小分子干扰RNA沉默肝癌细胞CDK2基因对RB、CyclinE、E2F1基因表达的影响

【目的】观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK2)基因后,细胞周期相关基因RB、CyclinE、E2F1在肝癌细胞SMMC7721中mRNA的表达。【方法】将前期研究中已构建成功并筛选出的最有效干扰抑制CDK2基因的siRNA序列片段,采用Lipofectamine TM2000脂质体转染法转染肝癌细胞株SMMC7721后分6组:重组质粒组190、重组质粒组191、SMMC7721肝癌组、转染试剂组、阴性对照组、空质粒组。采用实时荧光定量PCR法检测RB、CyclinE、E2F1 mRNA水平。【结果】CDK2的siRNA转染SMMC7721细胞后,RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调。【结论】抑制CDK2基因的表达能使肝癌细胞SMMC7721中RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调,提示肝癌细胞中RB、CyclinE、E2F1基因的表达与CDK2基因的表达具有明显的相关性。     

自分泌促炎因子在肿瘤化疗耐药中的作用

【目的】 顺铂和依托泊苷联合化疗(EP)是临床常用的针对肺癌的化疗方案。但长期应用EP后,其药效减弱,产生多药耐药,影响疗效。并有文献报道,某些促炎因子在多药耐药中发挥着作用。本课题旨在探究EP诱导的化疗耐药机制,找出潜在的多药耐药作用靶点。 【方法】 (1)基础实验:选用NCI-H446和A549肺癌细胞系,DDP处理后进行细胞克隆形成实验,发现在CM培养条件下,两种细胞耐药性形成。以此为基础进行设计。用TNF-α、EP、CM、TNF-α抑制剂分别或共同处理H446和A549细胞,通过光镜、流式细胞术、台盼蓝细胞计数来明确细胞存活情况。用TNF-α处理后通过蛋白质印迹和real-time PCR法检测ABCG2、MRP2、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表达,再用TNF-α siRNA进行干扰,用real-time PCR检测。先用蛋白质印迹法检测两种细胞中磷酸化ATM和磷酸化IkB-a的表达情况,再用TNF-α处理,通过蛋白质印迹和共聚焦显微检测,确定磷酸化ATM、磷酸化p65和磷酸化IkB-a的表达。用TNF-α、ATM抑制剂、NF-κB抑制剂分别和(或)共同处理细胞,通过蛋白质印迹和confocal来确定磷酸化ATM、磷酸化p65、磷酸化IkB-a、ABCG2、MRP2、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表达。通过siRNA干扰ATM、p65,再用蛋白质印迹和real-time PCR来确定这些蛋白的表达。(2)临床实验:通过回顾性分析,取小细胞肺癌和非小细胞肺癌患者的癌组织和癌旁组织,通过免疫组化检测TNF-α的表达情况。再结合患者的预后,进行数据分析,探究患者TNF-α表达和预后之间的关系。 【结果】 DDP处理的细胞克隆实验发现,在CM培养条件下,NCI-H446和A549两种细胞耐药性比DDP组明显,说明两种细胞耐药性形成。 【结论】 CM中含有的某一细胞因子(TNF-α)能够诱导NCI-H446和A549两种肺癌细胞耐药性形成,为治疗肺癌多药耐药提供新的可能的治疗靶点。     

慢病毒介导靶向PRL-3 基因的siRNA 抑制肝癌细胞的侵袭性

 【目的】 探讨肝再生磷酸酶-3(PRL-3)的表达对肝癌细胞侵袭能力的影响&#65377;【方法】 设计&#65380;合成4对针对PRL-3 基因siRNA 的寡核苷酸序列,分别构建质粒,转染293T 细胞,据其对PRL-3 的抑制率,筛选最有效的PRL-3 基因RNAi 靶序列,设计并合成其siRNA 的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL-GFP 线性化载体连接产生重组慢病毒质粒LV-PRL3-SiRNA,并行PCR 和测序鉴定&#65377;将LV-PRL3-SiRNA,pHelper 1.0 和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平经孔稀释法测定病毒滴度&#65377;重组慢病毒感染肝癌SMCC7721 细胞,行real time-PCR和western-blot验证PRL-3基因的沉默效果&#65377;用Transwell侵袭试验检测SMCC7721细胞体外侵袭力的改变&#65377;【结果】 成功构建PRL-3 基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为6 × 108 Tu/mL&#65377;和对照组相比,RNA 干扰组SMMC7721 细胞PRL-3 基因的mRNA 水平和蛋白水平的抑制率分别为75%和63%;其穿过人工基底膜的平均数(14.2 ± 0.8)明显少于空白对照组(33.0 ± 1.6)及非特异性siRNA感染组(31.2 ± 0.8),侵袭抑制率为58% (P < 0.01)&#65377;【结论】 降低PRL-3 的表达可抑制肝癌细胞的侵袭能力&#65377;     

