凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

原发性肝细胞癌中血管生成拟态表达的临床意义及其与MMP-9、Ki-67的关系

【目的】 检测血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)在原发性肝细胞癌(hepatoeellular carcinoma,HCC)中的表达与分布情况,探讨其与HCC临床病理学特征及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和增殖细胞核抗原Ki-67表达水平的关系。 【方法】 收集HCC患者病例资料保存完整的石蜡组织标本87例, 所有标本均经过病理确诊为HCC组织类型病例。采用CD34和过碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)双重染色法判定HCC标本中VM的表达、形态与分布,并分析其与HCC组织类型、Edmondson病理分级、TNM临床分期、远处转移等临床病理学特征的关系;通过免疫组织化学检测肿瘤组织中MMP-9和Ki-67的表达情况,分析HCC组织中VM分布与MMP-9及Ki-67表达的相关性。 【结果】 HCC中存在有35.63%(31/87)的病例存在VM,且出现肿瘤细胞型和细胞外基质型两种组织学类型;VM呈阳性的HCC病例更易发生远处转移(P<0.05),Edmondson 分级中Ⅰ、Ⅱ级HCC标本的VM阳性率低于Ⅲ、Ⅳ级HCC标本(P<0.05);此外,VM的阳性表达率还与肿瘤组织的MMP-9及Ki-67表达密切相关。 【结论】 HCC组织存在VM,VM的表达与HCC的组织分化程度、远处转移紧密相关,且MMP-9、Ki-67可能参与VM的形成。     

3-取代雌二醇-嘧啶类衍生物的合成与抗肿瘤活性

以雌二醇为原料,在K₂CO₃碱性条件下,与二溴烷烃反应生成醚类化合物,继而与尿嘧啶或胸腺嘧啶反应,共合成16个新型3-取代雌二醇-嘧啶类衍生物(化合物5~20),并采用MTT法对其进行抗肿瘤活性测试。结果表明,这些化合物对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231、人卵巢癌SKOV-3、人肺癌NCI-H460和人胃癌MGC-803细胞株表现出不同程度的抑制活性。其中,连接链长为2的尿嘧啶单接产物5和双接产物6、连接链长为8的尿嘧啶单接产物17、连接链长为2和6的胸腺嘧啶双接产物8和16对MCF-7具有良好的增殖抑制活性;化合物5和6对MDA-MB-231细胞株具有较好的增殖抑制活性;化合物17同时对SKOV-3细胞株也呈现优良的增殖抑制活性。连接链长为6的尿嘧啶单接产物13对MGC-803细胞株的增殖抑制率最高。总之,3-取代的雌二醇-嘧啶类衍生物对MCF-7细胞株的增殖抑制活性要优于其他受试肿瘤细胞株。3-取代雌二醇-尿嘧啶衍生物比3-取代雌二醇-胸腺嘧啶衍生物具有更好的抗肿瘤细胞增殖活性。     

去乙酰化修饰调控瘦素诱导乳腺癌细胞增殖的分子机制

【目的】 研究去乙酰化修饰在瘦素(Leptin)诱导的乳腺癌细胞增殖过程中的调控作用。 【方法】 应用MTT法测定Leptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的诱导作用,并测定乳腺癌细胞活力、侵袭力及细胞周期的变化情况;实时定量PCR、蛋白质印迹法测定Leptin诱导后MDA-MB-231细胞周期关键因子及相关酶的表达情况;染色质沉淀法(ChIP)检测Leptin作用MDA-MB-231细胞后核心组蛋白H3、H4乙酰化水平变化情况。 【结果】 Leptin诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖呈现时间和剂量依赖性,1.25 nm (20 mg/mL)、24 h为Leptin最佳作用浓度和孵育时间;经Leptin处理后,乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡明显减少、活力增强,同时由G₁进入S期的细胞显著增多;荧光显微镜观察发现Leptin诱导后BrdU荧光染色增强,且主要集中在MDA-MB-231细胞核内;Transwell小室侵袭实验也显示细胞侵袭力增强;实时定量PCR及蛋白质印迹法检测 发现Leptin处理后的 MDA-MB-231细胞中与G₁/S 期限制点调控相关的细胞周期调控因子CDK2、cyclin E1以及与抑制细胞凋亡有关的Bcl-2均显著增加,细胞中HDAC酶活性增强,且与细胞周期G₁/S 期调控密切相关的HDAC1 mRNA及蛋白表达水平也明显增强;ChIP 实验发现Leptin处理后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中GAPDH 启动子区域核心组蛋白乙酰化水平显著降低,而经HDAC抑制剂SAHA阻断后MDA-MB-231细胞p21WAF 1/CIP 表达水平显著提高。 【结论】 Leptin通过HDAC1的去乙酰化修饰抑制p21WAF 1/CIP的表达,激活细胞周期关键因子CDK 2、cyclin E1的表达,从而加速乳腺癌细胞周期G₁/S 期的进程。     

