嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建

目的 构建嵌合跨模型CD55基因的重组逆病毒表达质粒。方法 采用PCR技术扩增编码CD155信号肽及成熟蛋白胞外区（-34-304aa)的DNA片段，双侧引入EcoRI、SspI位点，与编码CD46分子的跨膜区及膜内区（270～350aa)的DNA片段的5′未端自身的Stu I位点连接，构建嵌合跨模型CD55 DNA片段，序列测定后将此嵌合CD55片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒，酶切鉴定插入片段的方向。结果 DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5 DNA阅读框完整、连接部位序列正确；Hind Ⅲ酶切鉴定得到了正向插入的CD55TM-pLXSN重组表达质粒。结论 我们成功构建了嵌合跨膜型CD55 DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD55TM-pLXSN，为进一步在真核细胞中表达嵌合分子，比较研究GPI锚固型CD55分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD55分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。     

器官移植术后嵌合现象的研究

选择3例接受男性移植物的女性移植患者作为研究对象，其中1例小肠移植，2例肾移植患者，利用PCR技术扩增Y染色体特异性DNA片段，结果在小肠移植女性受体外周血及皮肤组织中出现Y染色体特异性DNA片段，肾移植外周血中也出现Y染色体特异性DNA片段，表明在器官移植术后存在着供体细胞向受体组织的移居嵌合。联合的发现不仅丰富了免疫耐受的理论，而且对移植临床具有指导意义。促进嵌合的出现及保持嵌合的平衡，将有利于防治排异反应和GVHD。     

乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗的构建与鉴定

目的采用基因重组技术,将乙肝病毒4段小基因与协同刺激分子CD80基因嵌合,构建成嵌合乙肝小基因DNA疫苗。方法①根据文献选择和设计HBV的一段pres2、三段core表位编码小基因,以人工合成DNA片段P1~P10,通过退火、连接成为含约170bp的嵌合基因,用HindⅢ酶切;②提取和纯化pcDNA3-CD80,用HindⅢ酶切和去磷酸化;③将酶切小基因定向插入pcDNA3-CD80载体的HindⅢ位点之间,构建成pcHBV-CD80小基因质粒;④pcHBV-CD80转入E.coli JM109扩增、提取质粒,测序鉴定。结果①各DNA小片段经退火、连接,成功嵌合为一大小约170bp之目的基因;②pcDNA3-CD80提取、酶切均成功;③170bp之目的基因定向克隆到载体上,构建了重组质粒pcHBV-CD80,经测序鉴定均构建正确。结论乙肝病毒小基因与协同刺激分子CD80嵌合DNA疫苗构建成功。     

以口腔粘膜细胞为对照检测异基因造血干细胞移植后嵌合状态

目的：探讨以口腔粘膜细胞DNA代表移植前基因状态的可行性，解决缺乏移植前样本病例嵌合状态的检测问题．方法：对2例接受异基因造血干细胞移植术病例，采集供者、受者移植术前外周血、受者移植术后外周血和口腔粘膜拭子，以PCR-STR技术对各样本进行DNA分析，对比移植前后基因分型变化判断嵌合状态，比较受者移植术前外周血和移植术后口腔粘膜拭子基因分型的异同．结果：2病例移植后受者外周血的PCR-STR基因分型与供者一致，呈完全的供者嵌合状态；受者移植后的口腔粘膜细胞基因分型与移植前外周血的基因分型一致．结论：口腔粘膜细胞的DNA样本可以代表受者移植前的基因状态，在实践中可以用口腔粘膜细胞代替移植前的受者样本进行嵌合状态的检测。     

流行性乙型脑炎／登革病毒1型嵌合基因的构建和鉴定

目的：构建和鉴定流行性乙型脑炎（乙脑）／登革病毒1型（ DV1）／JEV prME嵌合基因。方法利用分子生物学技术构建登革病毒和乙脑病毒嵌合的prME嵌合基因,重叠PCR法鉴定;在质粒载体pcDNA3．1（＋）的基础上,构建表达pcDV1／JEV prME的重组质粒载体,利用LipofectamineTM2000将登革／乙脑prME嵌合质粒转染至BHK－21细胞,间接免疫荧光法检测prME蛋白在细胞中的表达。结果 DNA测序结果证实pcDV1／JEV prME重组质粒完全正确,成功构建的登革／乙脑嵌合质粒在BHK－21细胞中能够表达prME蛋白。结论通过一系列的鉴定手段,可以认定本实验中构建的登革／乙脑嵌合质粒能够在真核细胞中顺利表达。     

