丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

ALDH1高表达对乳腺癌细胞MCF-7干细胞特性的影响

目的 探讨ALDH1高表达对乳腺癌MCF-7细胞干细胞特性的影响,为乳腺癌的治疗提供理论依据。方法 构建慢病毒ALDH1RNA,转染乳腺癌MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选稳定高表达ALDH1的亚克隆,命名为MCF-ALDH1细胞株。荧光定量PCR和Western blot法检测MCF-ALDH1细胞株及对照细胞中ALDH1在mRNA和蛋白水平的表达;克隆形成实验、悬浮球形成实验及裸鼠成瘤实验检测MCF-ALDH1及对照组细胞的干细胞特性,MTT法测定细胞的耐药性。结果 与MCF-7组细胞比较,MCF-ALDH1细胞株的ALDH1在mRNA和蛋白表达量明显升高;MCF-ALDH1细胞克隆形成数目为128±22个,高于MCF-ALDH1细胞球克隆形成数（46±15个）;悬浮成球实验,MCF-ALDH1细胞悬浮成球数目明显增多（16±2个）,高于对照细胞悬浮球数（8.0±1.5个）;肿瘤细胞在裸鼠皮下接种后,MCF-7细胞组有3只裸鼠成瘤,MCF-ALDH1有5只成瘤,瘤体积明显大于MCF-7组,差异有统计学意义（P<0.05）。耐药实验显示,MCF-ALDH1对顺铂、紫杉醇的耐药性明显提高。结论 高表达ALDH1的乳腺癌MCF-7细胞干细胞特性增强,ALDH1可能成为乳腺癌治疗的靶点之一。     

龙葵碱对乳腺癌MCF-7细胞微管系统的影响

目的 研究龙葵碱对乳腺癌MCF-7细胞微管系统的影响。方法 MTT法检测龙葵碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪分析龙葵碱对MCF-7细胞周期的影响以及细胞内α-微管蛋白及微管相关蛋白（MAP-2）的变化。结果 龙葵碱对MCF-7细胞的IC₅₀为22.08 μg/mL,能够将MCF-7细胞阻滞于S期;能够增加MCF-7细胞内α-微管蛋白和MAP-2的量。结论 龙葵碱通过升高MCF-7细胞内的微管蛋白及MAP-2的表达,将MCF-7细胞阻滞于S期,从而抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长。     

HBCD对HepG2的遗传毒性、氧化应激机制及水葫芦提取物黄酮的保护作用

【立论依据】 六溴环十二烷(hexabromocyclododecane,HBCD)是一种世界广泛应用的新型溴代阻燃剂,因其热稳定性较差,分解温度低,易扩散到环境中,现已成为环境中广泛存在的污染物,会对人体产生极大的危害。在人体脂肪、血清、母乳甚至儿童体内均可检测到HBCD,会对人体产生严重危害,如导致血清甲状腺激素浓度下降、抑制神经和卵子的发育、肝组织病理学改变、免疫功能改变,并具有致畸潜力。水葫芦(Eichhornia crassipes)全世界公认为“十大害草”之一。我国每年由水葫芦造成的直接经济损失接近100亿元。文献表明水葫芦中含有较丰富的黄酮类物质。天然植物中的黄酮类化合物属于多酚类物质,具有生物抗氧化性、抗衰老、抗癌、镇痛、抗炎等功能。我们研究HBCD对HepG2的遗传毒性及其氧化应激机制,并在此基础上提取水葫芦黄酮研究其保护作用具有极其重要的意义。 【设计思路】 通过微核实验和单细胞凝胶电泳分别检测HBCD对HepG2细胞的染色体和DNA损伤,检测染毒后细胞内ROS和GSH的情况阐明遗传毒性机制,在此基础上提取水葫芦黄酮研究其抗活性氧以保护HepG2细胞的作用。 【实验内容】 本项目采用MTT检测HBCD对细胞的毒性效应,通过微核试验和单细胞凝胶电泳评价HBCD的遗传毒性,以测定ROS和GSH探讨HBCD对HepG2遗传毒性。采用超声波法提取水葫芦中黄酮类物质干预HBCD对HepG2的遗传毒性。 【材料】 HBCD、HepG2细胞、水葫芦、MTT细胞毒性检测试剂盒、Giemsa燃料、单细胞凝胶电泳实验相关试剂、S0053-GSH和GSSG检测试剂盒、S0033活性氧检测试剂盒试剂盒。 【可行性】 (1)HepG2 细胞存在生物转化过程中Ⅰ和Ⅱ相酶,已成为评价化合物遗传毒性的有力工具。(2)项目成员均已参加由指导教师主持的多项课题,掌握了多项基本技能,保证课题的顺利进行。(3)本实验委托大学生创新性实验室完成,具备相关仪器设备。 【创新性】 研究了HBCD对生物体遗传毒性及其机制;研究了水葫芦活性提取物黄酮对HBCD遗传毒性的保护作用。     