激活AMPK对心肌纤维化的保护作用及其机制的研究

【立论依据】 心肌纤维化的治疗一直是困扰着国民的一大难题。心肌纤维化主要表现为:心脏重量、容积增加及形态的改变。初始阶段这种改变还能维持有效的心脏功能。长期纤维化,会导致心脏顺应性降低,最终导致心力衰竭发生。因此,如何抑制心肌纤维化的发生是改善心功能,是避免心力衰竭的关键。但是,目前临床上对心肌纤维化的治疗仍不能令人满意。心肌纤维化的主要病理改变之一,是心肌成纤维细胞(CF)的过度增殖。所以,控制心肌纤维化的关键,就是控制成纤维细胞的增殖。抑制成纤维细胞的增殖,我们就必须从成纤维细胞的细胞周期寻求突破点。正常细胞分化周期可分为G₁、S、G₂、M四个时期。其中影响细胞进程的关键时期,是G₁期向S期转化和G₂期向M期转化。目前,研究最多的是G₁期向S期转化,其过程主要是关键蛋白Rb,进而激活转录因子E2F,完成细胞由G₁期向S期的转化。Rb蛋白可由cyclinE-等复合体激活。而上述复合体又可被P21、P27、P53等蛋白抑制。所以,本实验拟cyclinE-CDK2复合体、P21、P27、P53途径对CF增殖周期进行探讨。 【设计思路】 近年来有研究发现,激活AMPK不仅具有细胞能量调节作用,同时也具有抑制内皮细胞增殖的作用。主要是通过抑制内皮细胞由G₁期向S期转化,最终抑制内皮细胞增殖。进一步研究显示,AMPK在心肌成纤维细胞中也有表达。那么激活AMPK能否抑制CF增殖及其发生的机制是本课题研究的重点。 【实验内容】 分为在体实验和离体实验。在体部分主要是在活体小鼠上探究注射AMPK的激动剂和阻断剂观察CF的增殖情况。离体实验分为三部分,分别验证激活AMPK对CF增殖的抑制作用;激活AMPK对CF周期蛋白的调节作用;激活AMPK抑制CF增殖通过P21、P27周期蛋白途径。 【材料】 AICAR,CompoundC,cyclinA抗体,cyclinD1抗体,cyclinE抗体,cyclinB抗体,CDK2抗体,P21抗体,P27抗体,P53抗体,小白鼠 【可行性】 本实验室硬件设施完善,能够达到实验中涉及到的蛋白质印迹,流式细胞仪技术,细胞计数,ELISA,MTT等技术要求。 【创新性】 该课题致力于研究激活AMPK在CF增殖中起到的调节作用,并且为临床上治疗心肌纤维化提供了新的靶点。     

