MAPK和PI3K信号通路在胃癌中的作用及意义

【目的】 已有研究表明MAPK和PI3K信号途径是两条重要的抑制凋亡和促进增殖的转导通路,与癌症的发生发展关系密切,本实验通过检测在Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB在胃癌及癌旁组织的表达,探讨MAPK和PI3K信号通路在胃癌发展过程中的作用及意义。 【方法】 收集50对胃癌组织及其相应的癌旁组织,应用免疫组织化学技术检测胃癌及癌旁组织中Akt、Erk、Bcl-2和NF-κB蛋白的表达情况并进行分析。 【结果】 胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因突变的累积过程。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路是细胞内两条重要的促增殖和抗凋亡通路。PI3K-Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)处于中心环节,活化的Akt可激活下游信号分子,包括抑制凋亡的Bcl-2蛋白和转录因子NF-κB。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与基因表达调控,细胞功能活动以及个各种生理病理过程。胞外信号调节激酶(ERK1/2)是哺乳动物中5条并行的MAPK信号通路之一,通过激活下游靶位,包括重要的转录因子NF-κB和细胞存活调节器Bcl-2,调控基因表达,从而发挥抑制凋亡的作用。本研究结果显示人胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,说明上调PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的活性与胃癌的发生发展过程密切相关。     

HIF-1α信号通路相关分子在胃癌中的表达及其对细胞增殖与侵袭的影响研究

【立论依据】 缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)是参与低氧环境中细胞适应性调节的关键转录因子,通过结合于靶基因上游转录调节区的低氧反应原件调控多种分子的表达。HIF-1α的异常增高参与了多种癌症的发生发展,课题组前期研究揭示了胃癌组织中存在着HIF-1α的高表达现象,但是HIF-1α的异常表达通过哪些下游靶基因及信号通路来实现对胃癌细胞的增殖、侵袭的调控尚不清晰。因此,高通量筛选及验证HIF-1α下游靶基因,构建HIF-1α信号网络并进行功能分析,为深入理解以HIF-1α为核心的信号通路相关分子对胃癌细胞增殖与侵袭的影响奠定重要理论基础,同时也为阐明胃癌发生、发展机理,寻找胃癌早期诊断和治疗的靶标提供科学依据。 【设计思路】 本设计旨在前期研究基础上,检测胃癌细胞中HIF-1α的表达变化,结合转录组学及数据库信息绘制与细胞增殖及侵袭相关的HIF-1α调控网络图;利用RNAi技术沉默HIF-1α,检测其靶基因的表达,探讨转染后对肿瘤细胞增殖及侵袭的影响。 【实验内容】 (1)结合转录组及数据库信息,初步构建胃癌中HIF-1α调控网络,RT-qPCR及蛋白质印迹对HIF-1α及靶基因进行验证;(2)siRNA技术对胃癌细胞HIF-1α进行敲除,RT-qPCR、蛋白质印迹检测敲除后HIF-1α 及其靶基因表达;(3)MTT及transwell实验检测有效基因敲除后胃癌细胞株的增殖能力及侵袭性变化。 【材料】 (1)胃癌细胞株SGC-7901,细胞转染相关材料及试剂,HIF-1α及其靶基因引物、抗体,逆转录及实时定量PCR试剂,蛋白质印迹相关试剂。(2)转录组学信息,TRED数据库,cytoscape做图软件等计算机工具。 【可行性】 课题组前期利用外显子芯片、RT-qPCR及蛋白质印迹法证实HIF-1α在胃癌组织中呈高表达,并且结合TRED数据库及胃癌基因表达谱筛选出胃癌中HIF-1α可能的靶基因。以上工作为进一步探索HIF-1α作用的下游靶基因及其对胃癌细胞增殖及侵袭性的影响及机制研究提供了思路及实验基础。此外,项目组具有完成信号调控网络研究的硬件设施及研究基础,为项目的顺利实施奠定基础。 【创新性】 将高通量组学、生物学实验及计算生物学技术紧密联合,探讨HIF-1α信号通路对胃癌细胞增殖及侵袭性的影响及可能的机制。     