登革病毒疫苗研究近况

本文回顾了近年来登革病毒DNA疫苗,嵌合疫苗,重组亚单位疫苗,四价减毒活疫苗等方面的研究进展,阐述了各种疫苗的动物免疫保护作用。     

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗,并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒,同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒,体外转染COS-7细胞,Westernblotting法检测细胞培养上清表达产物;于BALB/c小鼠皮内注射,每隔2周1次,共免疫3次,100μg/次;于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒,测序证实各连接点阅读框序列正确;体外转染COS-7细胞,证明真核质粒以分泌形式表达;接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体,比接种pHEVE2的对照组高50~100倍;pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a、IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答,pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答,为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。     

慢性移植肾肾病管周毛细血管内皮细胞嵌合现象分析

目的:观察慢性移植肾肾病(CAN)中血管内皮细胞被受者内皮细胞替代(内皮嵌合)的现象,分析内皮嵌合对CAN进展的影响。方法:无功能移植肾切除组织,符合慢性移植肾肾病(CAN)造成移植肾失功、男性供者女性受者标本29例,选择Y染色体长臂Yq12区域(异染色质区)DNA片段作为探针,同时选择X染色体着丝粒区(α卫星DNA)探针作为对照,通过在石蜡切片标本上进行间期细胞双色荧光原位杂交(FISH),观察肾小管周毛细血管(PTC)内皮细胞的嵌合程度。结果:CAN中PTC内皮细胞嵌合现象较普遍存在,内皮细胞的分布呈灶状,供者内皮细胞和受体内皮细胞可相邻存在。PTC密度与间质纤维化程度有关,CD31阳性的PTC每单位面积密度14.52±4.85个,微血管内皮细胞嵌合出现比例为0.16±0.04,两者无明显相关性(r=0.13,P>0.05)。结论:肾脏移植物中血管内皮细胞可以被受者来源的内皮细胞所替代,CAN中PTC密度减少,内皮细胞的嵌合的发生与CAN的进展无直接关系。     

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的 制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗，并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒。同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒，体外转染COS-7细胞，Western blotting法检测细胞培养上清表达并且 物；于BALB/c小鼠皮内注射，每隔2周1次，共免疫3次，100μg/次，于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果 获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒，测序证实各连接点阅读框序列正确；体外转染COS-7细胞，证明真核质粒以分泌形式表达；接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体，比接种pHEVE2的对照组高50-100倍；pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a,IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答，pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论 CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答，为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。     

肾脏移植物血管内皮细胞嵌合现象预后观察

目的:用荧光原位杂交方法(FISH)观察移植肾中血管内皮细胞被受体内皮细胞替代(内皮嵌合)的现象,并分析内皮嵌合对肾脏移植物预后的影响。方法:移植后2周到4个月男性供者、女性受者的移植肾穿刺活检标本34例,选择Y染色体长臂Yq12区域(异染色质区)DNA片段作为探针,同时选择X染色体着丝粒区(α卫星DNA)探针作为对照,通过在石蜡切片标本上进行间期细胞双色荧光原位杂交,分析血管内皮细胞被受体替代的现象,分析其对移植肾预后的影响。结果:肾脏移植物中血管内皮细胞嵌合现象较普遍存在,内皮细胞的分布呈灶状,供者内皮细胞和受体内皮细胞可相邻存在。血管内皮细胞嵌合的发生与否移植肾1年血清肌酐值分别为(115.88±25.06)μmol/L,(118.16±18.85)μmol/L,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:肾脏移植物中血管内皮细胞可以被受者来源的内皮细胞所替代,对移植后1年的肾功能无明显影响,内皮嵌合对移植肾的长期存活的影响有待进一步观察。     