靶向/促穿膜双功能肽介导的肿瘤靶向基因递送系统的构建及其抗肿瘤作用研究

【立论依据】 基因治疗(gene therapy)现已成为攻克肿瘤最具潜力,也是研究最活跃的领域,许多学者为基因治疗能成功应用于临床进行了大量相关研究。要成功地实施基因治疗,必须具备3个关键因素:针对性的治疗基因;基因传递系统;基因表达调节系统。基因传递系统是基因治疗的核心技术,而转染效率与细胞毒性相矛盾、稳定性与穿膜能力相矛盾以及靶向性差,是基因递送系统存在的3个关键问题。本课题旨在为肿瘤的基因治疗寻找到一种兼具高转染效率、高肿瘤细胞和组织特异靶向性及良好安全性和体内外稳定性的基因递药系统。 【设计思路】 首选通过将低分子量聚乙烯亚胺(LMW-PEI)连接到能形成单分子聚合物胶束的普朗尼克(Pluronic)表面,制得PEI衍生物;然后采用固相法合成兼具靶向和促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),其中DR5短肽对正常细胞无毒副作用、对肿瘤细胞具有高特异性和高选择性且自身具有抗肿瘤活性,TAT是具有促细胞穿膜作用的穿膜肽;再利用SMCC法将D21与Pluronic-PEI偶联,构建肿瘤靶向纳米基因载体递送系统(D21-Pluronic-PEI),并对其体内外性能进行评价。 【实验内容】 (1) Pluronic-PEI的合成,DNA/Pluronic-PEI纳米胶束的制备及其性能考察;(2) D21-Pluronic-PEI的构建及其性能考察; (3)载p53的靶向纳米非病毒基因给药系统 (p53/D21-Pluronic-PEI)的制备及其体内靶向特性和抗肿瘤效果评价 【材料】 分支状聚乙烯亚胺Pluronic 123 (Mw=2000 Da),DR5短肽,细胞穿膜肽TAT,p53等。 【可行性】 项目组有一定的专业基础,具有较强的创新意识和研究探索精神,具备开展该项目的素质与能力。该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,具有可靠的实施条件,可以保证该训练计划实施成效。项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题拟采用不同PO/EO比的Pluronic连接低分子量PEI,并在此基础上合成具有可实现肿瘤靶向和具促穿膜作用的双功能短肽DR5-TAT(D21),将其与所得的PEI衍生物偶联,得到高效、低毒的新型基因靶向载体系统 (D21-Pluronic-PEI),该研究国内外尚未见报道。(2)重组人p53腺病毒注射液已应用于临床,但该药选择的载体为病毒基因载体-5型腺病毒,本课题拟采用高效,低毒且可主动靶向肿瘤细胞的新型聚阳离子载体系统(D21-Pluronic-PEI)作为p53载体,拟为p53的应用开辟新途径,国内外未见相关报道,具有潜在的应用价值。     

槲皮素烃基化衍生物的合成及其促MCF-7细胞凋亡作用的研究

【目的】 槲皮素具有一定的抗肿瘤活性并且毒性较低,具有良好的应用前景,但因溶解性差,不易吸收,影响了其开发和利用。本研究以槲皮素为原料,合成一系列烃基化衍生物,并考察这些衍生物对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及可能的机制。 【方法】 将槲皮素进行乙酰化保护,在乙腈中以不同试剂烃基化,产物经重结晶和柱层析法纯化,以MS、¹HNMR、¹³CNMR、NOESY进行产物分子量测定及结构表征。测定各产物在DMEM培养基中的溶解度,选取溶解度较好的产物,以MTT法测定其对MCF-7 细胞增殖率的影响,以HPLC法测定其在MCF-7细胞中浓度随时间的变化。选取IC50较小的产物,分别以AV-PI双染-流式细胞术、DAPI染色、DNA片段化分析考察其对MCF-7细胞的促凋亡作用。分别经DCFH-DA染色和JC-1染色测定衍生物对MCF-7细胞中ROS生成量及线粒体膜电位的影响,MTT法测定ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸及广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对衍生物促凋亡作用的影响,以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白在MCF-7细胞中的表达。 【结果】 对槲皮素烃基化得到了7种衍生物,其中,7-O-丁基槲皮素(BQ)和 7-O-香叶基槲皮素(GQ)在DMEM中的溶解度均大于100 μmol/L,对MCF-7细胞的IC50分别为(22.6±2.2) μmol/L、(43.5±2.1) μmol/L。BQ及GQ在MCF-7细胞中的蓄积浓度比高于槲皮素数倍,且在细胞中停留的时间更长,对MCF-7的促凋亡作用明显强于槲皮素。作用机制研究表明,BQ及GQ对MCF-7细胞的促凋亡作用是由AIF及Endonuclease G引起的caspase非依赖性凋亡导致的。 【结论】 以槲皮素为原料获得的烃基化衍生物BQ和GQ显示出较好的溶解性和对MCF-7细胞的促凋亡活性,为槲皮素衍生物的研究开发奠定了基础。     

MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

新型氟康唑类似物合成及抗真菌活性研究

【目的】 槲皮素具有一定的抗肿瘤活性并且毒性较低,具有良好的应用前景,但因溶解性差,不易吸收,影响了其开发和利用。本研究以槲皮素为原料,合成一系列烃基化衍生物,并考察这些衍生物对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及可能的机制。 【方法】 将槲皮素进行乙酰化保护,在乙腈中以不同试剂烃基化,产物经重结晶和柱层析法纯化,以MS、¹HNMR、¹³CNMR、NOESY进行产物分子量测定及结构表征。测定各产物在DMEM培养基中的溶解度,选取溶解度较好的产物,以MTT法测定其对MCF-7 细胞增殖率的影响,以HPLC法测定其在MCF-7细胞中浓度随时间的变化。选取IC50较小的产物,分别以AV-PI双染-流式细胞术、DAPI染色、DNA片段化分析考察其对MCF-7细胞的促凋亡作用。分别经DCFH-DA染色和JC-1染色测定衍生物对MCF-7细胞中ROS生成量及线粒体膜电位的影响,MTT法测定ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸及广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对衍生物促凋亡作用的影响,以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白在MCF-7细胞中的表达。 【结果】 对槲皮素烃基化得到了7种衍生物,其中,7-O-丁基槲皮素(BQ)和 7-O-香叶基槲皮素(GQ)在DMEM中的溶解度均大于100 μmol/L,对MCF-7细胞的IC50分别为(22.6±2.2) μmol/L、(43.5±2.1) μmol/L。BQ及GQ在MCF-7细胞中的蓄积浓度比高于槲皮素数倍,且在细胞中停留的时间更长,对MCF-7的促凋亡作用明显强于槲皮素。作用机制研究表明,BQ及GQ对MCF-7细胞的促凋亡作用是由AIF及Endonuclease G引起的caspase非依赖性凋亡导致的。 【结论】 以槲皮素为原料获得的烃基化衍生物BQ和GQ显示出较好的溶解性和对MCF-7细胞的促凋亡活性,为槲皮素衍生物的研究开发奠定了基础。     

维生素E经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路抑制oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤

【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。     

灭活仙台病毒Tianjin株诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制的研究

【目的】 研究紫外线灭活复制缺陷的仙台病毒Tianjin株致人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制。 【方法】 首先制备并鉴定紫外线灭活仙台病毒Tianjin株,然后用不同剂量灭活病毒感染MDA-MB-231细胞,24 h后,MTT法检测灭活病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响;Hoechst染色及AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡情况;JC-10染色流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞线粒体膜电位变化;分光光度法测定MDA-MB-231细胞内caspase-9、-8和-3活性;蛋白质印迹法检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cyt c、caspase-9、Fas、FasL、caspase-8和caspase-3蛋白表达水平。 【结果】 MTT检测显示灭活Tianjin株能够抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性;Hoechst染色发现灭活病毒感染的MDA-MB-231细胞有明显形态学改变,细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染;AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测显示灭活病毒组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高,JC-10染色流式细胞仪分析显示灭活病毒组细胞线粒体膜电位呈剂量依赖性降低,且与对照组比较均有统计学差异(P<0.01);caspase 活性检测显示灭活病毒组caspase-9、-8和-3活性均呈剂量依赖性升高, 与对照组比较有统计学差异(P<0.01);蛋白质印迹结果显示高剂量灭活病毒组(MOI 80)Bcl-2表达下调,Bax、Cyt C、Fas、FasL、活化caspase-9、-8和-3表达上调。 【结论】 灭活仙台病毒Tianjin株能够诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞发生剂量依赖性凋亡,其机制与线粒体内源性途径和死亡受体外源性途径密切相关。     

