NHE-1反义基因对胃癌细胞的酸化作用及其意义

目的 探讨Na -H 交换泵-1(Na -H exchanger1,NHE-1)反义基因转染对人胃癌细胞内pH值(intracellular pH,pHi)的调节作用及其在肿瘤基因治疗中的价值.方法 构建人NHE-1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中, 采用荧光探针检测转染前后细胞内pH值的变化以及对细胞增殖和凋亡的影响.结果 转染反义基因的细胞pHi明显降低,增殖能力降低,细胞凋亡率增加.结论 NHE-1基因的表达在肿瘤细胞pHi及增殖和凋亡调节中起重要作用.     

NHE-1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的探讨NHE-1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)凋亡的影响.方法构建NHE-1反义RNA逆转录病毒载体,转染体外培养的大鼠PASMC,应用半定量RT-PCR法(sqRT-PCR)测定细胞内NHE-1 mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测(TUNEL法)观察细胞凋亡情况.结果转染NHE-1反义RNA逆转录病毒载体的细胞,NHE-1 mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低,细胞凋亡率显著增加,电镜示细胞凋亡,凋亡小体形成.结论抑制NHE-1可通过引起细胞内酸化,诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡.     

NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）凋亡的影响。方法 构建NHE-1核酶基因逆转病毒载体,转染体外培养的大鼠PASMC,应用半定量RT-PCR法（sqRT-PCR）测定细胞内NHE-1 mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测（TUNEL法）观察细胞凋亡情况。结果 转染NHE-1核酶基因的细胞,NHE-1 mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低,细胞凋亡率显著增加,电镜示细胞凋亡,凋亡小体形成。结论 NHE-1核酶基因转染可通过NHE-1抑制、细胞内酸化,显著诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。     

钠氢交换蛋白-1在心血管疾病中的作用分析

钠氢交换蛋白(sodium hydrogen exchanger,NHE)是一类存在于细胞膜表面的离子转运泵蛋白家族,NHE-1亚型是NHE家族中最具特征性结构的一类.它负责将细胞内H~+与细胞外Na~+按照1: 1的比例进行交换来调控细胞内pH的动态平衡,从而影响细胞的容积、运动、分化、凋亡、营养吸收以及生长增殖等,进而参与许多复杂的生理和病理过程.本文综述了其在心力衰竭、冠心病、高血压、先天性心脏病以及心律失常等的发生、发展及演变过程中的重要作用.     

锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性的影响

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ 交换器（NHE）-1表达和活性，pHi的影响。方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达，pHi和Na^ /H^ 交换活性变化。结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE-1mRNA表达减少，Na^ /H^ 交换活性降低，同时伴有pHi降低。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE-1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化。     

人肺癌细胞NHE-1基因部分正调控序列的克隆

目的 克隆人肺癌细胞Na∧ /H∧ 交换泵-1（NHE-1）基因上游正调控序列部分,为进一步将该片段导入肺癌细胞株,竞争性结合转录因子,达到抑制细胞内NHE-1基因的表达奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中扩增长约170bp的NHE-1基因调控序列中起正调控作用的片段。在上、下游引物的5′-端带上BanHI和EcoRI酶切位点。然后将该片段连接到pUC18载体上,最后对产生的重组子进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 经酶切及PCR鉴定,所克隆的目的片段大约为180bp,而NDA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的的片段,长度为168bp,与报道的序列比较缺失2个t。结论 本实验已成功地克隆了人肺癌细胞NHE-1基因调控序列中正调控序列片段。     

人NHE-1基因miRNA干扰载体构建、鉴定及干扰效应评价

目的构建人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）基因的miRNA特异性干扰表达载体并转染293细胞,筛选其有效性。方法设计4对miRNA oligo,依次通过退火、连接,构建含NHE-1前体miRNA的重组干扰质粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和阴性对照质粒pcDNATM 6.2-GW/neg-miR,并转染293细胞,经Re-al-Time PCR评价干扰效应,筛选出干扰效应最佳的靶序列。结果测序证实目的片段正确插入载体中,成功构建4个人NHE-1基因miRNA干扰载体;Real-Time PCR证实完成干扰效应评价,并根据NHE-1基因转录调控区及其蛋白分子结构功能区评价结果,得到NHE1-4是最佳干扰片段。结论成功构建针对人NHE-1基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续NHE-1基因腺病毒miRNA表达载体的构建及其在调控APP裂解相关酶类的功能研究奠定了基础。     