Hedgehog信号通路介导乳腺癌干细胞药物敏感性的研究

【目的】 研究介导乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)药物抵抗的新机制。 【方法】 通过CCK-8 assay和球囊形成实验检测MCF-7细胞和(或)无血清非粘附悬浮培养得到富集BCSCs 的MCF-7 mammosphere(MCF-7 MS)对紫杉醇和盐霉素反应的差异。通过蛋白质印迹、免疫荧光或免疫组化检测MCF-7和MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中Hedgehog(Hh)通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,及紫杉醇或盐霉素处理后表达的改变。进一步应用CCK-8 assay和球囊形成实验考察Hh通路主要配体Shh或SMO抑制剂环巴明对盐霉素或紫杉醇抑制MCF-7 MS细胞增殖作用的影响。此外,动物水平也考察了MCF-7 MS细胞移植瘤内Hh通路活性与荷瘤鼠药物敏感性的关系。而且,在290例临床乳腺癌病理组织中,以免疫组化检测及卡方检验分析了SMO及Gli1的阳性表达与BCSCs特异标记物CD44⁺/CD24-表达的相关性。 【结果】 MCF-7 MS具有BCSCs的CD44⁺/CD24^-/low表型、高表达干细胞标记物OCT4、强的克隆形成能力、强的侵袭迁移能力、强的在体成瘤能力等干细胞特性。MCF-7 MS对紫杉醇不敏感,而对盐霉素高度敏感,不同于MCF-7细胞对紫杉醇敏感,而对盐霉素不敏感。MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中的Hh通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达均明显高于MCF-7细胞。盐霉素可明显抑制MCF-7 MS细胞中Hh通路这些因子的表达,而紫杉醇未见抑制作用,且盐霉素和紫杉醇均对MCF-7细胞中的这些蛋白的表达无抑制作用。进一步发现了Shh激活或环巴明抑制Hh通路分别下调或上调了MCF-7 MS对盐霉素或紫杉醇的敏感性。而且,在荷瘤鼠水平也发现了可抑制MCF-7 MS荷瘤鼠移植瘤生长的盐霉素也抑制了PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,而对荷瘤鼠移植瘤生长无明显抑制作用的紫杉醇对这些因子的表达也无明显的抑制作用。此外,在临床乳腺癌病理组织中,发现了SMO及Gli1的阳性表达与CD44⁺/CD24^-表达正相关。 【结论】 在细胞、裸鼠移植瘤水平及临床病理组织中,乳腺癌干细胞介导的药物敏感性与Hh通路活性改变相关。     

