脐血、外周血内皮祖细胞分化成内皮细胞的实验研究

目的探讨人的脐血、外周血内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型和功能。方法新鲜脐血和健康成年人的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,在M199培养基中体外培养,3d后去除悬浮细胞,继续培养,诱导EPCs增殖和分化。流式细胞仪检测EPCs标志CD34和内皮细胞特异性标志CD31表型,RTPCR检测ecNOS,flk1/KDR基因水平表达,免疫组化验证蛋白水平表达,并进一步通过NO活性的变化检测内皮细胞的功能。结果流式细胞仪检测,外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）刚分离时,CD34阳性表达率为（1.1±0.8）%,培养3d后为（16.9±6.2）%。细胞形态观察发现,刚分离的单个核细胞呈圆形,形态小,3d后有明显集落形成,7d后梭形细胞线样排列,随培养时间增加,细胞形态逐渐变大,呈现出典型铺路石样改变。脐血单个核细胞（umbilicalcordbloodmononuclearcells,CBMC）和PBMC培养10d后,CD31阳性表达率分别为（76±17）%和（82±9）%。RTPCR检测有内皮细胞特异性成分ecNOS,flk1/KDR的表达。免疫组化染色,细胞膜和细胞浆中有弥漫性棕色出现,呈阳性反应,证实了蛋白水平的表达。培养10d的贴壁细胞随着VEGF浓度增加,NO生成增加,具有内皮细胞的功能。结论脐血,外周血EPCs体外分离,纯化,诱导培养后的贴壁细胞表型检测,大部分细胞具有内皮系标志物,并具有产生NO功能。     

对过继免疫治疗中外周血单个核细胞采集术的探讨

目的:探讨在恶性肿瘤患者过继免疫治疗中外周血单个核细胞的采集技术.方法:根据患者外周血单个核细胞计数值,应用CS-3000PLUS血细胞分离机,采集外周血单个核细胞,运用Ficoll法分离纯化,再用贴壁法分离出贴壁细胞进行诱导分化为树突状细胞(DC),未贴壁细胞(主要为淋巴细胞)诱导分化为肿瘤杀伤细胞(CIK)或体外扩增为记忆性淋巴细胞(ALT),最后进行细胞回输.结果:在8例13人次的采集中,处理总循环血量,获得单个核细胞总数,单个核细胞纯度,细胞采集效率,血小板丢失率分别为(6.99±1.74)L,(3.47±1.44)×109/L,(90±6)%、(5L 3±13)%、(43.5±13.1)%.DC加CIK治疗1例,CK治疗3例,化疗后ALT免疫重建治疗4例,均取得了一定的临床疗效.结论:外周血单个核细胞采集术,不良反应发生率低、单个核细胞的采集效率高,用于恶性肿瘤过继免疫治疗的临床效果较好.但采集后血小板的丢失严重,对于恶性肿瘤化疗后血小板减低的患者应引起关注.     

从外周血单个核细胞中获得内皮祖细胞的方法学研究

目的 探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞(EPCs)的方法以及EPCs的生物学特征.方法 密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中.分别采用常规方法(A组)和序列黏附法(B组)培养,A组细胞于接种第4天洗去未黏附细胞然后隔日换液1次;B组细胞接种后每2 h去除1次未黏附细胞,共2次.两组细胞均在7 d后计数早期克隆,持续培养直到晚期克隆出现.流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白,胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能.结果 早期克隆数目的 获得在2组间差异有统计学意义,但序列黏附法获得晚期克隆数目显著增加(P＜0.05),且B组的早期克隆细胞表达CD3显著减少(P＜0.05).晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d出现,其组成细胞与早期克隆相比CD45、CD14表达显著减少(P＜0.001)而CD146表达明显增加(P＜0.01),只有晚期克隆再种植可形成第二代内皮细胞克隆,并具有体外血管生成功能.两种克隆的构成细胞在结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白方面差异无统计学意义.结论 人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,无内皮分化功能;晚期克隆细胞具有EPCs的形态和生物学特征,应用序列黏附法可显著提高晚期克隆获得率.     