人心钠素的蛋白质工程研究Ⅱ.基因内重组构建心钠素衍生物基因RH-2、RH-3

以精确设计的基因内重组法,利用已有的心钠素衍生物RH—1基因和心钠素α-hANP基因的重组交换,设计并构建了两种新的心钠素衍生物RH-2和RH-3基因。衍生物RH-2相当于α-hANP的N端嵌合羧肽酶抑制剂SQ20881,衍生物RH-3相当于α—hANP的C端嵌合两个脯氨酸。基因内重组获得的重组体用三种探针以原位杂交和斑点杂交等方法进行DNA区域组合分析,再经限制性酶谱分析筛选出目的克隆。DNA序列测定确认了所构建得的RH-2和RH-3基因。     

异基因造血干细胞移植中嵌合体的STR-PCR定量检测

目的:研究异基因造血干细胞移植后供者单个核细胞、CD3+T细胞、CD15+粒细胞植入情况。方法:采集22例清髓性外周血干细胞移植患者移植前及移植后不同时间的骨髓标本,应用免疫磁珠进行CD3+T细胞、CD15+粒细胞分选,常规提取DNA,PCR扩增后,进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,计算供者嵌合率。结果:22例患者均在中位时间+12d(+9d～+15d)造血恢复。骨髓单个核细胞在+7d时供者嵌合率为70%,+14d供者嵌合率均超过90%,+21d和+28d供者嵌合率均超过95%以上。CD15+粒细胞在+7d时嵌合率为40%,在+14d、+21d和+28d供者嵌合率>95%。CD3+T细胞在+7d、+14d、+21d和+28d供者嵌合率分别为65%、80%、84%和90.9%。移植后早期完全嵌合组急性GVHD发生率高于混合嵌合组。结论:在+28d3群细胞均可达到供者完全嵌合状态。定量检测对判断早期植入、预测复发,指导临床干预治疗具有重要意义。     

第三届全国普外中青年医师学术交流会(续)

江志伟,男,28岁,南京军区总医院全军普外研究所主治医师。《器官移植术后供受体间细胞移居嵌合现象的研究及其意义》选择3例接受男性供体移植物的女性器官移植患者为对象,采用多聚酶链反应技术扩增Y染色体特异性DNA片段,结果在患者外周血或皮肤组织中发现Y染色体特异性DNA     

汉滩病毒76-118株G2S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及表达产物鉴定

目的：在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G2片段与S基因0．7kb片段嵌合基因的重组腺病毒．方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的转移载体pShuttle-G2S0．7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E．coli JM109并用PCR方法进行筛选和鉴定，获得重组腺病毒Adeno-G2S0．7DNA，转染HEK293细胞得到重组腺病毒．进一步对重组腺病毒滴度和表达产物进行鉴定．结果：构建了含G2S0．7嵌合基因重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15pfu／L；该重组腺病毒感染HEK293细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单抗(mAb)所识别的融合蛋白．结论：利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础．     

STR-PCR半定量检测嵌合体方法在异基因造血干细胞移植中的应用

目的:应用短串联重复序列-聚合酶链反应(STR-PCR)半定量方法检测异基因造血干细胞移植后供者细胞比例并探讨其临床意义。方法:给30例接受移植的患者行移植后嵌合体检测,采集外周血提取DNA,对9个STR位点行聚合酶链反应扩增,扩增完成后行聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影,再计算嵌合率。结果:30例患者均检测到供者细胞,24例达到完全嵌合(CC),6例形成混合造血(MC)。在移植后14 d,稳定植入的患者多数表现为CC。CC组的aGVHD发生率高于MC组,7例患者在复发前检测到嵌合率(donor cell,DC)下降,经相应免疫治疗后有3例达到CC。结论:监测异基因造血干细胞移植后嵌合率的动态变化过程,PCR-STR是一种简单经济的方法,可根据嵌合状态指导个体化免疫治疗,对患者的长期存活有重要意义。     

结核分枝杆菌mtb8.4/hIL12嵌合基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的:克隆结核分枝杆菌mtb8.4/hIL12嵌合基因,构建其真核表达质粒,并进行鉴定.方法:采用基因工程技术,首先以pcDNA 3.1( )-mtb 8.4为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增出mtb 8.4-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-mtb 8.4-linker(pML)重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12基因,将hIL-12基因与pML质粒进行连接重组,构建成mtb 8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定.结果:mtb 8.4/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功.结论:mtb 8.4/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病mtb 8.4/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础.     