胃癌细胞中VD3对NF-κB通路的影响机制及与萜类化合物协同作用探究

【立论依据】 NF-κB信号转导途径在调节细胞增殖、分化、凋亡中起到重要作用; IκB-α是调节NF-κB信号转导途径的核心蛋白;VD₃可以通过影响IκB-α、转录因子等方式抑制NF-κB信号转导途径的激活;萜类化合物是目前医药研究中很有前景的化疗药物,NF-κB的抑制可以增强其抗肿瘤效应。 【设计思路】 选取低分化、中分化胃癌细胞与正常胃组织细胞,给予其不同VD₃作用环境(时间、浓度),从mRNA、蛋白水平上测定NF-κB途径的表达活性。通过阻断VD₃和IKKβ的相互作用,研究VD₃调控IκB-α含量的主导因素。协同施用二萜类化合物--紫杉醇与VD₃,探究两者的协同作用与最佳浓度。 【实验内容】 (1)将人胃癌中、低分化的细胞株系与正常胃组织细胞(空白对照),并分别用10^-9、10^-8、10^-7mol/L培养0、4、16、24 h后用RT-PCR检测IΚB-α的mRNA含量变化,用western blot检测IΚB-α蛋白的含量变化,以ChIP检测NF-κB转录因子与DNA结合活性。(2)降低IKKβ与VD₃的结合活性,阻断VD3对IκB-α降解的抑制,定量检测IκB-α的蛋白质和mRNA含量。(3)以不同浓度比例、作用时间方式的紫杉醇与VD₃刺激胃癌胃癌,检测其存活率与细胞周期分布。 【可行性】 预实验中已证实VD₃可以使胃癌细胞中IκB-α含量上升,且刺激时间为4h的组中最为显著。 【创新性】 (1)VD₃的部分作用机制仍不明确。我们猜想VD3可能通过抑制NF-κB通路上某些具体的信号分子而发挥作用,并期望在胃癌细胞中得以验证。(2)VD₃可以通过促进IκB-α的生成以及抑制IκB-α的降解来提高其在细胞中的含量,从而抑制细胞周期。但是哪种因素占主导作用却鲜有研究。我们设计IKKβ抑制实验来探究影响IκB-α含量的主导因素,从而为更有效地调节NF-κB信号通路提供实验依据。(3)选用萜类化合物中的紫杉醇,利用NF-κB通路为其与VD₃作用机制的交叉点,进行探究。如果确认VD₃对紫杉醇杀伤癌细胞产生增敏作用,将对胃癌的临床化疗提供一种有效的治疗方案。     

细胞表面α2,6-唾液酸在肝癌细胞粘附中的作用及机制研究

【目的】 分析比较细胞表面不同连接方式的唾液酸在小鼠肝癌高淋巴道转移细胞株Hca-F和低淋巴道转移细胞株Hca-P中的表达,并研究差异性表达的α2,6-唾液酸在肝癌细胞淋巴结黏附行为中的作用及分子机制。 【方法】 利用免疫细胞化学、流式细胞技术,分析肝癌细胞表面不同连接方式的唾液酸在Hca-F和Hca-P中的表达差异;通过RNA干扰技术干预差异表达的唾液酸转移酶,并使用RT-PCR、蛋白质印迹及Lectin-blot方法检测其干扰效果;利用细胞黏附实验和凝集素阻断实验,检测干扰前后、阻断前后Hca-F细胞黏附能力的变化;利用FAK信号通路特异性抑制剂,探讨α2,6-唾液酸介导肝癌细胞黏附行为的分子机制。 【结果】 α2,6-唾液酸在小鼠肝癌高、低转移细胞株中表达具有显著差异,而α2,3-唾液酸的表达无显著差异;当通过RNA干扰技术特异性使Hca-F细胞中ST6Gal-I表达下调时,其细胞表面α2,6-唾液酸表达减少,削弱Hca-F细胞对淋巴结的黏附能力降低。此外,ST6Gal-I表达下调可抑制p-FAK及下游p-paxillin蛋白分子的表达。 【结论】 细胞表面α2,6-唾液酸可通过FAK信号转导通路正性介导肝癌细胞的黏附行为,为肝癌的治疗提供新的靶点。     

