不同比例骨软骨镶嵌成形术联合基因增强组织工程方法治疗骨软骨缺损

目的：研究骨软骨镶嵌成形术与联合基因增强组织工程方法治疗急性骨软骨缺损,并观察在不同比例下的组织修复情况,以期发现两者间的最佳组合。方法：对携带hTGF-β1的重组腺病毒转染BMSCs（hTGF-β1转染组）,与采用Adv-βgal转染BMSCs（Adv-βgal转染组）及未转染BMSCs（未转染空白对照组）进行WesternBlot检测hTGF-β1、Ⅱ型胶原及Aggrecan表达。雄性6月龄崇明山羊18只,体重22～25kg,取自体骨髓进行BMSCs分离及培养,传至第3代。每只动物双膝股骨内髁进行实验,分为AR、AL、BR、BL、CR、CL6组。AR为骨软骨移植覆盖面积为44.44%单纯组,AL为44.44%联合组,BR为33.33%单纯组,BL为33.33%联合组,CR为22.22%单纯组,CL为22.22%联合组。于双膝股骨内髁负重区采用骨钻制备直径为9mm,深为3mm的骨软骨缺损后,单纯组采用骨软骨镶嵌成形术的自体骨软骨柱修复,联合组同时将转染hTGF-β1的BMSCs藻酸钠混合液注入空隙,加入氯化钙产生凝胶。术后24周取材,行大体及组织学观察,并参照O＇Driscoll,KeeleyandSalter组织形态学评分标准进行评分,行免疫组织化学及透射电镜观察。结果：hTGF-β1转染组细胞hTGF-β1、Ⅱ型胶原及Aggrecan表达均强于Adv-βgal转染组及未转染空白对照组。大体观察,组织学染色以及透射电镜检查显示各组的缺损有不同程度的修复。33.33%联合组、44.44%单纯组、44.44%联合组的整体修复效果差别无统计学意义,33.33%单纯组、22.22%单纯组、22.22%联合组的整体修复效果差于前3组。结论：骨软骨镶嵌成形术联合基因增强组织工程的方法可以有效修复骨软骨缺损。随着自体骨软骨移植覆盖缺损面积的减少,骨软骨镶嵌成形术联合基因增强组织工程方法的修复优越性可以得到更好的体现。     

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。     

重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs对其向软骨分化的影响

目的 研究重组hTGF-β1腺病毒(adeno-hTGF-β1)转染BMSCs对其向软骨分化的作用.方法 重组adeno-hTGF-β1转染第一代猪BMSCs,对照组转染adeno-LacZ,腺病毒的量以200pfu/细胞计算,转染后1 d,消化收集重组腺病毒转染后的BMSCs,置于无菌15 ml聚丙烯试管中,体外细胞团聚集连续诱导培养21 d,然后分别从大体观察、组织学和Ⅱ型胶原蛋白免疫组化的检测对形成组织进行评价. 结果 实验组细胞团收缩成近似小球形的组织块,外观成乳白色,触之有一定的弹性.苏木素-伊红染色观察可见细胞团外周为由数层扁平状成纤维样细胞组成的纤维软骨膜,下层和中部区域有巢状软骨形成,软骨陷窝明显可见,软骨细胞较均匀分布,包埋在软骨陷窝内.Safranin'O染色显示,形成的软骨组织区域有大量被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示细胞团中央出现较明显的阳性染色区域,可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内.而对照组形成的组织块略小,苏木素-伊红染色观察见无软骨样组织形成,主要为较致密无结构特征的纤维样组织,Safranin'O染色也无被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示也无明显的阳性染色区. 结论 应用重组hTGF-β1腺病毒转染的BMSCs进行细胞团聚集诱导培养,可诱导BMSCs向软骨细胞表型分化而形成软骨,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程应用中奠定了基础.     