PcG调控肝癌耐药性的规律及机制研究

【目的】 肝癌是目前我国发病率和致死率位居第二位的恶性肿瘤,每年约有30万例新发肝癌,占全球50%以上。尽管通过手术和化学药物治疗,其五年生存率仍然很低,肝癌细胞对于化疗药物的耐药性的产生是肝癌高致死率的主要原因。 Polycomb group(PcG)蛋白通过染色质的组蛋白甲基化修饰调控靶基因的转录,是重要的促癌基因。我们及其他研究组发现,在肝细胞肝癌中PcG家族蛋白异常高表达,与肝癌术后存活率等恶性指标密切相关,是肝细胞肝癌预后的重要分子标志物。然而,PcG蛋白在肝癌细胞耐药性的产生中如何发挥作用尚不清楚。本研究主要探讨PcG家族蛋白调控肝癌细胞化疗耐受性产生的生物学功能及其靶基因网络,并阐明其表观遗传学机制。 【方法】 用表柔比星、丝裂霉素C等化疗药物短期处理HepG2等肝癌细胞系,real-time qRT-PCR、蛋白质印迹检测EZH2、SUZ12、CBX8及BMI1等PcG家族蛋白表达规律;通过建立EZH2过表达或shRNA干扰稳定细胞系,克隆形成和流式细胞技术等技术检测细胞增殖、细胞凋亡等指标,探讨EZH2异常表达肝癌细胞对化疗药物的敏感性;从实验室前期ChIP-on-ChIP组学数据的整合性分析入手,筛选ATM等靶基因,探讨PcG调控ATM转录及表达的规律及机制;深入揭示ATM通路在PcG调控的肝癌细胞化疗药物耐受性产生中的关键作用。 【结果】 通过前期实验我们发现:短期化疗药物处理导致PcG蛋白表达量下降,而不影响其转录水平表达,提示化疗药物通过蛋白稳定性影响PcG蛋白表达;PcG通过H3K27me3组蛋白甲基化机制抑制DNA损伤修复基因ATM表达,参与化疗药物引起的肝癌细胞DNA损伤修复过程,从而引起化疗药物耐受性产生;EZH2蛋白的SET酶活性为靶点的小分子化合物GSK126显著促进肝癌细胞化疗药物敏感性。 【结论】 PcG蛋白通过表观遗传学机制调控的ATM通路是肝癌细胞化疗耐受性产生的关键通路之一,以PcG-ATM为靶点的小分子化合物是有希望的化疗增敏剂。     

糖基因ST8SIA家族在人慢性粒细胞白血病多药耐药中的作用

【目的】 通过研究糖基因ST8SIA家族在人慢性粒细胞白血病(CML)细胞株KCL22及其耐阿霉素细胞株KCL22/ADR、CML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中表达的差异,明确糖基因ST8SIA家族与人CML多药耐药的相关性,为白血病耐药提供新的治疗策略和靶点。 【方法】 采用质谱技术检测KCL22及KCL22/ADR细胞表面N-糖链的组成差异;采用real-time PCR和蛋白质印迹法检测ST8SIA家族在人CML及其耐药细胞株、CML患者(28例)及CML耐药患者(48例)BMMC中的表达;通过RNA干扰技术特异性下调差异表达的糖基因,检测干扰前后CML细胞在体内、体外对化疗药物的敏感性、PI3K/Akt信号通路的激活情况及P-gp、MRP1的表达情况;特异性PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002 和Akt shRNA分别作用于KCL22/ADR细胞,检测抑制前后该细胞体内、体外对化疗药物的敏感性。 【结果】 KCL22和KCL22/ADR细胞膜表面N-糖链的组成、唾液酸具有显著差异;ST8SIA4和ST8SIA6在人CML及其耐药细胞株、CML患者BMMC中表达具有显著差异;特异性下调ST8SIA4或ST8SIA6的表达,改变KCL22/ADR和KCL22细胞体内、体外的药物敏感性、PI3K/Akt信号通路分子和P-gp、MRP1表达;KCL22/ADR细胞经LY294002和Akt shRNA分别作用后,PI3K/Akt主要信号通路分子表达水平降低,同时该细胞的药物敏感性也增强(P<0.05)。 【结论】 人CML细胞株及CML患者BMMC中ST8SIA家族的表达具有显著差异,这些特征性改变与CML多药耐药具有相关性;CML多药耐药性可能是通过ST8SIA4、ST8SIA6介导PI3K/Akt信号通路调控P-gp、MRP1的表达改变实现的。     