SIRT3对乳腺癌干细胞衰老影响及机制的研究

【立论依据及设计思路】 乳腺癌干细胞是一类具有较强自我更新能力与分化潜能的癌细胞,在肿瘤形成和复发中起重要作用。衰老是细胞、机体成熟后,随年龄增加,自身结构组分逐步退变、趋向死亡的现象。促进乳腺癌干细胞衰老,可抑制其增殖分化。SIRT3是组蛋白去乙酰化酶之一,可调控干细胞衰老相关基因的表达。有研究显示,SIRT3在乳腺癌干细胞中高表达,但其对乳腺癌干细胞衰老的影响及机制未明。我们猜测SIRT3可通过增强ROS清除酶活性,抑制ROS的蓄积,从而阻碍乳腺癌干细胞衰老。本研究拟在乳腺癌干细胞中沉默、过表达SIRT3,探究SIRT3对乳腺癌干细胞衰老的作用,并利用免疫共沉淀等技术,阐明其中机制。 【实验内容】 (1)体外实验:构建过表达、沉默SIRT3的乳腺癌干细胞稳定细胞系,检测ROS及相关基因的表达量,同时检测细胞衰老状态,利用免疫共沉淀及质谱技术研究其机制;(2)体内实验:过表达、沉默SIRT3的乳腺癌干细胞稳定细胞系体内成瘤,获得成瘤实验标本,检测ROS及相关基因的表达量、细胞衰老状态;(3)临床研究:获取临床乳腺癌样本,研究SIRT3表达量与乳腺癌干细胞数量、乳腺癌患者生存率及生存时间的相关性。 【材料】 临床乳腺癌组织标本、Balb/c裸鼠、乳腺癌细胞系MCF7等。 【可行性】 已有研究证实SIRT3可调控干细胞衰老相关基因;现有研究提示,SIRT3在乳腺癌干细胞中高表达;本小组及所在实验室长期致力于肿瘤干细胞研究,具备相关经验、技术、设备,所以本研究从理论、人员、实验技术、实验条件上都是可行的。 【创新性】 从SIRT3的角度探究乳腺癌干细胞的衰老机制,成果可为防治乳腺癌提供新靶点。     

新型5-氨基-2-(苄基硫代)噻唑-4-甲酰胺类化合物的设计、合成及抗肿瘤活性

为了寻找具有更好抗肿瘤活性的化合物,设计合成了一系列5-氨基-2-(苄基硫代)噻唑-4-甲酰胺衍生物。以2-氨基-2-氰基-乙酰胺为起始原料,合成了16个化合物DDO-5401~DDO-5416;目标化合物结构经IR、¹H NMR和ESI-MS确证;采用MTT法对目标化合物进行5株肿瘤细胞(HCT116、HepG2、A549、MDA-MB-231、MCF-7)体外抗肿瘤活性测定。合成的化合物对肿瘤细胞尤其是A549细胞表现出了良好的抑制活性;构效关系研究表明,苯环上连有给电子基团的化合物抑制活性要好于连有吸电子基团的化合物。化合物DDO-5413的抑制活性最强,对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7抑制活性好于阳性对照药达沙替尼,值得进一步研究。     

Raf-1对Hippo通路的调节及其对胃癌细胞生长凋亡的影响

【立论依据】 Raf-1蛋白激酶是络氨酸激酶相关的信号传导途径中的重要信号分子, Hippo通路调节细胞的生长、增殖与凋亡,被认为与人体多种肿瘤的发生存在紧密联系;近年来有研究表明Raf-1可能通过与Hippo通路核心分子MST2结合从而调控细胞的凋亡;我们希望通过研究胃癌细胞中Raf-1与Hippo通路的联系,为肿瘤诱导分化的临床应用提供一些新思路。 【设计思路】 建立对照组;检测Raf-1分子对胃癌细胞凋亡情况的影响;检测Raf-1对Hippo通路核心分子的影响。 【实验内容】 选择不同分化程度的胃癌细胞株进行培养;采用Raf-1蛋白阻断剂阻断部分细胞的Raf-1表达,蛋白质印迹法检测阻断情况;流式细胞术检测不同浓度阻断剂处理后胃癌细胞的凋亡情况;CCK法描绘阻断后胃癌细胞与未经特殊处理胃癌细胞的生长曲线; 蛋白质印迹法检测阻断剂处理后胃癌细胞中Hippo通路核心分子MST2的表达水平变化。 【材料】 胃癌细胞株BCG823,SGC7901;Raf-1蛋白阻断剂Forskolin;MST2及Raf-1抗体;CCK试剂盒;细胞凋亡与坏死试剂盒。 【可行性】 Raf-1以及Hippo信号通路均已被证实在肿瘤细胞的凋亡中发挥重要作用;目前已有研究支持在部分肿瘤细胞中Raf-1与MST2活性间存在关联;实验器材及细胞株均由实验室及瑞金医院消化科提供。 【创新性】 目前对Raf-1相关信号通路的研究多集中于MEK/MAPK信号通路,而对其在其他信号通路中的作用机制的研究尚不完全成熟;在Raf-1对Hippo通路影响的研究中,国外多采用肝癌细胞作为研究对象,我们选择不同分化程度的胃癌细胞进行研究,以观察Raf-1对不同分化程度的肿瘤细胞的影响,希望能进一步探究Raf-1在肿瘤发生、发展中的作用。     

尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响

目的： 研究尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因转染对人肺腺癌细胞系H1299(p53基因缺失)的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,采用荧光显微术、RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞内绿色荧光蛋白(GFP)、wt-p53 mRNA和蛋白的表达,并通过MTT法分析基因转染对细胞的生长抑制作用,DAPI染色法和琼脂糖凝胶电泳法评价其对细胞的诱导凋亡作用。结果： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,大量细胞表达GFP,细胞内wt-p53 mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞生长受到显著地抑制,凋亡细胞数量明显增加,并有清晰的DNA梯状条带出现。结论： UAC介导wt-p53基因转染能够显著地抑制人肺腺癌细胞系H1299的增殖,并诱导其凋亡。     

mTOR高选择性抑制剂AZD8055对乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株化疗敏感度的作用

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）高选择性抑制剂AZD8055对乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株化疗敏感度的作用。方法 体外培养MCF-7细胞株、MCF-7/Doc细胞株。噻唑蓝比色法检测AZD8055作用后MCF-7/Doc细胞对多西紫杉醇的半数抑制浓度（IC₅₀）,实验分2组：MCF-7/Doc组和MCF-7/Doc+AZD8055组。实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测AZD8055作用后,细胞MDR1基因和P-gp蛋白的表达,实验分4组：MCF-7组、MCF-7+AZD8055组、MCF-7/Doc组、MCF-7/Doc+AZD8055组。裸鼠体内荷瘤实验检测AZD8055的体内抑瘤率,实验分3组：空白对照组、阴性对照组和AZD8055组。为排除MCF-7和MCF-7/Doc细胞特异性对实验结果的影响,研究采用乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-231/Doc细胞株重复了上述实验。结果 噻唑蓝比色法检测显示,MCF-7/Doc+AZD8055组细胞对多西紫杉醇的IC₅₀为5.1±0.6μmol/L,明显低于MCF-7/Doc组（P<0.05）,AZD8055对多西紫杉醇的耐药逆转倍速为5.4。实时荧光定量PCR检测显示,MCF-7/Doc组细胞MDR1基因表达量为1.84±0.35,明显高于MCF-7组（P<0.05）;而MCF-7/Doc+AZD8055组细胞MDR1基因表达量为1.21±0.29,明显低于MCF-7/Doc组（P<0.05）。蛋白印迹法检测显示,MCF-7/Doc组细胞P-gp蛋白表达量分别为0.93±0.15,明显高于MCF-7组（P<0.05）;而MCF-7/Doc+AZD8055组细胞P-gp蛋白表达量0.54±0.10,明显低于MCF-7/Doc组（P<0.05）。AZD8055组肿瘤生长速度明显低于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）,AZD8055对移植瘤具有显著的抑制作用,抑瘤率为48.95%,差异有统计学意义（P<0.05）。MDA-MB-231和MDA-MB-231/Doc细胞株重复实验得到了相似结果。结论 mTOR高选择性抑制剂AZD8055可显著提高乳腺癌细胞株对多西紫杉醇的化疗敏感度,其作用机制可能与抑制MDR1和P-gp表达有关。     