动物源性骨软骨支架修复兔膝关节复合缺损

目的探讨软骨细胞-动物源性骨软骨支架复合体修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性和影响因素。方法将改良贴壁离心法获取的骨髓间充质干细胞（bone marrowm esenchymal stem cells,BMSCs）/诱导分化的软骨细胞共培养后与经深低温冷冻、脱脂、脱钙、真空冷冻干燥和辐照消毒的动物源性骨软骨支架复合,构建共培养细胞＋软骨-骨一体化复合支架。27只新西兰大白兔随机分为实验组（A组）、对照组（B组）和空白组（C组）,每组9只。于兔股骨髁间窝处钻一深6mm的骨软骨复合缺损,A组植入共培养细胞＋骨软骨复合支架,B组植入骨软骨复合支架,C组不植入任何支架材料和细胞,分别于术后4周、8周和12周取材,行大体观察、苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色,并对各标本的软骨切片进行组织学评分。结果随着时间的延长,A组大体观察见复合缺损区已完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合;B组新生组织仍不能完全填充缺损;C组缺损区仍明显。苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色见A组软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞呈柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好;B组新生软骨细胞无软骨陷窝,排列混乱,各界面藕合欠理想;C组可见陈旧性肉芽组织生长并突出于缺损区表面。甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分结果表明,A组与B、C两组之间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 BMSCs/诱导分化的软骨细胞共培养细胞复合动物源性骨软骨支架对兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损具有修复作用。     

微载体/水凝胶复合支架修复大鼠膝关节骨软骨缺损

[目的]探索以负载软骨细胞的Cytodex-3微载体和藻酸钠水凝胶为材料,制备微载体/水凝胶复合支架,并观察以此修复大鼠膝关节骨软骨缺损的效果。[方法]将大鼠软骨细胞与Cytodex-3微载体置于旋转式三维生物反应器(rotary cell culture systems,RCCS)中,软骨细胞在微载体表面快速大量扩增后,将负载有软骨细胞的微载体均匀的与藻酸钠水凝胶混合,制备微载体/水凝胶复合支架,并以此修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损。实验分3组,A组:负载有软骨细胞的Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;B组:单纯Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;C组:空白对照组。术后6、12周取材,据大体、组织学、Micro-CT等检测结果对骨软骨修复效果进行评估。[结果]大体观显示A组的软骨修复效果明显优于B组和C组。组织学分析示A组的修复组织主要以透明软骨为主,而B组和C组主要以纤维组织为主。Micro-CT扫描结果表明各种软骨下骨均得到不同程度的重建,A组效果优于其他两组,比较差异有统计学意义。[结论]负载软骨细胞的微载体/藻酸钠水凝胶复合支架能够高效的修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损,这种将微载体与水凝胶结合构建复合支架的方法,为组织工程软骨的制备提供了新的途径。     

BMP-2转染间充质干细胞上清对软骨的影响

[目的]观察从腺病毒-骨形态发生蛋白-2-绿色荧光蛋白(Ad-BMP-2-GFP)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)获取的含有BMP-2的上清对软骨细胞体外凋亡和体内再生的影响。[方法]通过Ad-BMP-2-GFP转染BMSCs使BMP-2高表达,采用冰冻干燥法浓缩BMSCs细胞上清至10倍浓度,过滤后-20℃储存备用。体外实验:加入IL-1β(18 ng/ml)建立软骨细胞体外炎症环境,施加转染后和未转染浓缩上清,并以PBS处理为空白对照组,流式细胞术检测各处理组软骨细胞凋亡水平。体内实验:20只雄性新西兰大白兔随机分为4组,除假手术组外,其他3组建立兔膝关节软骨缺损模型,分别注射等量的纯生理盐水、转染组和未转染的培养上清。6周后取材,通过大体标本和番红O固绿染色观察关节软骨缺损修复效果。[结果]体外实验显示,转染上清组的软骨细胞凋亡水平较未转染上清组和空白对照组明显减弱(P0.05);体内实验显示,转染上清组对软骨缺损修复效果优于未转染上清组和单纯生理盐水组。[结论]通过Ad-BMP-2-GFP转染BMSCs,获取含有BMP-2的上清可以抑制体外炎症环境下软骨细胞凋亡,促进体内软骨缺损修复。     