D5 Stat5a对人类乳腺癌细胞钙粘蛋白表达的影响

【立论依据及设计思路】 Delta5 STAT5a是谭敦勇教授运用基因克隆等技术发现人类转录因子“STAT5a”的一种信使RNA剪切后的变体。大量前期工作证实D5 Stat5a在人类乳腺癌组织有异常表达,经腺病毒介导将D5 Stat5a cDNA转入培养的人乳腺癌细胞后,能显著促进癌细胞的增值与去分化。提示D5 Stat5a在乳腺癌的发生、发展及预后中,具有重要的病理学意义。E-cadherin位于上皮组织,是细胞与细胞之间相互连接的主要分子。在人的许多恶性肿瘤中E-cadherin表达减少或缺失与肿瘤发展,侵袭和转移密切相关,体外试验明确的证实了在培养状态下表达E-cadherin分子的肿瘤不侵入其附着的基质,但如果使E-cadherin表达缺失,肿瘤细胞获得侵袭能力。将E-cadherin的 cDNA 转染肿瘤细胞使其表达E-cadherin分子后,肿瘤丧失其侵袭能力。我们推测D5 Stat5a对癌细胞转移特性的影响与其调节E-cadherin等基因的表达有关。本课题拟通过采用腺病毒介导的基因转移技术转染人乳腺癌细胞,检测转染后E-cadherin表达的变化,以了解D5 Stat5a对人乳腺癌细胞E-cadherin的表达是否具有调节作用。 【实验内容】 培养乳腺癌细胞(MCF-7),分为空白组、阴性对照组和实验组。用腺病毒(Adv-D5)转染实验组乳腺癌细胞,同法构建不针对任何基因的阴性对照腺病毒。采用qRT-PCR、蛋白质印迹和细胞免疫荧光方法检测D5 Stat5a转染后E-cadherin在mRNA水平和蛋白水平的表达,将所得数据进行统计学处理并分析。 【材料】 D5 Stat5a和细胞系,RPMI 1640培养液10%胎牛血清,1%青链霉素,腺病毒(Adv-D5),Trizol试剂,E-cadherin的引物,PCR仪,逆转录反应试剂盒,36℃水浴箱,低速离心机,CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 E-cadherin是一类介导细胞间质同质粘附的钙依耐性跨膜糖蛋白,其下调可降低一个组织内细胞黏附的强度,导致细胞活动性增加。大量研究表明癌细胞中E-cadherin表达下调或异常表达。D5 stat5a可能是通过调控E-cadherin的表达来影响癌细胞的转移,实验的进展具有可预见性。 【创新性】 D5 stat5a作为一种刚被研究出来的STAT5a的基因变体,目前关于这种基因与E-cadherin在乳腺癌中的关系研究尚少,通过对比MCF-7与Adv-D5转染后MCF-7中E-cadherin的表达情况,探讨D5 stat5a对E-cadherin的影响,为D5 stat5a在乳腺癌的治疗中提供理论依据。     

槲皮素烃基化衍生物的合成及其促MCF-7细胞凋亡作用的研究

【目的】 槲皮素具有一定的抗肿瘤活性并且毒性较低,具有良好的应用前景,但因溶解性差,不易吸收,影响了其开发和利用。本研究以槲皮素为原料,合成一系列烃基化衍生物,并考察这些衍生物对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及可能的机制。 【方法】 将槲皮素进行乙酰化保护,在乙腈中以不同试剂烃基化,产物经重结晶和柱层析法纯化,以MS、¹HNMR、¹³CNMR、NOESY进行产物分子量测定及结构表征。测定各产物在DMEM培养基中的溶解度,选取溶解度较好的产物,以MTT法测定其对MCF-7 细胞增殖率的影响,以HPLC法测定其在MCF-7细胞中浓度随时间的变化。选取IC50较小的产物,分别以AV-PI双染-流式细胞术、DAPI染色、DNA片段化分析考察其对MCF-7细胞的促凋亡作用。分别经DCFH-DA染色和JC-1染色测定衍生物对MCF-7细胞中ROS生成量及线粒体膜电位的影响,MTT法测定ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸及广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对衍生物促凋亡作用的影响,以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白在MCF-7细胞中的表达。 【结果】 对槲皮素烃基化得到了7种衍生物,其中,7-O-丁基槲皮素(BQ)和 7-O-香叶基槲皮素(GQ)在DMEM中的溶解度均大于100 μmol/L,对MCF-7细胞的IC50分别为(22.6±2.2) μmol/L、(43.5±2.1) μmol/L。BQ及GQ在MCF-7细胞中的蓄积浓度比高于槲皮素数倍,且在细胞中停留的时间更长,对MCF-7的促凋亡作用明显强于槲皮素。作用机制研究表明,BQ及GQ对MCF-7细胞的促凋亡作用是由AIF及Endonuclease G引起的caspase非依赖性凋亡导致的。 【结论】 以槲皮素为原料获得的烃基化衍生物BQ和GQ显示出较好的溶解性和对MCF-7细胞的促凋亡活性,为槲皮素衍生物的研究开发奠定了基础。     

mTOR高选择性抑制剂AZD8055对乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株化疗敏感度的作用