NHE-1蛋白和V-ATPase在胃癌及癌前病变组织中的表达及临床意义

目的探讨Na+/H+交换蛋白-1（NHE-1）蛋白和空泡型质子ATP酶（V-ATPase)在胃癌和癌前病变组织中的表达及其临床意义。方法收集2014年1月至2019年12月在温州市中西医结合医院行胃镜检查时采取的胃黏膜组织标本及行胃癌手术采取的胃癌组织标本320例。采用免疫组化SP法检测NHE-1蛋白和V-ATPase的表达,分析NHE-1蛋白和V-ATPase在胃癌和癌前病变组织中的表达差异、与胃癌临床病理特征的关系、两者表达的相关性及对胃癌患者预后的影响。结果胃癌组织中NHE-1蛋白及V-ATPase的阳性表达率均高于癌前病变组织,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。胃癌组织中NHE-1蛋白及V-ATPase的表达与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度均无关（均P＞0.05）,但与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期均有关（均P＜0.05）。Spearman等级相关分析显示胃癌组织中NHE-1蛋白表达和V-ATPase表达呈正相关（r=0.299,P＜0.05）。NHE-1蛋白表达阴性组、弱阳性组和强阳性组胃癌中位生存时间比较差异有统计学意义（P＜0.05）,V-ATPase表达阴性组、弱阳性组和强阳性组胃癌中位生存时间比较差异有统计学意义（P＜0.05）,NHE-1蛋白和V-ATPase均表达组、NHE-1蛋白表达组、V-ATPase表达组和NHE-1蛋白和V-ATPase均不表达组胃癌中位生存时间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论胃黏膜组织中NHE-1蛋白和V-ATPase过表达可能导致胃癌的发生和发展。     

Na+/H+交换器在缺氧性肺动脉高压中的作用

目的:探讨Na+/H+交换器(NHE)在缺氧性肺动脉高压大鼠模型肺动脉平滑肌细胞中的表达.方法:30只Wistar大鼠,随机分为3组,分别为:正常对照组,缺氧3周组和缺氧8周组.分离肺动脉平滑肌,测定细胞内pH(pHi),并提取总RNA,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,比较各组中NHE-1 mRNA的表达.结果:缺氧组肺动脉平滑肌细胞pHi较正常对照组显著增高(P<0.01),NHE-1 mRNA表达也显著高于正常对照组(P<0.01),缺氧两组间差异不显著.结论:Na+/H+交换器参与调节肺动脉平滑肌细胞pHi,从而在缺氧性肺动脉高压形成和发展中可能起重要的作用.     

人NHE-1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的构建人Na -H 交换蛋白-1(Na -H exchanger-1,NHE-1)基因反义真核表达载体.方法采用分子克隆技术,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶从NHE-1cDNA pEAP切下所需目的片段,然后将该片段反向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)/Zeo的多克隆位点,最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,将目的片段成功的连接到pcDNA3.1(-)/Zeo载体上.结论成功地将NHE-1目的片段反向插入到pcDNA3.1(-)/Zeo中,构建了人NHE-1反义表达真核载体hNHE-1.     

先心病肺高压患者肺组织中NHE-1 mRNA的表达变化及其意义

目的:检测肺组织中钠氢交换体1型(NHE-1) mRNA的表达变化,初步探讨引起先天性心脏病(先心病)肺动脉高压(肺高压)的机制.方法:先心病手术病例分为无肺高压组(12例,sPAP<3.99 kPa)和伴肺高压组(9例, sPAP≥3.99 kPa),以正常普胸手术病例(6例)为对照.标本取自右肺中叶,切片H-E染色作病理检查,采用 Northern 印迹法检测标本中NHE-1 mRNA的表达.结果:先心病患者肺组织中NHE-1 mRNA的表达水平均显著高于对照组(P<0.01),而先心病伴肺高压组又显著高于无肺高压组(P<0.05).结论:(1)NHE-1 mRNA表达水平增高早于肺动脉压力的变化及肺血管平滑肌的增殖;(2)NHE-1 mRNA 表达水平增高,通过蛋白数量的增加来调节工作效率,可能是先心病异常的肺血流引起肺小血管中层增厚、肺高压形成的一个原因.     