ISL-1表达水平对胃癌细胞化疗耐药性的影响及机制探究

【立论依据】 化疗是一种重要的胃癌辅助治疗方法,但由于不同患者对化疗药物的耐药性差异极大,而影响其治疗效果。哪些因素会导致胃癌细胞呈现不同的耐药性目前尚未阐明。最新的研究表明,自噬可以帮助细胞对抗微环境中的化疗药物,导致耐药。胰岛因子1(Islet-1,ISL1),在正常成体胃组织中不表达,但我们发现ISL1在人胃癌组织中呈中等丰度的表达,且不同胃癌细胞系表达量有明显差异,并对胃癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性亦不同。胃癌细胞中ISL1表达量的差异是否与化疗耐药性相关,目前国内外尚未见报道。我们还发现,5-FU处理下,ISL1表达丰度高的胃癌细胞,其自噬发生标志LC3的剪切也明显增加,那么ISL1是否通过增强肿瘤自噬能力来介导胃癌细胞的化疗耐药性?故本课题试图阐明胃癌细胞中ISL1表达量的差异可导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性,其分子机制与ISL1能够增强肿瘤自噬能力有关。 【设计思路】 (1)明确胃癌细胞中ISL1表达量的差异能否导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性;(2)证实胃癌细胞中自噬与耐药性的关系;(3)探究ISL1与自噬之间的相关性,阐明ISL1促进肿瘤耐药性的机制是通过促进自噬来实现的。 【实验内容】 (1)CCK-8实验和蛋白质印迹实验分别检测ISL1表达量不同的两株胃癌细胞系对5-FU的耐药性差异和自噬强度;(2)过表达/敲低ISL1,检测两种细胞对5-FU的耐药性变化和自噬强度;(3)在过表达或敲低ISL1基础上抑制或增强自噬,检测两株胃癌细胞系在5-FU处理下的自噬强度和各自耐药性的改变。 【材料】 人胃癌细胞系MGC803、MKN28;5-FU;CCK-8试剂盒;过表达或抑制ISL1的质粒;雷帕霉素;3-甲基腺嘌呤;各蛋白抗体。 【可行性】 本实验所涉及的转录因子ISL1为本实验室主要研究对象,因此,本实验在理论指导、材料准备上都有很大的可行性。 【创新性】 自噬与肿瘤耐药之间的关系尚无定论;自噬在胃癌细胞耐药性中的作用也未见报道。因此,本实验属理论创新,且具有应用价值,对肿瘤治疗乃至药物靶点设计方面都有一定意义。     

藤黄酸诱导胃癌细胞凋亡及抗肿瘤转移的实验研究

目的 研究藤黄酸对人胃癌 BGC-803 细胞增殖和转移相关能力的影响及其机制。方法 MTT、Hoechst 染色法检测藤黄酸对 BGC-803 细胞的增殖和凋亡的影响;侵袭小室模型等方法检测藤黄酸对 BGC-803 细胞侵袭、黏附、迁移的影响;运用 RT-PCR、Western-blotting 法分析藤黄酸对胃癌细胞凋亡和转移相关基因 bcl-2、bax、细胞黏附分子-1 (ICAM-1) mRNA 和蛋白表达的影响。结果 藤黄酸抑制 BGC-803 细胞的生长,其抑制率与药物浓度及作用时间呈依赖关系。低浓度的藤黄酸处理 BGC-803 细胞后,可明显降低胃癌细胞的黏附、迁移和侵袭能力。随着藤黄酸浓度的增大,bcl-2、ICAM-1 mRNA 和蛋白表达均下调,bax mRNA 和蛋白表达上调。结论 藤黄酸对胃癌细胞 BGC-803 有明显的生长抑制作用,具有显著的促肿瘤细胞凋亡作用和抑制肿瘤细胞转移相关性质,其机制可能与下调 bcl-2、ICAM-1 及上调 bax 的表达有关。     

MyoD对癌症骨骼肌转移的抑制作用研究

【立论依据】 国内外研究表明:(1)骨骼肌,淋巴管分布广泛,血供丰富,但未有癌症转移到骨骼内生长。(2) MyoD是骨骼肌成肌调节因子,有以下作用:让某些细胞转化为骨骼肌细胞。人工合成高亲和力的MyoD,可与分化抑制因子ID结合,抑制癌细胞增殖。预实验结果显示:骨骼肌细胞因子作用:(1)抑制癌细胞增殖; (2) 使癌细胞的生长形态变为梭状或细长状。 【设计思路】 猜想:MyoD是抑制癌细胞转移到骨骼肌内生长的内源性细胞因子。体外实验:(1)骨骼肌细胞与癌细胞共培养探索骨骼肌细胞对癌细胞的影响。(2)在癌细胞培养基中添加MyoD探索MyoD对癌细胞增殖及迁移能力的影响。(3)构建siRNA靶向沉默MyoD骨骼肌细胞株与癌细胞共培养探索其它细胞因子对癌细胞增殖的影响。体内实验:构建裸鼠肿瘤模型,肿瘤部位注射MyoD MyoD是内源性抑制肿瘤生长的因子。若实验假设不成立,则寻找新的细胞因子,进行新的探索。 【实验内容】 实验组:(1)在癌细胞培养基中添加MyoD。(2)骨骼肌细胞、siRNA靶向沉默骨骼肌细胞与癌细胞共培养24 h。(3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射骨骼肌细胞培养上清液、MyoD。对照组: (1)在癌细胞培养基中添加DMEM。(2)癌细胞与癌细胞共培养24h。 (3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射生理盐水。Brdu测细胞增殖率,流式、WB测蛋白表达,电镜、光学显微镜下观查细胞生长形态以及超微结构,称量体重等观察肿瘤生长。 【材料】 人骨骼肌细胞,人乳腺癌细胞(淋巴转移),人肝癌细胞(血道转移),人鼻咽癌细胞(高转移率),裸鼠。实验采用空隙为0.4 μm的Transwell嵌入式培养板。 【可行性】 本实验理论基础牢靠、前期研究充足,实验设计切合实际。 【创新性】 新思路、新分子,从骨骼肌转移癌低发生率出发,寻找内源性的癌症治疗分子或者靶点。     