hIGF-I基因增强Mosaicplasty技术重建膝负重区大面积骨软骨复合缺损实验研究

目的研究hIGF-I基因增强组织工程提高Mosaicplasty修复大面积骨软骨缺损的修复质量，改善骨软骨的整合。 方法制造山羊膝关节股骨髁大面积骨软骨缺损模型，使用自制Mosaicplasty器械，植入2 mm直径骨软骨柱镶嵌充填缺损，以hIGF-I基因转染的骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶填充残余缺损。同时设立未转染hIGF-I基因的骨髓基质干细胞组、Mosaicplasty组和对照组。术后4 w、8 w、16 w处死动物，行大体观察、光镜、电镜观察，磁共振检查比较修复效果。 结果骨软骨缺损在16 w时IGF-I基因增强Mosaicplasty组移植物固定牢固，关节面平滑，移植物间界限消失，新生软骨组织类似于正常软骨，4~16 w修复效果逐渐改善，优于其他各组。光镜观察见移植的骨软骨生长良好，与新生软骨组织紧密相连，新生的软骨细胞排列规整，细胞外基质分布均一。对照组无明显修复。MRI观察类似大体观察结果。 结论使用转染hIGF-I基因的骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶可促进Mosaicplasty后骨软骨的整合，改善其修复效果。     

β-磷酸三钙复合骨髓间充质干细胞修复山羊骨软骨缺损的实验研究

目的将β-磷酸三钙（β-TCP）与山羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合后,在生物反应器中分别向成软骨和成骨诱导,并植入骨软骨缺损处,观察软骨修复效果。方法分离、培养山羊BMSCs,在生物反应器中分别向成软骨及成骨诱导2周,植入骨软骨缺损部位。实验组分为A组：旋转力刺激＋成软骨、成骨诱导组（力学刺激组）,B组：单纯成软骨、成骨诱导组（无力学刺激组）,并设空白对照组。术后12周和24周进行大体观察、组织学染色等,并行O＇Driscoll Keeley and Salter评分。结果 A、B组均有新生软骨形成;A组软骨在12周与24周均优于B组（P〈0.05）;术后12、24周A组评分优于B组,差异有统计学意义（P〈0.05）。对照组无新生软骨形成。结论将BMSCs复合于β-TCP,可用于组织工程修复骨软骨缺损;体外培养阶段的旋转力刺激有利于改善组织工程软骨的质量。     

自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养复合同种异体完全脱蛋白骨修复关节软骨全层缺损的研究

[目的]探讨自体骨髓间充质干细胞(bone m arrow-derived m esenchym al stem cells,BMSCs)与软骨细胞共培养复合同种异体完全脱蛋白骨(fu lly deprote in ized bone,FDB)修复关节软骨缺损的可行性,评价修复效果,为优化种子细胞源提供依据。[方法]取浓度为3×106/m l的第二代BMSCs和软骨细胞,按2:1比例混匀共培养作为种子细胞。FDB与共培养细胞复合接种植入修复缺损为实验A组、单纯FDB为对照B组和不处理为空白对照C组,移植8、16周后经人体观察、组织学评分和免疫组化染色评价缺损的修复。[结果]共培养的软骨细胞基质合成丰富,细胞增殖快。A组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟。B组和C组的修复组织呈纤维组织和无修复。组织学评分表明A组优于B、C 2对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),B组与C组差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色显示A组修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好。[结论]自体BMSCs与软骨细胞共培养作为种子细胞,BMSCs能增强软骨细胞的增殖,促进软骨细胞基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,节省大量的软骨细胞,与FDB复合后能有效修复关节软骨缺损。     

CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的BMSCs移植修复兔关节软骨缺损

目的 探讨温敏型CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植修复兔关节软骨缺损的实验效果.方法 体外分离培养兔BMSCs,在Ad-hTGF-β1转染1周后,用细胞免疫化学方法检测hTGF-β1在细胞内的表达.用24只成年新西兰大白兔制造关节软骨缺损模型,双侧后肢均用于实验,动物模型随机分为4组,各组动物6只.A组:凝胶复合转染BMSCs修复组;B组:凝胶复合未转染BMSCs修复组;C组:凝胶修复组;D组:空白对照组.在术后16周时处死动物取材,通过大体标本和组织学染色观察评价各组修复效果,按照改良Pinoda法评分,对各组修复效果进行统计学分析.结果 免疫组化证实体外培养的BMSCs在Ad-hTGF-β1转染后表达hTGF-β1蛋白,阳性率为85.4%.术后16周取材见凝胶复合转染细胞组关节软骨缺损部位为软骨样组织填充,组织学观察见再生的软骨组织细胞排列及细胞密度与正常软骨相似,Ⅱ型胶原免疫组化阳性,Pineda评分同其它各组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CS/PVA凝胶作为一种温敏型可注射支架材料,其负载hTGF-β1转染的BMSCs移植可用于兔关节软骨缺损修复.

Abstract：

Objective To investigate the experiment effects of rabbit joint articular cartilage defects repaired by thermosensitive CS/PVA composite hydrogel engineered hTGF-β1 transfected bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. The positive rate of transfection was defected by cell immunohistochemistry methods after Ad-hTGF-β1 transfected for 1 week. Twenty-four adult New Zealand white rabbits with full articular cartilage defects were randomly divided into 4 groups, each group had 6 animals, both hind limbs were used in the experiment. Group A: hydrogel combined with transfected cells; Group B: hydrogel combined with untransfected cells; Group C: hydrogel group; Group D: blank control group. Specimens and histological observation were used to evaluate the repair effect after 16 weeks according to Pineda's score. Results The positive rate of hTGF-β1 expression in BMSCs was about 85.4% after transfection. After 16 weeks the defects of group A were repaired by cartilage-like tissue, the cell arrangement and densities of regenerated cartilage were similar to normal cartilage, type Ⅱ collagen immunohistochemistry were positive. There was a significant difference in Pineda's score compaired with other groups (P ＜ 0.05). Conclusion Rabbit articiular cartilage defects could be repaired by CS/PVA hydrogel engineered hTGF-β1-transfected bone marrow mesenchymal stem cells.     

骨软骨镶嵌成形术修复骨软骨复合缺损的比较研究

目的观察采用骨软骨镶嵌成形术（Mosaicplasty）修复膝关节中等和大面积骨软骨复合缺损的效果,为临床应用提供理论依据。方法24只成年山羊随机分成3组（n=8）。中等面积缺损组在股骨内髁制造直径6mm缺损,植入直径2mm骨软骨柱修复;大面积缺损组于股骨内髁制造9mm直径缺损,以直径3mm骨软骨柱修复;对照组于股骨内髁制造直径6mm缺损后不修复。自股骨髁间窝和滑车沟两侧非负重区用自制Mosaicplasty器械钻取骨软骨柱,推出器嵌入缺损处镶嵌填满。术后4、8、16及24周处死动物,取修复骨软骨组织行大体观察、HE及甲苯胺蓝染色。术后24周,取大面积缺损组和对照组膝关节摄X线片,观察骨软骨缺损修复情况,并分别取修复组织及正常软骨组织行蛋白聚糖（glycosaminogly cans,GAG）含量测定。结果中等面积缺损组术后4周,移植的骨软骨柱与基底部骨床结合牢固;8-24周软骨层之间以及与正常软骨间界限仍清晰。大面积缺损组术后4周,移植的骨软骨柱与基底骨床结合牢固,部分骨软骨柱被压入骨床内;8-24周压陷程度加重,与股骨髁相对关节面的部分软骨被磨损。对照组24周缺损仍无明显修复迹象,与股骨髁相对关节面的软骨磨损剥脱。组织学观察结果类似大体观察,术后24周中等及大面积缺损组软骨柱间均有缝隙存在,大面积缺损组毗邻软骨细胞稀疏肥大。术后24周,X线片可见大面积缺损组软骨下骨愈合良好,而对照组仍可见骨质缺损,与股骨髁相对关节面的软骨局部骨质硬化;软骨GAG含量测定显示正常软骨和大面积缺损组修复组织间差异无统计学意义（P〉0.05）;前两者与对照组修复组织比较,差异均有统计学差异（P〈0.05）。结论Mosaicplasty可修复中等面积骨软骨复合缺损,但无法有效修复大面积缺损,效果有待改进。