siRNA介导核干因子基因沉默抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 核干因子(nucleostemin, NS)是最近发现的一个GTP结合蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均有表达。NS在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用,然而其在肝癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测其在不同肝癌细胞系和组织中的表达,并利用siRNA干扰技术,以探究NS在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。 【方法】 以肝癌组织和多种肝癌细胞系为研究对象,首先通过定量PCR及蛋白质印迹法分析细胞及肝癌组织中NS的表达。接着通过siRNA瞬时转染的方法降低NS的表达,并通过定量PCR和蛋白质印迹法检测干涉效果,利用MTT试验和细胞增长实时监控技术检测细胞增殖情况,流式细胞术探究紫外线(ultraviolet, UV)或血清饥饿诱导下细胞凋亡情况。 【结果】 蛋白质印迹及定量PCR结果显示NS在多种肝癌细胞系及肝癌组织中都有较高的表达,且在MHCC97H和Bel7402细胞中,MTT试验和细胞增长实时监控显示降低NS的表达能够抑制细胞增殖,流式细胞术和蛋白质印迹结果显示NS基因沉默能够促进UV和血清饥饿诱导的细胞凋亡。即NS可能具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 【结论】 NS在肝癌组织和细胞中都有较高的表达,在MHCC79H和Bel7402细胞中,降低NS表达可抑制细胞增殖,促进UV及血清饥饿诱导的细胞凋亡。     

ISL-1表达水平对胃癌细胞化疗耐药性的影响及机制探究

【立论依据】 化疗是一种重要的胃癌辅助治疗方法,但由于不同患者对化疗药物的耐药性差异极大,而影响其治疗效果。哪些因素会导致胃癌细胞呈现不同的耐药性目前尚未阐明。最新的研究表明,自噬可以帮助细胞对抗微环境中的化疗药物,导致耐药。胰岛因子1(Islet-1,ISL1),在正常成体胃组织中不表达,但我们发现ISL1在人胃癌组织中呈中等丰度的表达,且不同胃癌细胞系表达量有明显差异,并对胃癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性亦不同。胃癌细胞中ISL1表达量的差异是否与化疗耐药性相关,目前国内外尚未见报道。我们还发现,5-FU处理下,ISL1表达丰度高的胃癌细胞,其自噬发生标志LC3的剪切也明显增加,那么ISL1是否通过增强肿瘤自噬能力来介导胃癌细胞的化疗耐药性?故本课题试图阐明胃癌细胞中ISL1表达量的差异可导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性,其分子机制与ISL1能够增强肿瘤自噬能力有关。 【设计思路】 (1)明确胃癌细胞中ISL1表达量的差异能否导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性;(2)证实胃癌细胞中自噬与耐药性的关系;(3)探究ISL1与自噬之间的相关性,阐明ISL1促进肿瘤耐药性的机制是通过促进自噬来实现的。 【实验内容】 (1)CCK-8实验和蛋白质印迹实验分别检测ISL1表达量不同的两株胃癌细胞系对5-FU的耐药性差异和自噬强度;(2)过表达/敲低ISL1,检测两种细胞对5-FU的耐药性变化和自噬强度;(3)在过表达或敲低ISL1基础上抑制或增强自噬,检测两株胃癌细胞系在5-FU处理下的自噬强度和各自耐药性的改变。 【材料】 人胃癌细胞系MGC803、MKN28;5-FU;CCK-8试剂盒;过表达或抑制ISL1的质粒;雷帕霉素;3-甲基腺嘌呤;各蛋白抗体。 【可行性】 本实验所涉及的转录因子ISL1为本实验室主要研究对象,因此,本实验在理论指导、材料准备上都有很大的可行性。 【创新性】 自噬与肿瘤耐药之间的关系尚无定论;自噬在胃癌细胞耐药性中的作用也未见报道。因此,本实验属理论创新,且具有应用价值,对肿瘤治疗乃至药物靶点设计方面都有一定意义。     