致婴幼儿腹泻星状病毒非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制

星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。     

泰山银杏外种皮多糖对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

【目的】 探讨泰山银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides,GBEP)对体外培养的食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 【方法】 通过沸水浸提,有机溶剂沉淀,并通过sevage法除去蛋白,获得GBEP。利用MTT法检测不同浓度的GBEP对食管癌细胞EC-9706增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的分布;Annexin-V/PI双染分析凋亡率;蛋白质印迹法检测与细胞周期及细胞凋亡相关的蛋白表达变化。 【结果】 GBEP显著抑制EC-9706细胞的增殖,并呈时间、剂量依赖性。其半数抑制浓度(IC50)为138.9 μg/mL。细胞周期分析结果表明,GBEP处理后G1期细胞比例由52.25%增加至69.76%,蛋白质印迹结果显示细胞周期蛋白D1的表达呈浓度依赖性下降。说明GBEP诱导EC-9706细胞G1期阻滞。流式细胞术分析结果表明,GBEP诱导的EC-9706细胞凋亡随剂量和作用时间增加而增加。同时GBEP抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加促凋亡蛋白Bax的表达,促进caspase3的激活和PARP的剪切。 【结论】 泰山银杏外种皮多糖抑制食管癌细胞的增殖,诱导细胞G1期阻滞,并激活内源性细胞凋亡。     

基于信号通路网络交互研究复叶耳蕨总黄酮诱导BMSCs成骨分化的分子机制

【目的】 探究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、定向成骨分化的影响以及相关信号通路。 【方法】 采用差速贴壁法体外分离、纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞,取P3代细胞,采用MTT法检测细胞生长曲线、流式细胞术测定细胞表面标志。实验采用不同浓度的复叶耳蕨总黄酮培养基对大鼠BMSCs定向诱导分化,观察BMSCs诱导分化过程中诱导细胞的形态;测定诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和组织化学染色观察钙化结节形成能力;采用RT-PCR和ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中的WNT和BMP通路转导体及其交汇靶点Runx2相关基因表达。 【结果】 体外培养的细胞表达BMSCs细胞表面标志;复叶耳蕨总黄酮对BMSCs增殖具有一定的抑制作用;促进BMSCs分化为成骨细胞;增强ALP活性和钙结节形成;上调WNT通路转导体β-catenin、cyclinD1和BMP通路转导体BMP2、BMP4、两条通路交互靶点Runx2以及骨桥蛋白、骨钙蛋白和Ⅰ型胶原基因表达。 【结论】 复叶耳蕨总黄酮能够上调BMP和WNT通路,促进网络靶点Runx2表达,从而促进大鼠BMSCs定向分化为成骨细胞。     