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）高选择性抑制剂AZD8055对乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株化疗敏感度的作用。方法 体外培养MCF-7细胞株、MCF-7/Doc细胞株。噻唑蓝比色法检测AZD8055作用后MCF-7/Doc细胞对多西紫杉醇的半数抑制浓度（IC₅₀）,实验分2组：MCF-7/Doc组和MCF-7/Doc+AZD8055组。实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测AZD8055作用后,细胞MDR1基因和P-gp蛋白的表达,实验分4组：MCF-7组、MCF-7+AZD8055组、MCF-7/Doc组、MCF-7/Doc+AZD8055组。裸鼠体内荷瘤实验检测AZD8055的体内抑瘤率,实验分3组：空白对照组、阴性对照组和AZD8055组。为排除MCF-7和MCF-7/Doc细胞特异性对实验结果的影响,研究采用乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-231/Doc细胞株重复了上述实验。结果 噻唑蓝比色法检测显示,MCF-7/Doc+AZD8055组细胞对多西紫杉醇的IC₅₀为5.1±0.6μmol/L,明显低于MCF-7/Doc组（P<0.05）,AZD8055对多西紫杉醇的耐药逆转倍速为5.4。实时荧光定量PCR检测显示,MCF-7/Doc组细胞MDR1基因表达量为1.84±0.35,明显高于MCF-7组（P<0.05）;而MCF-7/Doc+AZD8055组细胞MDR1基因表达量为1.21±0.29,明显低于MCF-7/Doc组（P<0.05）。蛋白印迹法检测显示,MCF-7/Doc组细胞P-gp蛋白表达量分别为0.93±0.15,明显高于MCF-7组（P<0.05）;而MCF-7/Doc+AZD8055组细胞P-gp蛋白表达量0.54±0.10,明显低于MCF-7/Doc组（P<0.05）。AZD8055组肿瘤生长速度明显低于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）,AZD8055对移植瘤具有显著的抑制作用,抑瘤率为48.95%,差异有统计学意义（P<0.05）。MDA-MB-231和MDA-MB-231/Doc细胞株重复实验得到了相似结果。结论 mTOR高选择性抑制剂AZD8055可显著提高乳腺癌细胞株对多西紫杉醇的化疗敏感度,其作用机制可能与抑制MDR1和P-gp表达有关。     

miR-145对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药逆转的作用机制研究

目的:探讨miR-145对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR阿霉素耐药的影响及可能的作用机制。方法:采用实时定量PCR方法检测miR-145在乳腺癌细胞株MCF-7及MCF-7/ADR中的表达差异;脂质体转染法将构建好的miR-145 mimics,miR-145inhibitor成功转染进MCF-7/ADR细胞中,MTT法检测转染后MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性,流式细胞仪检测耐药细胞对阿霉素诱导凋亡的影响,Western blot检测转染前后抗凋亡蛋白Bcl-2、多药耐药基因MDR1表达蛋白P-gp的表达差异。结果:miR-145在人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中表达下降;上调miR-145可以增强MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性,显著抑制MCF-7/ADR细胞增殖,并促进阿霉素诱导的细胞凋亡,同时显著抑制了耐药细胞中Bcl-2和P-gp的表达。结论:miR-145通过抑制Bcl-2和P-gp蛋白的表达来增加MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性和凋亡。     

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的探讨中期因子（midkine,MK）基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA—MB-231、MDA—MB-435、MDA—MB-468及ZR75—1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达最高者。采用MK siRNA转染乳腺癌细胞株,分别以荧光实时定量RT—PCR和免疫荧光方法观察MK基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝（MTT）比色法检测细胞粘附性,以Boyden小室方法检测癌细胞侵袭能力。结果7株乳腺癌细胞中,MK均有不同程度的表达,以MCF-7细胞最高;以MKsiRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞MK基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;siRNA转染组细胞粘附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降,均呈浓度依赖性（P〈0．01;P〈0．01）。结论MK基因在乳腺癌细胞粘附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞粘附和侵袭能力。     