正常人外周血单个核细胞对雷公藤内酯醇的耐药特征和机制的研究

目的 探讨正常人外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 对雷公藤内酯醇 (triptolide, TP) 的耐药特征和机制。方法 采用递增 TP 剂量的浓度梯度诱导法使 PBMC 产生耐药。MTT 比色法测定细胞对药物的敏感性及耐药指数 (resistance index, RI),逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 法分别检测正常对照组和耐药组 PBMC 中多药耐药相关基因 (multidrug resistance gene, MDR1)、多药耐药相关蛋白 (multidrug resistance-associated protein, MRP) 和肺耐药蛋白 (lung resistance-related protein, LRP) 的表达。酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测上清液中 IL-1β 的量。结果 和正常细胞组相比,耐药组细胞的群体倍增时间延长 2.7 h,RI 是 1.99,并且 MDR1 mRNA、MRP mRNA、LRP mRNA 表达量明显增加 (P＜0.01)。TP 能显著抑制正常组 PBMC 分泌 IL-1β (P＜0.05),但对耐药组的抑制作用不明显 (P＞0.05)。结论 TP 体外持续诱导可使正常人 PBMC 产生耐药,其耐药性的产生涉及多个相关基因的表达,这可能是导致类风湿关节炎 (RA) 病人临床服用雷公藤一段时间后产生耐受的原因之一。     

槲皮素对人肝癌细胞耐药株SMMC7721／VCR逆转作用的实验研究

目的探讨槲皮素（Que）对人肝癌细胞耐长春新碱（VCR）耐药株（SMMC7721／VCR）逆转作用的影响。方法应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法分析Que对人肝癌细胞敏感株（SMMC7721／S）、耐药株（SMMC7721／VCR）的抑制作用；Que与VCR联合作用时，SMMC7721／S对VCR的增敏作用及对SMMC7721／VCR耐药性的逆转作用。结果SMMC7721／S、SMMC7721／VCR对VCR的IC50值分别为（1．16±0．06）mg／L和（13．28±0．35）mg／L。SMMC7721／VCR对VCR耐药倍数为11．45倍。Que对两细胞株的生长有明显的抑制作用。25．0～50．0μmol／L终浓度的Que在体外能够明显提高SMMC7721／VCR对VCR的敏感性。结论Que能够部分逆转SMMC7721／VCR细胞的耐药性。它可作为有效的多药耐药逆转剂，与其它化疗药物联合应用于肿瘤的化学治疗。     

人肝癌乳酸脱氢酶的细胞膜定位和酶学特性研究

【立论依据及设计思路】 已有研究表明在人肝癌组织中,间质细胞的线粒体会在癌细胞的驱动下会发生线粒体自噬,只进行糖酵解,且糖酵解相关酶的表达水平显著升高,尤其是间质细胞特异高表达LDHA(乳酸脱氢酶A),将糖酵解产物丙酮酸转化成乳酸,排出间质细胞。而排出的乳酸被邻近的肝癌细胞摄取,肝癌细胞特异表达LDHB,将乳酸转变成丙酮酸。肝癌细胞具有完整的氧化磷酸化过程,能利用间质细胞提供的乳酸,经三羧酸循环、糖异生和脂肪合成,为肿瘤细胞的增殖提供物质和能量。间质细胞的糖酵解和肿瘤细胞的氧化磷酸化之间代谢偶联,是维持肿瘤细胞快速增殖的重要机制。前期实验发现肝癌细胞表达膜型LDHB,而膜型LDHB的功能尚不清楚。本课题拟研究LDHA和LDHB在人肝癌间质细胞和肝癌细胞中的表达和定位和酶学特征,阐述LDH在肝癌组织能量代谢偶联过程中的生化机制,同时评价LDH作为人肝癌能量代谢干预靶点的可能性。 【实验内容】 第一部分:人体肝癌组织标本中肝癌细胞和间质细胞线粒体功能和反向Warburg效应的检测,利用免疫组化的方法检测线粒体标志物和线粒体自噬标志物及LDHA和LDHB的表达分布;第二部分:建立肝癌细胞SMMC-7721和正常人成纤维细胞的共培养体系;第三部分:检测LDH在肝癌细胞及肝癌相关成纤维细胞中的膜定位及表达水平;第四部分:对细胞膜上的LDH进行酶活性检测,明确其酶活性和代谢特征;第五部分:在细胞水平上研究LDH抗体,抗寄生虫药,单羧酸转运体抑制剂对能量代谢偶联的抑制作用;第六部分: 裸鼠模型的抗体和阿苯达唑的抗肿瘤实验。 【材料】 人肝癌SMMC-7721细胞株及成纤维细胞株,特异性LDH抗体,抗寄生虫药物(吡喹酮,阿苯达唑),免疫组化相关材料,qPCR相关材料,免疫印迹相关材料,MTT比色法相关材料。 【可行性】 本实验室已完成了人LDHA和LDHB的克隆表达和酶学特性研究,已实验证实人肝癌细胞SMMC-7721只表达LDHB, 且定位于细胞膜上。 【创新性】 提出肝癌组织中,间质细胞和实质细胞分别表达膜型LDHA和LDHB,不仅负责丙酮酸和乳酸之间的相互转化,而且可能是产物的转运体;抗寄生虫LDH的抗体和药物可以抑制人LDH的酶活性,抑制肿瘤的生长和转移。     