17-AAG抑制piRNA-PIWI通路对神经母细胞瘤“干性”影响的研究

【理论依据】 piRNA是细胞内三大非编码RNA(nocodingRNA)之一,参与到干细胞干细胞“干性”的维持之中,同时与PIWI蛋白组成piRNA-PIWI通路,在大量不同类型的肿瘤细胞中高表达。类比miRNA领域取得的研究成果,例如组织工程学应用、抗肿瘤靶点等,探讨piRNA-PIWI通路是否具备相同的应用与靶点价值是本实验设计的核心所在。 【设计思路】 热休克蛋白90(hot shock protein 90)参与了piRNA负载到PIWI蛋白的关键过程,通过使用其抑制剂17-AAG能够间接的抑制piRNA-PIWI通路,同时以神经母细胞瘤的肿瘤干细胞为实验对象,探讨抑制piRNA-PIWI通路对于肿瘤干细胞“干性”的影响 【实验内容】 以小儿最常见的颅外实体瘤神经母细胞为实验对象:(1)神经母细胞瘤干细胞的富集:使用依托泊苷处理肿瘤细胞,进行肿瘤干细胞的富集。(2)实验对象的分组:①维甲酸组作为对照组;②17-AAG组;③RNAi-PIWIL2组。(3)实验检测指标:①PIWIL2 mRNA的检测;②细胞干性的评价:检测相关基因OCT4、SOX2、C-MYC与N-MYC基因的表达,甲基化相关酶(DNMT1、DNMT3)的表达,同时进行形态学观察、细胞凋亡以及细胞周期的监测。③piRNA-PIW通路功能的检测:检测代表性的转座子Line-1、IAP的表达,以及PIWIL2蛋白的表达。 【材料】 神经母细胞瘤细胞系IMR-32、SK-N-SH、SH-SY5Y;HSP90抑制剂17-AAG。 【可行性】 本实验室已在神经母细胞瘤的相关研究中取得研究成果,发表SCI论文,同时本实验的参与团队在校学习期间深入实验室研究过程之中,掌握了一定的实验技能。 【创新性】 探讨使用piRNA-PIWI通路的间接抑制剂17-AAG,从而研究抑制该通路对于神经母细胞瘤干细胞“干性”所造成的影响,为研究靶向抑制piRNA-PIWI通路作为抗肿瘤治疗新靶点奠定理论基础,同时亦为未来开发基于piRNA的组织工程学重编程细胞的新靶点进行前瞻性研究。     

细胞外组蛋白诱导肿瘤细胞死亡的机制研究

【目的】 通过体外实验证实细胞外组蛋白(EHs)诱导肿瘤细胞死亡的现象,并探明EHs诱导肿瘤细胞死亡的死亡方式。 【方法】 (1)用EHs以不同时间和浓度梯度刺激前列腺癌骨转移细胞系(PC-3)、肺癌细胞系(A549)和肝癌细胞系(HepG2),利用MTT染色测量肿瘤细胞存活率,得到EHs诱导肿瘤细胞死亡的时间和剂量关系,并验证EHs对肿瘤细胞杀伤作用的普遍性。(2) 选择杀伤作用具有代表性的某几种肿瘤细胞,进行探明EHs诱导肿瘤细胞死亡方式的实验。我们计划向实验体系中引入各种细胞死亡方式的抑制剂:如细胞凋亡抑制剂——Z-VAD-fmk,程序性坏死抑制剂——Necrostatin-1,细胞自噬抑制剂——Chloroquine。即添加针对某种细胞死亡方式的抑制剂对肿瘤细胞进行保护,在同等条件下检测其与未添加抑制剂的肿瘤细胞的存活率的差异。若添加抑制剂后肿瘤细胞存活率升高,表明EHs诱导肿瘤细胞死亡与该方式有关。再通过与EHs刺激肿瘤细胞后的总存活率进行比较,明确该种死亡方式所占比率。(3) 确定细胞死亡方式后,对该方式进行深入探究。例如当验证为细胞以凋亡方式死亡时,则分别用caspase 8(死亡受体通路)抑制剂Z-IETD-FMK和caspase 9(线粒体介导通路)抑制剂证明EHs诱导肿瘤细胞凋亡的具体途径。 【结果】 (1) 体外实验证实EHs诱导肿瘤细胞死亡,并呈现剂量和时间依赖性(已完成);(2) 明确EHs诱导肿瘤细胞死亡的方式及其比率(部分完成);(3) 明确主要死亡方式的具体途径。 【结论】 EHs通过死亡受体和线粒体双途径诱导肿瘤细胞凋亡。     