HPV16嵌合型疫苗的构建及其免疫效应初探

目的 构建以碳末端锌指结构突变的E7基因为基础，融合HSP70的嵌合型DNA疫苗，检测其诱导的特异性T淋巴细胞增殖活性，初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤的治疗作用。方法 利用PCR法定点突变E7基因碳末端的锌指结构，以其为基础融合热休克蛋白70，克隆入pcDNA．3．1-质粒构建嵌合型DNA疫苗。DNA测序，确认E7基因突变位点及DNA疫苗阅读框架。用脂质体法将pcd—E7-HSP转染A549细胞，经G418筛选后，提取RNA，RT—PCR检测E7基因表达。DNA疫苗免疫C57BL6小鼠。取其脾细胞与E7蛋白在体外共同培育，MTT法检测T淋巴细胞增殖活性。结果 E7基因突变位点及阅读框架均正确，E7基因可检测到表达。疫苗免疫后C57BL/6小鼠脾细胞增殖活跃。结论：E7基因锌指结构的突变及融合HSP70能够诱导特异性的细胞免疫应答。     

基于酶抑制技术的新型药物

新的糖基嵌合技术正用于开发治疗自身免疫性疾病以及肿瘤的新型药物。开发人员称,这项技术可为淋巴瘤提供新的治疗方法。这项技术的核心是抑制嘌呤核苷磷酸酶(PNP)的活性,使机体合成障碍转变,代之以不断产生基本核酸如DNA。PNP对正常细胞与疾病细胞可同时产生作用,如其作用不当,病态的DNA或RNA细胞     

抗鼠疫抗原F1的嵌合抗体制备及特性分析

目的：建立抗鼠疫F1嵌合抗体的稳定表达细胞系,表达并纯化嵌合抗鼠疫F1抗体并鉴定其活性。方法：提取鼠源杂交瘤细胞株4C6总核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA,cDNA）,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）获得抗F1抗体轻链、重链可变区基因,全基因合成嵌合抗体的重链和轻链基因,并克隆于真核表达载体pMH3质粒中,共转染入中国仓鼠卵巢上皮细胞?S（Chinese hamster ovary cell?S,CHO?S）中,经遗传霉素（geneticin,G418）筛选得到稳定表达F1嵌合抗体的细胞株,悬浮培养后收集上清并亲和纯化。采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测其与F1抗原的特异性结合能力;通过竞争性ELISA比较嵌合抗体和鼠源亲本抗体与抗原的结合能力,同时测定抗体亲和力和质谱分析抗体特性。结果：成功获得稳定分泌抗鼠疫抗原F1 嵌合抗体的稳定表达细胞系,该抗体能够特异性结合F1抗原,抗体的亲和力为2.303×10-9 mol/L。结论：成功制备了抗体鼠疫F1的嵌合抗体,为后续动物体内实验及临床药物研发奠定了基础。     

获得重构基因的简捷方法--重叠延伸PCR

目的：构建IFN-β信号肽序列与白细胞介素18（IL-18）成熟肽的重组嵌合分子。方法：从BALB/c鼠基因组DNA扩增IFN-β信号肽序列;由小鼠Pro-IL-18真核表达质粒获得IL-18成熟肽序列;以非对称PCR技术得到IFN-β信号肽编码区的反义链和IL-18成熟肽正链;采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)产生具有IFN-β信号肽与IL-18成熟肽的嵌合编码序列;定向连方式构建嵌合IL-18的表达质粒并测序。结果：连续胶PAGE表明非对称PCR可分别扩增出两个靶序列的特异性单链,大小符合预期。IFN-β信号肽对称PCR产物与IL-18非对称PCR产物混合作为模板,进行重叠延伸;电泳分析可见清晰的嵌合片段;测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成,且无移码。 结论：重叠延伸PCR是一种获得重构基因的简捷方法。