人肝癌乳酸脱氢酶的细胞膜定位和酶学特性研究

【立论依据及设计思路】 已有研究表明在人肝癌组织中,间质细胞的线粒体会在癌细胞的驱动下会发生线粒体自噬,只进行糖酵解,且糖酵解相关酶的表达水平显著升高,尤其是间质细胞特异高表达LDHA(乳酸脱氢酶A),将糖酵解产物丙酮酸转化成乳酸,排出间质细胞。而排出的乳酸被邻近的肝癌细胞摄取,肝癌细胞特异表达LDHB,将乳酸转变成丙酮酸。肝癌细胞具有完整的氧化磷酸化过程,能利用间质细胞提供的乳酸,经三羧酸循环、糖异生和脂肪合成,为肿瘤细胞的增殖提供物质和能量。间质细胞的糖酵解和肿瘤细胞的氧化磷酸化之间代谢偶联,是维持肿瘤细胞快速增殖的重要机制。前期实验发现肝癌细胞表达膜型LDHB,而膜型LDHB的功能尚不清楚。本课题拟研究LDHA和LDHB在人肝癌间质细胞和肝癌细胞中的表达和定位和酶学特征,阐述LDH在肝癌组织能量代谢偶联过程中的生化机制,同时评价LDH作为人肝癌能量代谢干预靶点的可能性。 【实验内容】 第一部分:人体肝癌组织标本中肝癌细胞和间质细胞线粒体功能和反向Warburg效应的检测,利用免疫组化的方法检测线粒体标志物和线粒体自噬标志物及LDHA和LDHB的表达分布;第二部分:建立肝癌细胞SMMC-7721和正常人成纤维细胞的共培养体系;第三部分:检测LDH在肝癌细胞及肝癌相关成纤维细胞中的膜定位及表达水平;第四部分:对细胞膜上的LDH进行酶活性检测,明确其酶活性和代谢特征;第五部分:在细胞水平上研究LDH抗体,抗寄生虫药,单羧酸转运体抑制剂对能量代谢偶联的抑制作用;第六部分: 裸鼠模型的抗体和阿苯达唑的抗肿瘤实验。 【材料】 人肝癌SMMC-7721细胞株及成纤维细胞株,特异性LDH抗体,抗寄生虫药物(吡喹酮,阿苯达唑),免疫组化相关材料,qPCR相关材料,免疫印迹相关材料,MTT比色法相关材料。 【可行性】 本实验室已完成了人LDHA和LDHB的克隆表达和酶学特性研究,已实验证实人肝癌细胞SMMC-7721只表达LDHB, 且定位于细胞膜上。 【创新性】 提出肝癌组织中,间质细胞和实质细胞分别表达膜型LDHA和LDHB,不仅负责丙酮酸和乳酸之间的相互转化,而且可能是产物的转运体;抗寄生虫LDH的抗体和药物可以抑制人LDH的酶活性,抑制肿瘤的生长和转移。     

细胞外组蛋白诱导肿瘤细胞死亡的机制研究

【目的】 通过体外实验证实细胞外组蛋白(EHs)诱导肿瘤细胞死亡的现象,并探明EHs诱导肿瘤细胞死亡的死亡方式。 【方法】 (1)用EHs以不同时间和浓度梯度刺激前列腺癌骨转移细胞系(PC-3)、肺癌细胞系(A549)和肝癌细胞系(HepG2),利用MTT染色测量肿瘤细胞存活率,得到EHs诱导肿瘤细胞死亡的时间和剂量关系,并验证EHs对肿瘤细胞杀伤作用的普遍性。(2) 选择杀伤作用具有代表性的某几种肿瘤细胞,进行探明EHs诱导肿瘤细胞死亡方式的实验。我们计划向实验体系中引入各种细胞死亡方式的抑制剂:如细胞凋亡抑制剂——Z-VAD-fmk,程序性坏死抑制剂——Necrostatin-1,细胞自噬抑制剂——Chloroquine。即添加针对某种细胞死亡方式的抑制剂对肿瘤细胞进行保护,在同等条件下检测其与未添加抑制剂的肿瘤细胞的存活率的差异。若添加抑制剂后肿瘤细胞存活率升高,表明EHs诱导肿瘤细胞死亡与该方式有关。再通过与EHs刺激肿瘤细胞后的总存活率进行比较,明确该种死亡方式所占比率。(3) 确定细胞死亡方式后,对该方式进行深入探究。例如当验证为细胞以凋亡方式死亡时,则分别用caspase 8(死亡受体通路)抑制剂Z-IETD-FMK和caspase 9(线粒体介导通路)抑制剂证明EHs诱导肿瘤细胞凋亡的具体途径。 【结果】 (1) 体外实验证实EHs诱导肿瘤细胞死亡,并呈现剂量和时间依赖性(已完成);(2) 明确EHs诱导肿瘤细胞死亡的方式及其比率(部分完成);(3) 明确主要死亡方式的具体途径。 【结论】 EHs通过死亡受体和线粒体双途径诱导肿瘤细胞凋亡。     