人肺癌细胞转录因子--C/EBP和HMG样蛋白的EMSA检测

目的：检测人肺癌细胞中是否存在与Na^ /H^ 交换蛋白-1（NHE-1）基因转录相关的重要转录因子--C/EBP和HMG样蛋白。方法：采用电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测人肺癌细胞株核蛋白中C/EBP和HMG样蛋白的表达及其水平。结果：EMSA检测到A549细胞和转染NHE-1反义载体的A549细胞均有转录因子C/EBP和HMG样蛋白的表达，且后者表达水平高于前者；采用50倍未标记的片段能完全抑制相应转录因子与^32P标记的相同片段的结合。结论：A549细胞核蛋白中存在能与C/EBP结合序列和Poly(dA：dT)区结合的转录因子，即C/EBP和HMG样蛋白，后者的表达水平高于前者。特异性竞争抑制试验表明外源性特异DNA片段能抑制相同片段与转录因子的结合。     

缺血和再灌注心肌NHE－1mRNA表达的变化

目的探讨缺血再灌注心肌钠氢交换蛋白-1(NHE-1)mRNA表达的变化.方法成年大鼠心脏Langendorff离体灌流,随机分为六组(n=6),给予(1)正常灌流30min;(2)低灌流缺血60min;(3)低灌流缺血60min及再灌注30min;(4)预处理后低灌流缺血60min(5)预处理后低灌流缺血60min再灌注30min;(6)老龄大鼠离体心脏低灌流缺血60min等不同条件处理.保留心肌,使用RT-PCR方法对比不同处理条件下心肌NHE-1表达的变化.结果(1)缺血组心肌(Ⅰ)NHE-1mRNA水平(0.734±0.053)较正常对照组(N)(0.300±0.007)明显升高(P＜0.05),再灌注组心肌(R)NHE-1的mRNA水平(0.281±0.019)较缺血组降低(P＜0.05),与正常组无明显差异(P＞0.05);(2)预处理缺血组心肌(Pi)NHE-1 mRNA水平(0.256±0.011)较缺血组心肌(0.734±0.053)明显降低(P＜0.05),预处理再灌注组心肌(Pr)NHE-1 mRNA水平(0.135±0.011)较再灌注组心肌(0.281±0. 019)降低(P＜0.05);(3)老龄大鼠低灌流缺血心肌(S)NHE-1的mRNA表达(0.787±0.021)与成年大鼠低灌流缺血心肌(Ⅰ)NHE-1的mRNA表达无明显统计学差异.结论低灌流缺血心肌NHE-1表达较正常灌流心肌明显升高,预处理可以明显降低缺血及再灌注心肌NHE-1的表达.     

医源性高血压的发生和防治

医源性高血压是由药物本身的药理作用和/或毒理作用或药物之间的相互作用或用药方法不当引起的高血压,是抗药性高血压的重要原因。本文就引起医源性高血压的常见药物及其发生机制和防治做一简要综述。1　增加细胞外液的药物1.1　含钠药物[1]　钠在高血压发生中的重要作用已得到肯定。细胞外液钠离子浓度升高,可使细胞外液增加;细胞内液钠离子浓度增高,一方面降低细胞膜静息电位,增加平滑肌细胞对缩血管物质的敏感性,另一方面过高的钠离子可抑制细胞膜ATP酶的活性,使Na -Ca交换减少,细胞内钙离子浓度增高,而钙离子是平滑肌细胞兴奋-收缩耦…     

Na+/H+交换蛋白-1基因调控人肺癌细胞酸碱平衡和凋亡的研究

除基因调控模式外 ,细胞内环境稳定失衡 ,如 :细胞内氢离子浓度的异常增高也可促发细胞凋亡[1] 。Ｎａ /Ｈ 交换蛋白 1(ＮＨＥ 1)是使肿瘤细胞内ｐＨ(ｐＨｉ)维持在中性或偏碱性、细胞外ｐＨ呈酸性这种特殊微环境的主要调节者 ,而这种微环境有利于肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[2 ,3] 。另外 ,我们的研究结果表明[4 ,5] ,人肺癌组织细胞ＮＨＥ 1ｍＲＮＡ的表达显著增强。因此 ,ＮＨＥ 1基因的过表达可能在肿瘤细胞的抗凋亡特性中起着重要作用。为此 ,我们采用反义核酸抑制人肺鳞癌 (ＳＰＣ)细胞ＮＨＥ 1基因的表达 ,研究ＮＨＥ 1基因对人肺…     