MyoD对癌症骨骼肌转移的抑制作用研究

【立论依据】 国内外研究表明:(1)骨骼肌,淋巴管分布广泛,血供丰富,但未有癌症转移到骨骼内生长。(2) MyoD是骨骼肌成肌调节因子,有以下作用:让某些细胞转化为骨骼肌细胞。人工合成高亲和力的MyoD,可与分化抑制因子ID结合,抑制癌细胞增殖。预实验结果显示:骨骼肌细胞因子作用:(1)抑制癌细胞增殖; (2) 使癌细胞的生长形态变为梭状或细长状。 【设计思路】 猜想:MyoD是抑制癌细胞转移到骨骼肌内生长的内源性细胞因子。体外实验:(1)骨骼肌细胞与癌细胞共培养探索骨骼肌细胞对癌细胞的影响。(2)在癌细胞培养基中添加MyoD探索MyoD对癌细胞增殖及迁移能力的影响。(3)构建siRNA靶向沉默MyoD骨骼肌细胞株与癌细胞共培养探索其它细胞因子对癌细胞增殖的影响。体内实验:构建裸鼠肿瘤模型,肿瘤部位注射MyoD MyoD是内源性抑制肿瘤生长的因子。若实验假设不成立,则寻找新的细胞因子,进行新的探索。 【实验内容】 实验组:(1)在癌细胞培养基中添加MyoD。(2)骨骼肌细胞、siRNA靶向沉默骨骼肌细胞与癌细胞共培养24 h。(3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射骨骼肌细胞培养上清液、MyoD。对照组: (1)在癌细胞培养基中添加DMEM。(2)癌细胞与癌细胞共培养24h。 (3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射生理盐水。Brdu测细胞增殖率,流式、WB测蛋白表达,电镜、光学显微镜下观查细胞生长形态以及超微结构,称量体重等观察肿瘤生长。 【材料】 人骨骼肌细胞,人乳腺癌细胞(淋巴转移),人肝癌细胞(血道转移),人鼻咽癌细胞(高转移率),裸鼠。实验采用空隙为0.4 μm的Transwell嵌入式培养板。 【可行性】 本实验理论基础牢靠、前期研究充足,实验设计切合实际。 【创新性】 新思路、新分子,从骨骼肌转移癌低发生率出发,寻找内源性的癌症治疗分子或者靶点。     

量子点标记自杀基因靶向脂质体在肝癌诊治一体化中的应用研究

【目的】 自杀基因/前体药物系统抗肿瘤作用效果显著,但自杀基因肿瘤靶向识别性差而限制其临床应用。基于叶酸偶联脂质体(FL)的生物相容性及靶向性、量子点(QD)荧光标记的高灵敏性及光稳定性、HSV-tk自杀基因独特的旁观者效应,本研究拟开发多功能纳米载体-叶酸靶向量子点标记的HSV-TK基因脂质体(FL/QD-TK),并检测此载体系统在肝癌诊治一体化中作用。 【方法】 构筑FL/QD-TK并进行表征后,利用MTT法、激光共聚焦荧光显微镜、活体荧光成像仪及裸鼠移植瘤模型等方法对其体内外靶向性成像和治疗肝癌的作用及生物安全性进行研究。 【结果】 多功能纳米载体FL/QD-TK合成方法稳定,形貌均一,对叶酸受体高表达的Bel-7402肝癌细胞表现出较强的选择性杀伤作用,而对叶酸受体低表达的HepG2细胞靶向杀伤作用较弱。FL/QD-TK可实时示踪TK基因在Bel-7402荷瘤裸鼠体内的运输与分布,实现了在肿瘤部位的靶向富集,系统性给药并联合GCV取得了良好的抗肿瘤效果,同时对各脏器组织形态学和血清学指标无影响。 【结论】 新型多功能纳米载体FL/QD-TK可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞,在体内可视化示踪TK基因治疗肿瘤并具备了较好的生物安全性,FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米药物有望应用于肝癌的诊治一体化。     