SIRT3对乳腺癌干细胞衰老影响及机制的研究

【立论依据及设计思路】 乳腺癌干细胞是一类具有较强自我更新能力与分化潜能的癌细胞,在肿瘤形成和复发中起重要作用。衰老是细胞、机体成熟后,随年龄增加,自身结构组分逐步退变、趋向死亡的现象。促进乳腺癌干细胞衰老,可抑制其增殖分化。SIRT3是组蛋白去乙酰化酶之一,可调控干细胞衰老相关基因的表达。有研究显示,SIRT3在乳腺癌干细胞中高表达,但其对乳腺癌干细胞衰老的影响及机制未明。我们猜测SIRT3可通过增强ROS清除酶活性,抑制ROS的蓄积,从而阻碍乳腺癌干细胞衰老。本研究拟在乳腺癌干细胞中沉默、过表达SIRT3,探究SIRT3对乳腺癌干细胞衰老的作用,并利用免疫共沉淀等技术,阐明其中机制。 【实验内容】 (1)体外实验:构建过表达、沉默SIRT3的乳腺癌干细胞稳定细胞系,检测ROS及相关基因的表达量,同时检测细胞衰老状态,利用免疫共沉淀及质谱技术研究其机制;(2)体内实验:过表达、沉默SIRT3的乳腺癌干细胞稳定细胞系体内成瘤,获得成瘤实验标本,检测ROS及相关基因的表达量、细胞衰老状态;(3)临床研究:获取临床乳腺癌样本,研究SIRT3表达量与乳腺癌干细胞数量、乳腺癌患者生存率及生存时间的相关性。 【材料】 临床乳腺癌组织标本、Balb/c裸鼠、乳腺癌细胞系MCF7等。 【可行性】 已有研究证实SIRT3可调控干细胞衰老相关基因;现有研究提示,SIRT3在乳腺癌干细胞中高表达;本小组及所在实验室长期致力于肿瘤干细胞研究,具备相关经验、技术、设备,所以本研究从理论、人员、实验技术、实验条件上都是可行的。 【创新性】 从SIRT3的角度探究乳腺癌干细胞的衰老机制,成果可为防治乳腺癌提供新靶点。     

黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞增殖周期以及细胞凋亡、迁移影响的实验研究

目的 探讨黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期、凋亡及迁移的影响。方法 通过MTT法观察药物处理后对乳腺癌MCF-7细胞的生长增殖情况的影响;通过流式细胞术检测黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞增殖周期、凋亡的影响;利用划痕实验检测黄芪注射液对乳腺癌MCF-7细胞的迁移的影响。结果 MTT结果发现,不同浓度的黄芪注射液（100、200、400、600、800mg/ml）对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有不同程度的抑制作用;流式细胞术结果显示,与空白对照组相比,200和400mg/ml黄芪注射液均能导致G₁期增加,且两个浓度的凋亡率都大于空白对照组;划痕实验结果显示200和400mg/ml黄芪注射液组较空白对照组划痕愈合率低。结论 不同浓度的黄芪注射液在体外对乳腺癌MCF-7细胞增殖具有一定的抑制作用;同时可将细胞增殖周期阻滞在G₁期,促进MCF-7细胞凋亡;一定浓度的黄芪注射液对MCF-7细胞的迁移具有抑制作用,为乳腺癌的临床应用提供实验基础。     

pCMV6-Entryp62真核表达质粒构建及高表达稳定细胞系的建立

【目的】构建pCMV6-Entryp62真核表达质粒,并将其转染至人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过抗生素筛选构建高表达p62的稳定细胞系。【方法】以293ET细胞cDNA为模板,设计引物扩增p62基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及pCMV6-Entry Vector空载体,将酶切后的片段进行连接,转化构建质粒,酶切及测序验证;将构建好的质粒转染入MCF-7细胞株中,G418筛选稳定表达细胞株,并用实时定量PCR和Western blotting进行验证。【结果】酶切及测序结果证实成功构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒;实时定量PCR结果显示,与对照组相比,转染p62的MCF-7稳定细胞中p62mRNA的表达显著升高;Western blotting检测Flag及p62蛋白表达显示,在转染p62的MCF-7稳定细胞检在62kd位置测到Flag阳性条带,对照组则没有阳性条带。在转染p62的MCF-7稳定细胞中p62蛋白的表达较对照组显著升高。【结论】成功构建了pCMV6-Entryp62真核表达质粒,并成功建立高表达p62的MCF-7稳定细胞系。     