核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性及细胞增殖的作用

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ ’交换器-1表达和活性、pHi的影响，及其与细胞增殖的关系.方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达、PHi、pHi恢复速率、^22Na摄取量和^3H—TdR掺入量变化.结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE—1 mRNA表达、^22Na摄取量减少，同时伴有pHi降低、pHi恢复速率下降和^3H—TdR掺入量减少。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE—1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。     

离体SH-SY5Y细胞内酸化对早老素-1表达的影响

目的研究早老素-1(PS1)在细胞内pH值降低时的表达情况,探讨细胞内pH值变化对γ-分泌酶活性的影响。方法本研究抑制细胞表面酸碱调节基因Na+-H+交换泵第一亚型(NHE1)的表达和酸化培养基,使细胞内pH值降低,构建细胞内酸化的SH-SY5Y细胞模型,将实验对象分为正常组、阴性对照组、NHE1组和酸化培养基组,应用ELISA法及western blot-ting,检测各组PS1的蛋白浓度及表达,分析细胞内pH值变化对PS1表达和活性的影响及其与γ-分泌酶的关系。结果检测胞膜离子交换蛋白NHE1组和酸化培养基组细胞内的PS1活性和蛋白表达较正常对照组和阴性对照组有显著增高(P<0.05),而NHE1组和酸化培养基组组间比较无明显差异,正常对照组和阴性对照组组间比较也无明显差异。结论细胞内pH值降低可促使PS1表达量增加,活性增高,提示细胞内pH值降低可能促使γ-分泌酶活性增高。     

钠氢交换体1与心血管疾病关系研究进展

作为一种分布在细胞膜表面的蛋白,钠氢交换体1(NHE1)参与调节细胞内的pH值和细胞容积,并且可随着细胞机能状态的变化而进行自我调节。在细胞缺血、缺氧、酸中毒等情况下,NHE1被激活,进一步导致细胞内Na+潴留,Na+-Ca2+交换加强,细胞内Ca2+增加,细胞内钙超载导致心肌组织损伤,这一病理生理变化参与了多种心血管疾病的发生、发展。     

心肌细胞内的Cl-/HCO3-交换蛋白及其在实验性心肌缺血损伤中的作用

心肌细胞中存在阴离子交换蛋白(AE),其主要作用是转运Cl-/HCO3-,调节细胞内PH和细胞内[Cl-].文献表明AE1、AE2、AE3在心肌细胞mRNA水平均有表达,但在蛋白水平上表达的主要有nAE1和cAE3.缺血条件下,心肌细胞膜上Cl-/HCO3-交换蛋白可激活,导致[Cl-]i增加与酸中毒,造成心肌细胞损伤.除去细胞外Cl-或运用Cl-阻断剂,多种原因诱导的再灌注性心律失常发生率显著降低,表现出较好的抗心律失常作用.     

钠钙离子交换体介导的钙超载对造影剂诱导NRK52E细胞损伤的影响

目的:本研究探讨钠钙离子交换体(NCX)是否参与了造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤及反向模式钠钙离子交换体抑制剂KB-R7943对造影剂诱导的肾小管上皮损伤的影响。方法:鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)被分成6组:正常对照组、造影剂组、甘露醇组、钙离子拮抗剂(CCB)组、KB-R7943(10-5mol/L)和KB-R7943(10-6mol/L)组。造影剂作用1 h后,细胞损伤采用LDH检测,细胞形态变化及细胞凋亡分别由倒置显微镜和流式细胞仪检测;细胞内钙采用共聚焦微镜测定;钠钙离子交换体mRNA表达采用RT-PCR测定。结果:造影剂作用1 h后,细胞损伤、细胞凋亡、细胞内钙进行性增加,显著高于相同渗透压甘露醇组;KB-R7943显著改善了上述异常,且较相同浓度CCB具有更好的效果并显示出剂量效应;钠钙离子交换体mRNA表达没有变化。结论:经反向模式钠钙离子交换体导致的细胞内钙超载参与了造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤;反向模式钠钙离子交换体抑制剂KB-R7943以呈剂量方式对造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。