光强度高于对照组;线粒体膜电位荧光强度显著低于对照组。结论 冬凌草甲素注射剂通过升高SGC-7901细胞[Ca²⁺]_i诱导细胞凋亡。     

莱菔硫烷诱导人肝癌 HepG-2 细胞凋亡的 p38MAPK 途径研究

目的：探讨莱菔硫烷（sulforaphane, SFN）诱导人肝癌 HepG-2 细胞凋亡过程中,p38MAPK 途径的作用。方法：流式细胞仪检测 SFN 对 HepG-2 细胞凋亡率的影响,Western Blotting 方法检测细胞内 p38 及 p-p38 蛋白表达。结果：SFN可明显诱导 HepG-2 细胞凋亡,10、20、40 μmol/L SFN 作用 48 h 后,对 HepG-2 细胞的抑制率分别达到 27.42 %、46.53 %、58.92 %;10、20、40 μmol/L 的 SFN 可上调 HepG-2 细胞内 p-p38 蛋白的表达,而对 p38 的表达无明显影响。结论：SFN 可诱导 HepG-2细胞的凋亡,而且这一过程与阻断 p38MAPK 途径有关。     

去乙酰化修饰调控瘦素诱导乳腺癌细胞增殖的分子机制

【目的】 研究去乙酰化修饰在瘦素(Leptin)诱导的乳腺癌细胞增殖过程中的调控作用。 【方法】 应用MTT法测定Leptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的诱导作用,并测定乳腺癌细胞活力、侵袭力及细胞周期的变化情况;实时定量PCR、蛋白质印迹法测定Leptin诱导后MDA-MB-231细胞周期关键因子及相关酶的表达情况;染色质沉淀法(ChIP)检测Leptin作用MDA-MB-231细胞后核心组蛋白H3、H4乙酰化水平变化情况。 【结果】 Leptin诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖呈现时间和剂量依赖性,1.25 nm (20 mg/mL)、24 h为Leptin最佳作用浓度和孵育时间;经Leptin处理后,乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡明显减少、活力增强,同时由G₁进入S期的细胞显著增多;荧光显微镜观察发现Leptin诱导后BrdU荧光染色增强,且主要集中在MDA-MB-231细胞核内;Transwell小室侵袭实验也显示细胞侵袭力增强;实时定量PCR及蛋白质印迹法检测 发现Leptin处理后的 MDA-MB-231细胞中与G₁/S 期限制点调控相关的细胞周期调控因子CDK2、cyclin E1以及与抑制细胞凋亡有关的Bcl-2均显著增加,细胞中HDAC酶活性增强,且与细胞周期G₁/S 期调控密切相关的HDAC1 mRNA及蛋白表达水平也明显增强;ChIP 实验发现Leptin处理后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中GAPDH 启动子区域核心组蛋白乙酰化水平显著降低,而经HDAC抑制剂SAHA阻断后MDA-MB-231细胞p21WAF 1/CIP 表达水平显著提高。 【结论】 Leptin通过HDAC1的去乙酰化修饰抑制p21WAF 1/CIP的表达,激活细胞周期关键因子CDK 2、cyclin E1的表达,从而加速乳腺癌细胞周期G₁/S 期的进程。     

白藜芦醇诱导人前列腺癌DU145细胞凋亡的作用机制

研究白藜芦醇诱导人前列腺癌DU145细胞凋亡的作用机制。采用MTT检测细胞增殖情况,活性氧试剂盒分析细胞内ROS水平;流式细胞术观察细胞凋亡和细胞周期的变化。Western blot检测凋亡相关蛋白以及相关通路蛋白表达。结果表明,经不同药物浓度处理,白藜芦醇可以诱导DU145细胞发生凋亡,使细胞周期阻滞于G₀/G₁期,提高细胞内ROS水平,降低细胞内线粒体膜电位水平,并呈剂量依赖性。白藜芦醇通过上调Bax蛋白的表达和抑制Bcl-2蛋白表达,促使Bax/Bcl-2比值升高,激活Caspase级联反应从而诱导细胞发生凋亡。进一步研究发现白藜芦醇可以升高细胞内ROS水平,降低线粒体膜电位水平,从而通过线粒体途径诱导DU145细胞发生凋亡。因此,白藜芦醇可能通过ROS-线粒体途径诱导人前列腺癌DU145细胞凋亡。