谷胱甘肽过氧化物酶4介导的铁死亡参与阿霉素对乳腺癌细胞抑制作用研究

目的:探讨谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)介导的铁死亡是否参与阿霉素对乳腺癌的抑制过程,并探讨其增加阿霉素敏感性的可能机制。方法:通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)实验和免疫蛋白印迹法(Western Blot),检测正常乳腺细胞MCF10A、HCC1937细胞和乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231细胞中GPX4的表达水平;通过慢病毒转染技术构建稳定敲低GPX4的乳腺癌细胞MCF-7,并通过qRT-PCR和Western Blot实验检测敲低效率;通过CCK8实验检测阿霉素对乳腺癌细胞的细胞毒性;通过谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、铁离子(Fe²⁺)浓度检测试剂盒检测敲低GPX4后乳腺癌细胞的铁死亡水平。结果:乳腺癌细胞中GPX4的蛋白水平及mRNA水平高于正常乳腺细胞(P<0.05);与对照组细胞相比,敲低GPX4表达的乳腺癌细胞中GSH水平降低(P<0.05),MDA和Fe²⁺水平升高(P<0.05),阿霉素作用后细胞增殖能力下降(P<0.05),而铁死亡抑制剂fe...     

毛酸浆内酯诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的机制研究

[目的] 探讨毛酸浆活性成分毛酸浆内酯（PPB）诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的机制。[方法] 采用噻唑蓝法（MTT法）检测PPB对MCF-7细胞及人外周血单核细胞（hPBMC）增殖的影响;克隆形成实验考察PPB对MCF-7细胞克隆形成的影响;MTT法考察泛半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）抑制剂Z-VAD-fmk对PPB诱导MCF-7细胞死亡的作用;Western Blot法考察PPB处理后凋亡相关蛋白PARP、Caspase-7/8/9、Cytochrome c、Bax、Bcl-2、Fas及FADD的表达水平。[结果] PPB时间、剂量依赖性抑制MCF-7细胞生长,且对hPBMC无明显细胞毒性;PPB呈剂量依赖性地抑制MCF-7细胞克隆形成;PPB处理后,凋亡特征性蛋白PARP、原型Caspase-7蛋白表达量显著减少,而Cleaved PARP、Cleaved Caspase-7显著增加;同时内源性凋亡途径相关蛋白Bax、Cleaved Caspase-9、Cytochrome c表达量显著上调,而Bcl-2及Caspase-9原型形式显著下调。外源性凋亡相关蛋白Fas、Cleaved Caspase-8及FADD表达量上调,而Caspase-8原型形式显著下调;加入Z-VAD-fmk可显著逆转PPB诱导的MCF-7细胞死亡。[结论] 毛酸浆活性成分PPB可以诱导MCF-7细胞发生内源性和外源性凋亡。     

新型氟康唑类似物合成及抗真菌活性研究

【目的】 槲皮素具有一定的抗肿瘤活性并且毒性较低,具有良好的应用前景,但因溶解性差,不易吸收,影响了其开发和利用。本研究以槲皮素为原料,合成一系列烃基化衍生物,并考察这些衍生物对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及可能的机制。 【方法】 将槲皮素进行乙酰化保护,在乙腈中以不同试剂烃基化,产物经重结晶和柱层析法纯化,以MS、¹HNMR、¹³CNMR、NOESY进行产物分子量测定及结构表征。测定各产物在DMEM培养基中的溶解度,选取溶解度较好的产物,以MTT法测定其对MCF-7 细胞增殖率的影响,以HPLC法测定其在MCF-7细胞中浓度随时间的变化。选取IC50较小的产物,分别以AV-PI双染-流式细胞术、DAPI染色、DNA片段化分析考察其对MCF-7细胞的促凋亡作用。分别经DCFH-DA染色和JC-1染色测定衍生物对MCF-7细胞中ROS生成量及线粒体膜电位的影响,MTT法测定ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸及广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对衍生物促凋亡作用的影响,以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白在MCF-7细胞中的表达。 【结果】 对槲皮素烃基化得到了7种衍生物,其中,7-O-丁基槲皮素(BQ)和 7-O-香叶基槲皮素(GQ)在DMEM中的溶解度均大于100 μmol/L,对MCF-7细胞的IC50分别为(22.6±2.2) μmol/L、(43.5±2.1) μmol/L。BQ及GQ在MCF-7细胞中的蓄积浓度比高于槲皮素数倍,且在细胞中停留的时间更长,对MCF-7的促凋亡作用明显强于槲皮素。作用机制研究表明,BQ及GQ对MCF-7细胞的促凋亡作用是由AIF及Endonuclease G引起的caspase非依赖性凋亡导致的。 【结论】 以槲皮素为原料获得的烃基化衍生物BQ和GQ显示出较好的溶解性和对MCF-7细胞的促凋亡活性,为槲皮素衍生物的研究开发奠定了基础。     