去乙酰化酶SIRT1调控PFOA诱导小鼠肝损伤的作用及机制研究

【立论依据】 流行病学调查发现,全氟辛酸(PFOA)和人类多种疾病密切相关。我们前期研究发现PFOA可通过氧化应激、炎症反应和诱导凋亡引起小鼠肝脏毒性损伤。去乙酰化酶SIRT1在细胞应激反应中具有关键作用,可引起多种转录因子去乙酰化,从而促进细胞存活,抑制凋亡。因此,我们提出:“SIRT1的去乙酰化修饰可能对PFOA诱导的小鼠肝损伤起保护作用”。 【设计思路】 在前期研究的基础上,探讨PFOA肝脏毒性与SIRT1表达和反应活性的相关性;利用SIRT1激活剂以及SIRT1抑制剂观察SIRT1信号通路对PFOA诱导的肝脏毒性损伤的调控作用;通过检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的表达和乙酰化水平,分析SIRT1系统调控PFOA肝脏毒性的分子机制,是否与SIRT1对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰有关。 【实验内容】 (1)Real-time PCR和蛋白质印迹方法检测SIRT1的表达,免疫共沉淀法检测SIRT1的反应活性,对比正常对照和PFOA染毒小鼠,明确PFOA肝脏毒性与SIRT1的相关性;(2) PFOA染毒小鼠给予SIRT1激活剂SRT1720以及SIRT1抑制剂尼克酰胺,石蜡切片HE染色观察肝组织病理学改变;全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALP及LDH的血清水平;酶联免疫分析IL-6、COX-2及CRP的肝组织水平;免疫组化检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG的产生;比色法检测MDA生成及SOD、CAT和GSH-PX的活性;TUNEL染色法观察细胞凋亡;real-time PCR和蛋白质印迹方法检测Bcl-2、Bax、Fas、FasL等凋亡相关基因的表达,明确SIRT1通路的激活或抑制对PFOA诱导肝脏损伤的调控作用;(3)应用乙酰化赖氨酸抗体通过蛋白质印迹方法检测P53、NF-κB p65 和FOXO3a的乙酰化水平,分析SIRT1是否通过对P53、NF-κB p65 和FOXO3a的去乙酰化修饰调控PFOA诱导的肝脏毒性损伤。 【材料】 本项目以小鼠为实验动物,实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、全自动DNA扩增仪、紫外可见分光光度计、石蜡切片机、高速低温离心机、蛋白电泳系统、电转仪、全自动生化分析仪等。 【可行性】 本项目充分分析了国内外研究现状和发展前景,并取得了较好的前期研究基础。 【创新性】 SIRT1对PFOA肝脏毒性的调控作用尚未见报道,本实验项目研究SIRT1对PFOA诱导肝损伤的保护作用及其分子机制,为预防和治疗全氟化合物引起的肝脏损伤寻找新靶点。     

PEDF抑制乳腺癌转移机制:通过p-ERK和p-AKT途径介导减少纤连蛋白表达

【目的】 色素上皮细胞衍生因子(PEDF)是一种多功能分泌性糖蛋白,具有神经营养、抑制新生血管和抗肿瘤的作用。PEDF通过降低微血管密度从而抑制肿瘤的作用已有研究,但其在乳腺癌转移中的确切作用和机制尚不明了。 【方法】 体内实验中,我们使用稳定表达PEDF的MDA-MB-231乳腺癌细胞原位肿瘤模型评估裸鼠乳腺癌的肝转移和肺转移。体外实验中,在MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞过表达PEDF,用Boyden小室检测其的侵袭和转移能力。此外,PEDF对乳腺癌细胞EMT相关的Maker、纤连蛋白(fibronectin)及p-AKT、p-ERK分别用qRT-PCR、蛋白质印迹法和荧光免疫细胞化学法测定。肿瘤血管新生密度用MVD分析。 【结果】 实验发现,体外实验和在体实验中,PEDF均明显抑制了乳腺癌的转移。PEDF抑制肿瘤转移是通过抑制fibronectin表达,而非逆转EMT途径,而增加fibronectin可抵消PEDF的抑制乳腺癌的作用。此外,PEDF抑制fibronectin蛋白的表达是通过层黏连蛋白受体(laminin receptor)及后续的p-ERK 和p-AKT信号通路起作用的。 【结论】 实验结果证实了PEDF在乳腺癌生长和转移中发挥重要作用,并且发现,PEDF是通过层黏连蛋白受体介导和抑制fibronectin表达得以实现的。这为今后的乳腺癌治疗提供了新的思路。