青岛地区大肠埃希菌中整合子与耐药性的分析

【立论依据】 大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌,耐药率有逐年上升的趋势。近年研究表明,整合子在细菌多重耐药性的形成和水平传播中发挥重要作用,且整合子的分布及其携带的基因盒存在明显的地区差异性。因此,检测不同地区大肠埃希菌中整合子的分布及耐药基因盒,对于控制细菌耐药及合理应用抗菌药物具有重要的指导意义。 【设计思路】 本研究通过检测青岛地区临床分离的大肠埃希菌中I类、II类及III类整合子的分布及携带的耐药基因盒,分析整合子与耐药表型的关系,旨在探讨整合子在介导大肠埃希菌耐药中的作用。 【实验内容】 琼脂纸片扩散法进行药敏试验;分别设计针对I、II、III类整合子整合酶基因及可变区的PCR引物,PCR检测整合子的整合酶基因,对整合酶基因阳性菌株进行可变区基因的PCR扩增,回收纯化的PCR产物克隆至T载体,将筛选鉴定的重组子送往华大基因公司测序,测序结果经在线Blast及DNAstar软件进行同源性比对分析,确定整合子携带的耐药基因盒。应用SPSS 21.0统计软件分析大肠埃希菌耐药性与整合子的相关性。 【材料】 78株大肠埃希菌分离自青岛市立医疗集团住院患者的各类标本,细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,PCR引物由Invitrogen公司合成,pMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。 【可行性】 前期研究结果表明:78株大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、复方新诺明、氨曲南、头孢曲松及哌拉西林的耐药率均超过70%;I类整合子的携带率为53.89%,其中I类整合子阳性菌株对复方新诺明的耐药率明显高于整合子阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05);I类整合子可变区检测出3种不同长度的片段:2株750 bp片段不携带耐药基因盒,8株1 800 bp片段携带dfrA17-aadA5 基因盒,1株1 200 bp片段为aadA22基因盒;I类整合子阳性菌株中携带耐药基因盒的菌株占61.90%,对复方新诺明的耐药率明显高于基因盒阴性菌株(P<0.01)。 【创新性】 首次研究青岛地区大肠埃希菌中整合子的分布及其携带的耐药基因盒,探讨整合子与大肠埃希菌耐药性的关系。     

pTn5GFP转座质粒用于耐药鲍曼不动杆菌生物被膜相关基因的研究

【立论依据】 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一种革兰氏阴性球杆菌,是引起院内感染的主要菌种之一,多重耐药和泛耐药AB菌株感染更是给临床治疗带来极大的困难。生物被膜形成能力与AB耐药以及致病性密切相关。寻找AB生物被膜形成的关键基因对于AB相关疾病的预防和控制具有重要意义。转座子是一段特殊的DNA片段,在转座酶的作用下,可随机插入细菌基因组,使插入基因失活,改变相关表型。应用转座子随机突变策略可以找出特定表型对应的基因,但是以传统的抗生素抗性基因作为报告基因显然不能满足对多重耐药菌株的研究。 【设计思路】 绿色荧光蛋白(GFP)因为不需要单独加入底物并且易于观察而被广泛用来标记生物分子或细胞。已有研究表明,GFP基因插入细菌的染色体上后,可以有效地对细菌进行标记。基于转座质粒以及GFP的特点,本研究拟构建具有Tn5转座子和GFP基因的pTn5GFP转座质粒,利用GFP作为报告基因,构建临床分离的多重耐药AB突变文库,进而筛选出AB生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【实验内容】 以pGFPmut3.1质粒为模板,扩增GFP基因,将其连接入含有Tn5转座子的pRL27质粒,构建pTn5GFP转座质粒。利用该质粒对多重耐药AB菌株进行转座子突变,构造突变文库。对突变株的生物被膜情况进行分析,确定转座子插入位点,找出生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【材料】 临床多重耐药AB两株,R005和R036,自北京大学人民医院获得。常用工具菌E.coli CC118λπ和E.coli DH5α。pRL27和pGFPmut3.1质粒由原实验室毕业研究生提供。 【可行性】 已成功构建了pTn5GFP转座质粒,该质粒在容纳菌株E.coli CC118λπ具有绿色荧光表型,并已通过预实验初步确定了两株多重耐药AB生物被膜形成能力和最适实验条件。 【创新性】 本研究将GFP报告基因的便捷性以及转座质粒的转座性结合起来,有效解决了因耐药性而无法对泛耐药菌株构建突变文库的问题,结果直观,易于筛选,可行性高。     