维生素E经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路抑制oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤

【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。     

全长及细胞内磷酸化位点缺失的人组织因子真核表达重组质粒的构建及其生物学功能

目的： 研究组织因子(tissue factor,TF)细胞内区域的功能,分析TF细胞内区域对人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的影响。方法： Trizol一步法抽提人乳腺癌细胞MDA-MB-231总RNA,RT-PCR扩增TF全长(TF full-length)基因和TF细胞内磷酸化位点缺失(TF truncated)基因,分别克隆入pGEM-T载体,再构建人TF full-length基因和TF truncated基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated。将构建好的pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated瞬时转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达,并用发色底物法检测瞬时转染后TF的促凝血功能。利用Transwell小室检测转入人TF full-length基因和TF truncated基因后MCF-7细胞的迁移能力。结果： 扩增出人TF full-length基因和TF truncated基因,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),并且在MCF-7细胞中表达后具有促凝血活性。瞬时转染pcDNA3.1(+)-TF truncated不能增加MCF-7 细胞的迁移能力,而转染 pcDNA3.1(+)-TF full-length后可以显著增强MCF-7细胞的迁移能力。结论： 成功构建了带有人TF full-length,TF truncated基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated,为研究TF以及其细胞内磷酸化位点区域在肿瘤学中的作用奠定了基础。     

藻红蛋白诱导人乳腺癌 MCF-7 细胞衰老研究

目的：研究藻红蛋白对人乳腺癌 MCF-7 细胞的诱导衰老作用。方法：采用 MTT 法检测藻红蛋白对 MCF-7 细胞的生长抑制作用,采用倒置显微镜观察形态学变化,酸性 β-半乳糖苷酶染色法和衰老相关异染色质聚集检测藻红蛋白诱导人乳腺癌 MCF-7 细胞衰老作用。结果：MTT 法结果显示,藻红蛋白对体外培养的人乳腺癌细胞 MCF-7 具有明显的生长抑制作用,IC₅₀ 为 134.87 μg/mL。结果发现藻红蛋白作用 72 h 后,细胞呈现变大变扁平,细胞内形成空泡、颗粒增多等明显衰老形态。在倒置显微镜下观察,酸性 β-半乳糖苷酶染色呈阳性;在荧光显微镜下观察,DAPI 染色出现衰老相关异染色质聚集现象。结论：藻红蛋白可通过诱导 MCF-7 细胞衰老达到抗肿瘤作用。     

三氧化二砷对人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/BCRP的细胞毒作用

【目的】探讨三氧化二砷(As2O3)对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/BCRP的毒性作用及其作用机制。【方法】MTT法和台月分蓝拒染实验检测As2O3对MCF-7/BCRP细胞的毒性作用;氚-嘧啶核苷掺入法检测As2O3对MCF-7/BCRP细胞的增殖抑制;流式细胞术测定As2O3对MCF-7/BCRP细胞周期和凋亡的影响。【结果】As2O3可显著抑制MCF-7/BCRP细胞生长,呈剂量效应关系(r=0.977,P<0.05),IC50为4.06μmol/L;As2O3可直接诱导细胞死亡,抑制细胞增殖,并使细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡。【结论】As2O3对MCF-7/BCRP细胞有显著的毒性作用,可直接引起细胞死亡。