桥粒胶蛋白-3介导促卵泡激素通过EGFR/Akt信号通路对卵巢癌细胞增殖活性的调控

目的 通过检测桥粒胶蛋白-3（Dsc3）在卵巢癌中的表达以及促卵泡激素（FSH）对Dsc3、EGFR/Akt信号通路下游分子以及细胞增殖的影响,探讨Dsc3是否介导FSH通过EGFR/Akt信号通路对卵巢癌细胞增殖活性的调控,进而促进肿瘤的发生。方法 免疫组化检测Dsc3在卵巢肿瘤组织中的表达;运用蛋白质印迹分析方法检测Dsc3在6种卵巢肿瘤细胞及卵巢永生化上皮细胞中的表达情况和FSH对Dsc3、EGFR的调控,以及干扰Dsc3、EGFR和应用Akt通路阻断剂对信号通路分子的调控;运用MTT方法检测干扰Dsc3、EGFR以及使用Akt阻断剂后对卵巢癌细胞增殖活性的影响。结果 （1）Dsc3在卵巢癌及交界性卵巢肿瘤中的阳性表达率均高于良性卵巢肿瘤,差异均有统计学意义（P<0.05）,Dsc3在卵巢癌中的阳性表达率与交界性卵巢肿瘤的差异无统计学意义（P>0.05）;Dsc3在某些卵巢癌细胞如Hey、HO8910中及交界性卵巢肿瘤细胞MCV152中的表达高于卵巢永生化上皮细胞Moody;（2）FSH呈剂量-时间依赖效应上调Dsc3、EGFR的表达;（3）干扰Dsc3后,信号通路分子EGFR、pAkt受到抑制,Akt无明显改变;干扰EGFR后,信号通路分子Dsc3、pAkt受到抑制,Akt无明显改变;应用Akt通路阻断剂后,Dsc3、pAkt受到抑制,Akt无明显改变;以上三种处理均可抑制FSH对Akt信号通路的调控;（4）干扰Dsc3、EGFR,及应用Akt通路阻断剂均可抑制FSH介导的卵巢癌细胞增殖活性（P<0.05）。结论 Dsc3介导FSH通过EGFR/Akt通路调控的卵巢癌细胞增殖活性,进而促进卵巢癌的发展。     

鳖甲煎丸含药血清对肝癌细胞Bel-7402增殖的影响及其可能机制

【立题依据及设计思路】 原发性肝癌是一种常见恶性肿瘤,探索行之有效的治疗方法,是一个亟待解决的问题。鳖甲煎丸是医圣张仲景所创,研究表明具有较好的抑制肝癌生长,防止肝癌转移的作用,但其机制不明。本实验拟观察鳖甲煎丸含药血清对肝癌Bel-7402细胞生长的影响,从细胞凋亡和肿瘤血管新生角度探讨其抗癌机制,为临床应用此方治疗肝癌提供理论与实验依据。 【实验内容】 (1)大鼠含药血清的制备;(2)MTT法检测不同剂量鳖甲煎丸含药血清对Bel-7402细胞增殖的影响;(3)流式细胞术检测含药血清对Bel-7402细胞凋亡情况;(4)蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax、ERK1、p-ERK、JNK、p-JNK等相关凋亡蛋白含量的变化,探讨其影响MAPK信号通路传导,促进肿瘤细胞凋亡的作用机制;(5)蛋白质印迹法检测肿瘤细胞VEGF、Delta-4、NICD等蛋白表达变化,探讨鳖甲煎丸影响VEGF-D114-Notch信号通路传导,抑制肿瘤血管生成的作用机制。 【材料】 SD大鼠、胎牛血清、中药、5-FU、相关抗体等。 【可行性】 (1)鳖甲煎丸以活血、补益、散结为主,既有攻伐之效,亦含补益之功。课题组前期在体实验证明鳖甲煎丸具有较好的抑瘤功效。血清药理学对于中药复方制剂的复杂化学成分能更好的反映药物在体内环境中产生药理效应的真实过程,在理论上具可行性。(2)课题组成员已掌握相关实验技术。(3)科研中心仪器设备能满足实验所需。 【创新性】 中药在抑制肝癌细胞增殖、控制瘤体生长等方面具有独特的优势。目前对中药抗肿瘤的研究仍以单味药或药物单体成分及临床经验方为主,而中医经典复方对肿瘤相关信号通路影响的研究则相当少见。本课题在前期鳖甲煎丸抑制S180实体瘤研究的基础上,通过体外实验观察其对人肝癌细胞Bel-7402的影响,并运用血清药理学、形态学、流式细胞术、MTT、蛋白质印迹等方法,试图从促进肿瘤细胞凋亡及阻碍瘤体内血管生成两方面,探讨鳖甲煎丸治疗肝癌的可能机制。本研究在思路上,将传统中医药理论与现代医学分子生物学理论相结合,探讨中药复方治疗肝癌机制。为中医经典复方治疗肿瘤提供理论基础。     