半枝莲多糖对肝癌细胞SMMC7721生长抑制及机制的研究

【目的】研究半枝莲多糖(Scutellaria barbata polysaccharides,SBP)对肝癌细胞SMMC7721生长的抑制及相关机制。【方法】将不同浓度SBP作用于SMMC7721肝癌细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测半枝莲多糖对肝癌细胞SMMC7721生长增殖的抑制作用;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)与转录因子E2F1 mRNA表达;蛋白印迹法(Western blot)检测CDK2与E2F1蛋白表达。【结果】SBP对肝癌细胞SMMC7721具有明显的生长抑制作用,其中10、2.5μg/mL SBP组作用显著,均可使CDK2与E2F1 mRNA和蛋白表达下调。【结论】SBP对肝癌细胞SMMC7721具有增殖抑制作用,其机制可能与CDK2和E2F1表达下降有关。     

抗碳青霉烯类产酸克雷伯菌的耐药机理

【立论依据】 肠杆菌科细菌是寄居肠道的一大类正常菌群,已成为病人医院获得性感染的主要来源。产酸克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属的一个种,2011年度卫生部全国细菌耐药监测网肠杆菌科细菌耐药监测结果显示,产酸克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率在5% 以上。有研究在产酸克雷伯菌耐药基因的检测中发现了碳青霉烯酶基因blaKPC。 【设计思路】 本课题对临床抗碳青霉烯类产酸克雷伯菌染色体或质粒介导的耐药基因进行研究,初步明确菌株的耐药机理及发生院内感染的可能,为临床监测该细菌的耐药变化和预防或控制院内感染提供依据。 【实验内容】 (1)筛选耐碳青霉烯类产酸克雷伯菌菌株;(2)菌株的形态结构、生理生化和分子(16S rDNA)鉴定;(3)菌株染色体、质粒耐药基因提取克隆;(4)同或异属、种敏感和耐药菌株进行遗传物质的人为干预,推测耐药菌株发生院内感染的潜能。 【材料】 菌株来源:临床标本(痰液、血液、脑脊液等)分离得到13株耐药菌株;抗菌药物:亚胺培南、厄他培南、美罗培南纸片;培养基:营养琼脂培养基;仪器:VITEK-32全自动微生物鉴定/药物分析系统,低速高速离心机,PCR仪,电泳仪,凝胶成像系统,—20℃低温冰箱;试剂:D3H2O,PCR引物,等电聚焦电泳用聚丙烯酰胺凝胶,TaqMix(含KC1、Tris-HC1、MgC1 、dNTP混合物、Pfu DNA聚合酶、溴酚蓝、其它增强剂与稳定剂),GelRed核酸电泳染液,PCR DNA Loading Buffer(1 000 bp)。 【可行性】 (1)研究路线在理论和实践上都是可行的,相关的技术都比较成熟;(2)湖北医药学院具备所有相关实验条件;(3)本课题指导教师有20余年的微生物代谢产物及基因组研究经历,且已完成十堰地区三家三甲医院近十年来临床耐药菌株的流行病学调查和耐药性分析;(4)现已获得耐药菌株K.oxytoca,正在进行其染色体DNA携带耐药基因的筛查。 【创新性】 国内外对产酸克雷伯菌耐碳青霉烯类机理的研究刚刚起步,本课题拟提取耐药株质粒DNA,分析耐药基因,预测产酸克雷伯菌院内感染的可能。目前,国内相关报道很少,本课题为较早开展的研究。     

MNPs-exosomes联合载药系统的制备及其在肿瘤治疗中的可行性探索

【立论依据】 药物靶向输送系统在肿瘤治疗中至关重要。磁性纳米颗粒(MNPs)可在外磁场引导下使其负载药物定向于肿瘤组织,达到肿瘤化疗中低毒高效的目的。然而,它的非生物源性使它不能在体液和组织中稳定地存在。Exosomes是一种由体内多种细胞释放的、直径介于50~150纳米的微囊体。因不引起补体或凝血因子的激活,以及难以被单核巨噬细胞吞噬,故可以在体内稳定存在,也是药物的理想载体。但由于靶向性较弱,难以富集至肿瘤组织。 【设计思路】 本项目拟设计并制备MNPs-exosomes二者联合的载药系统,以达到优势互补的效果,并通过体内外实验探讨其是否具有协同效应,从而为构建肿瘤靶向给药系统提供一种新思路。 【实验内容】 (1)制备3种药物载体:MNPs、exosomes、MNPs-exosomes联合载药体;(2)将3种药物载体分别与药物结合:选用多柔比星;(3)体内外实验验证其靶向性;(4)体内外实验评价其治疗效果。 【材料】 RAW-264.7细胞、HEPG-2细胞、MNPs、四氧化三铁悬液、250nm二氧化硅粒子悬液、聚苯乙烯、甲苯。 【可行性】 本课题组已进行了制备MNPs-exosomes联合载药体的预实验,实验结果符合预期。在以往的研究中,我们已经掌握了进行上述实验所需要的技术和方法,具备一定的科研悟性和热情,可以完成此研究。 【创新性】 (1)首次提出将MNPs与exosomes联合载药,通过二者的优势互补,来观察联合体是否具有协同作用;(2)我们拟通过制作超小粒径分子筛分离提纯exosomes,避免了传统方法的弊端。     