探究DATS通过调节ERK/NF-κB凋亡通路和诱导自噬而抑制宫颈癌的作用机制

【立题依据】 宫颈癌在发展中国家女性癌症中的死亡率居第二位,主要化疗药物顺铂存在耐药问题,使化疗遇到瓶颈,故需寻找新的有效化疗方案改善现状。研究发现大蒜素(allicin)及其代谢产物二烯丙基三硫化物(DATS)均对肿瘤生长有抑制作用,但DATS在宫颈癌中的作用未见报道。研究表明 DATS在诱导乳腺癌细胞凋亡中抑制了ERK表达,而ERK下调可减少NF-κB活化,且ERK和NF-κB在宫颈癌发生发展中起重要作用,故推测DATS可能通过ERK/NF-κB通路诱导宫颈癌细胞凋亡。Allicin在肝癌中可诱导自噬抗癌,但DATS能否通过自噬抗癌尚无报道。综上,课题探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【设计思路】 通过体外实验明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用并探究其是否调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌;体内实验验证DATS调节ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【实验内容】 明确DATS对宫颈癌细胞的抑制作用,筛出敏感细胞系和最佳作用浓度及时间点;上下调ERK、NF-κB的表达,探究DATS是否通过调节ERK及NF-κB通路促进宫颈癌细胞凋亡;检测自噬小体形成率及自噬相关蛋白BAD,Beclin1的表达,并通过上下调其表达水平,探究DATS是否诱导宫颈癌细胞自噬;构建裸鼠移植瘤模型,验证DATS通过ERK及NF-κB凋亡通路和自噬通路抗宫颈癌。 【材料】 HeLa、SiHa、CaSki细胞系,DATS,ERK、NF-κB、Bcl2及 GFP-LC3表达质粒,ROS、NF-κB及BAD抑制剂,3-MA,裸鼠。 【可行性】 理论可行:文献报道Allicin可抗癌,其代谢产物DATS也能抑制肿瘤生长。目前DATS在宫颈癌中的作用虽无报道,但发现DATS在乳腺癌细胞中抑制ERK表达,而ERK表达与NF-κB活化正相关,且ERK/NF-κB在宫颈癌中起重要作用。文献报道Allicin可诱导肝癌细胞自噬,但其代谢产物DATS是否通过自噬抗癌尚无报道。技术可行:课题所用实验技术,在本科室有扎实的技术支持,研究者已掌握大部分技术。 【创新性】 DATS对宫颈癌的作用及诱导ERK/NF-κB凋亡通路和自噬通路无报道,具有理论创新性;完善DATS的抑癌机制,为研发新抗癌药物提供理论基础,具有实践创新性。     

EBV LMP2A对胃癌细胞生物学特性的影响

【目的】探讨EBV LMP2A基因对人胃癌细胞生物学特性的影响。【方法】用包含LMP2A基因的逆转录病毒载体转染人胃癌细胞株(SGC7901),QRT-PCR检测LMP2A基因的表达,CCK8检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕试验和transwell检测细胞迁移能力;克隆形成试验检测细胞成瘤能力。【结果】LMP2A基因转染的胃癌细胞生长速度增快、凋亡减少、迁移能力增强,在平板和软琼脂中集落形成能力增强。【结论】LMP2A基因能明显增强胃癌细胞的恶性生物学行为。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

Hippo信号通路及其在消化系统肿瘤中的作用研究进展

Hippo信号通路在进化上高度保守,哺乳动物细胞中该信号通路的核心成员包括MST1/2激酶、LATS1/2激酶和效应蛋白YAP/TAZ。虽然YAP/TAZ及其下游相关研究相对较多,但Hippo信号通路的上游调控因子并不明确,是目前该通路研究的热点方向之一。另外,Hippo信号通路可与Wnt和Notch等其他信号通路发生交叉对话,并在控制器官大小、维持组织稳态、促进组织修复再生等过程中扮演重要角色。Hippo信号通路异常可能会导致多种肿瘤的发生,尤其是肝癌、结直肠癌和胃癌等消化系统肿瘤,其成员在消化系统肿瘤中的异常表达与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等过程密切相关。Hippo信号通路对肝脏的修复再生至关重要,其失活会导致原发性肝癌的发生,YAP在肝癌中的促肿瘤作用机制主要依赖于TEAD介导的基因转录。Hippo信号通路对于维持肠道稳态也很重要,其失调会导致结直肠癌的发生及复发。在原发性和转移性胃癌中,YAP/TAZ的表达显著上调,但具体分子调控机制并不清楚。本文总结了近年来Hippo信号通路的发现、上游调控因子及其在消化系统肿瘤发生发展过程中的作用和分子调控机制,并对未来的研究方向进行初步探讨。     

探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响

【立项依据】 转移是恶性肿瘤的基本特征,且癌细胞转移与细胞运动密切相关,而RhoA-ROCK通路可作用于肌球蛋白,参与细胞骨架重组,影响细胞运动。那么RhoA-ROCK通路与癌细胞转移是否有一定相关性呢?查阅相关资料得知,RhoA-ROCK通路确实能影响癌细胞转移,并可受DLC1调控抑制肝癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤的生长,另有文献报道,用real-time PCR方法分析DLC1的mRNA表达量在乳腺癌非转移细胞系中比高转移细胞系中多。由此我们猜想DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌转移可能产生一定影响。于是我们拟选择DLC1、RhoA作为测定指标,探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响。 【实验内容】 分别选取已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本各25例,应用免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测DLC1、RhoA在两组标本中的表达,对实验结果进行分析。 【材料】 已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本,DLC1抗体,RhoA抗体,相关试剂盒。 【可行性】 (1)应用免疫组织化学法预实验结果显示,发生转移与未发生转移的乳腺癌病变组织比较:DLC1表达较少,RhoA表达较多,二者间差异有统计学意义,用spearman等级相关分析显示DLC1与RhoA间存在相关性,由此提示乳腺癌淋巴道转移与DLC1、RhoA-ROCK通路可能存在一定联系。(2)已有文献报道从理论上支持我们通过检测两组标本中DLC1、RhoA的表达来探究其与乳腺癌淋巴道转移的关系。 【创新性】 (1)学习《病理生理学》,获知RhoA-ROCK通路可影响细胞运动,而学习《病理学》,我们知道癌细胞转移是恶性肿瘤的基本特征,本课题将病理生理学与病理学知识相联系,由RhoA-ROCK通路影响细胞运动联想到乳腺癌淋巴道转移。(2)大量文献报道DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路发挥抑癌作用,但其是否会影响乳腺癌淋巴道转移的文献却未见发表。(3)经实验探究,初步认识到DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路而抑制乳腺癌淋巴道转移,若进一步探究DLC1抑制RhoA-ROCK通路的机制,将为临床上抑制乳腺癌淋巴道转移提供新的治疗靶点和理论依据。     

精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化对大肠癌自噬的影响

【立论依据】 精氨酸特异性单ADP核糖基化是蛋白质翻译后修饰重要形式,目前研究极少。 我们先前研究首次报道了精氨酸特异性单ADP核糖基化转移酶(ART1)对小鼠大肠癌细胞运动、黏附等具重要作用并与Rho 表达有关。有研究表明,自噬基因Beclin-1在大肠癌中表达率高,可促进大肠癌发生发展;Rho信号通路与自噬调节有关。但精氨酸特异性单ADP核糖基化是否可通过Rho影响大肠癌细胞自噬水平,对大肠癌细胞生长发挥调节作用尚不清楚。 【设计思路】 基于前期工作基础,本研究拟通过改变ART1在大肠癌细胞的表达改变精氨酸特异性单ADP核糖基化水平,观察大肠癌细胞自噬相关蛋白、Rho及其下游与肿瘤增殖相关效应分子表达以及癌细胞增殖能力和小鼠移植瘤生长变化,探讨精氨酸特异性单ADP核糖基化作用对大肠癌自噬的影响及其机制,为寻求大肠癌治疗新靶点提供实验依据。 【实验内容】 构建ART1基因沉默和过表达慢病毒载体转染大肠癌CT26细胞使精氨酸特异性单ADP核糖基化水平改变;电镜观察自噬小体的形成;蛋白质印迹或RT-PCR法检测自噬相关蛋白(Lc3、Beclin-1)表达、Rho蛋白家族Rho1、Rac和Cdc42及其下游与肿瘤增殖相关效应分子(c-fos、c-myc)的变化;采用CCK-8、流式细胞术和动物移植瘤模型,观察大肠癌细胞增殖和生长。 【材料】 小鼠大肠癌CT26细胞,相关蛋白抗体,逆转录试剂盒,Balb/c小鼠,CCK-8试剂盒等。 【可行性】 自噬是细胞存活的必要因素,其形成过程与Rho有关;大肠癌中,自噬相关基因Beclin-1表达高于正常组织,其可促进大肠癌肿瘤的发生发展。本研究前期研究已显示,抑制ART1可下调Rho相关信号转导。因此,我们推测通过下调ART1抑制精氨酸特异性单ADP核糖基化作用,可下调Rho信号转导,进而下调大肠癌细胞自噬水平具有充分的理论依据。先前对精氨酸特异性单ADP核糖基化在大肠癌黏附、迁移等方面的研究,也为本研究奠定了基础。 【创新性】 本研究首次通过观察精氨酸特异性单ADP核糖基化作用与大肠癌自噬以及与Rho信号通路关系,阐明精氨酸特异性单ADP核糖基化作用对大肠癌细胞自噬的调节作用和机制。