呼吸系统感染肺炎克雷伯菌中Ⅰ类整合子基因盒的相关研究

【目的】 肺炎克雷伯菌是医源性感染的重要致病菌之一,随着临床大剂量抗生素的不规范使用,肺炎克雷伯菌多重耐药菌株日趋增多,常导致治疗的失败和病程迁延。I类整合子是肺炎克雷伯菌中分布最普遍的整合子,其携带的耐药基因盒在细菌耐药性方面起关键作用,且整合子的分布及携带的基因盒存在明显的地区差异性。目前尚未见青岛地区肺炎克雷伯菌整合子的研究报道,本研究旨在探讨I类整合子的分布、基因盒的组成及其与耐药表型的关系,明确青岛地区肺炎克雷伯菌中I类整合子及其携带的基因盒流行情况,为临床合理应用抗生素提供可靠依据。 【方法】 收集2011年至2013年青岛市立医疗集团分离鉴定的呼吸系统感染的非重复肺炎克雷伯菌82株,采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的K-B法测定细菌对16种常用抗菌药物的敏感性;提取细菌基因组DNA,PCR检测整合子保守区的整合酶基因;对保守区阳性的菌株进行可变区基因的PCR扩增,将回收纯化的PCR产物克隆至pMD18-T载体,经琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定后,重组克隆送往华大基因公司进行测序,通过在线Blast和DNA Star软件进行同源性比对分析,确定I类整合子携带的耐药基因盒。 【结果】 82株肺炎克雷伯菌对16种常用抗菌药物的耐药率为2.3%~72.1%,其中对头孢唑林、哌拉西林和头孢呋辛类药物的耐药率达60%以上;I类整合子的阳性率为76.82%,I类整合子可变区扩增片段大小从750~2 500 bp不等,测序结果显示其携带的11种基因盒主要包括编码氨基糖苷类耐药性的aad 家族(aadA1、aadA2、aadA5、aadB)、aac 家族(aacA4)、编码磺胺类耐药性的dfr家族(dfrA1、dfrA5、dfrA12)、编码氯霉素耐药性的catB8 基因及功能不明的orfF及orfC 基因,共组成7种不同的基因盒排列组合(已向GeneBank申请登录)。 【结论】 青岛地区呼吸系统感染肺炎克雷伯菌中I类整合子的阳性率较高,其携带的耐药基因盒主要赋予细菌对氨基糖苷类和磺胺类的耐药性,这些耐药基因盒的不同排列组合构成了肺炎克雷伯菌多重耐药的物质基础。     

莪术挥发油抑制人肝癌细胞株SMMC-7721生长的实验研究

[目的]探讨莪术挥发油对肝癌细胞生长抑制的作用机制。[方法]用荧光显微镜观察药物作用前后细胞形态学的变化,采用噻唑氮蓝(MTT)法检测莪术油对细胞生长的抑制作用,并用流式细胞仪检测细胞周期的阻滞及凋亡率。[结果]MTT结果表明莪术油浓度与细胞生长抑制率成正比。荧光显微镜观察结果显示,1.0mg/mL的莪术挥发油作用24h后可有效诱导肝癌细胞凋亡,细胞形态产生明显的凋亡特征,细胞核凹陷或固缩成均一的致密物。流式细胞仪检测结果表明,莪术油作用后细胞凋亡率可达28.15%,细胞周期被阻滞在S期。[结论]莪术挥发油可抑制肝癌细胞SMMC7721的生长,诱导凋亡及阻滞细胞周期是其抑制生长的重要机制。     

多重人肝癌多药耐药细胞模型的建立

目的　研究肝癌多药耐药 (MDR)机制。　方法　采用阿霉素 丝裂霉素通过药物间断 /持续接触诱导法诱导 SMMC 772 1细胞株建立一组多重人肝癌 MDR细胞模型 SMMC 772 1/ M细胞亚系。　结果　多重人肝癌MDR亚系 SMMC 772 1/ M的耐药涉及 mdr1 、MRP、L RP、Topo α和 GSTP1 基因。　结论　 SMMC 772 1/ M亚株是目前肝癌 MDR研究的较适合的模型