人脐血内皮祖细胞的体外分离和培养

目的建立一种稳定的体外分离和培养人脐血来源内皮祖细胞的方法。方法采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞,将其接种至人纤维连接蛋白包被的六孔板中,用EGM-2培养基诱导培养。通过形态学观察、细胞表面特异性抗原、摄取功能和体外血管形成能力对内皮祖细胞进行鉴定。结果细胞形态学观察发现,刚分离的单个核细胞较小,呈圆形,4 d后可见少量的圆形和梭形贴壁细胞,8 d后有明显集落形成,14 d后相邻集落相互融合,呈现出典型铺路石样改变。内皮祖细胞能摄取乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,表达CD34、CD133和血管内皮细胞生长因子受体2,并且具有体外血管生成能力。结论采用密度梯度离心法可从人脐带血中成功分离和培养出内皮祖细胞,以用于相关实验研究。     

人循环内皮祖细胞不同克隆成分的体内外血管生成功能不同

目的探讨成人外周血循环来源的内皮祖细胞不同克隆成分表型特点及体内外血管生成差异。方法密度梯度离心法获得单个核细胞,用含生长因子的内皮培养基接种于纤维连接蛋白包被的培养板中。7d后计数早期克隆并进行下面实验,另1份持续培养直到晚期克隆出现进行相同实验。流式细胞术检测细胞表面抗原,间接荧光染色法鉴定细胞表达假血友病因子。胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能。结果早期克隆再种植不能形成第二代克隆且无体内外血管形成功能,细胞表面主要表达CD14和CD45。晚期克隆在培养21~28d间出现,再种植可形成第二代内皮细胞克隆,并能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构,细胞表达CD45和CD14显著减少(P<0.001)而CD146明显增加(P<0.01)。结论人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,只有晚期克隆表现出干/祖细胞和内皮细胞双重表型特征并具有体内外血管生成功能。     

白细胞介素-15对脐血和成人外周血单个核细胞抗肿瘤活性的影响

目的：探讨白细胞介素—15(1L—15)对脐血单个核细胞(CBMNC)和成人外周血单个核细胞(PBMNC)抗肿瘤活性的影响。方法：采用MTT法分别检测静止的CBMNC和PBMNC对K562和HL—60细胞株的杀伤活性、经不同浓度的IL—15及不同效靶比条件下激活的CBMNC和PBMNC抗瘤活性，采用ELISA法测定培养上清中IFN—r及TNF—a水平，采用APAAP检测CD56、CD16表面抗原。结果：①静止CBMNC抗肿瘤活性显著低于PBMNC，经IL—15活化后，脐血NK活性显著增强，可达成人水平，脐血LAK活性显著高于成人血LAK活性。②活化后培养上清中的IFN—r及TNF—a水平均显著增强，但脐血培养上清中两种细胞因子的水平仍低于成人血。③活化前后脐血NK细胞CD56表达显著增强。结论：IL—15能显著提高CBMNC的抗肿瘤活性，为今后优选IL—15活化脐血进行肿瘤过继免疫治疗提供了理论依据。     

IL-21受体在溃疡性结肠炎中的表达及对促炎症细胞因子分泌的诱导作用

目的:探讨IL-21对UC患者外周血和肠黏膜固有层组织内淋巴细胞的免疫病理调节.方法:收集28例UC患者和22例健康成人外周血标本和肠黏膜活检标本, 分离外周血单个核淋巴细胞(PBMC)和肠黏膜固有层单个核淋巴细胞(LPMC), 利用流式细胞仪检测IL-21R在CD4+、CD8+ T细胞、B细胞和NK细胞表面表达. 培养PBMC和LPMC, 使用IL-21和抗CD3单抗体外刺激, 48 h后收集上清液,使用ELISA检测促炎症细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2)分泌, 分析IL-21在疾病发展过程中的免疫病理作用.结果:UC患者外周血和肠黏膜固有层组织内CD4+、CD8+ T细胞、CD20+ B细胞和CD56+NK细胞表达IL-21R水平比健康者显著升高(PBMC:8.42±2.14 vs 3.46±0.54, 10.35±2.17vs 5.28±2.2, 7.27±1.15 vs 2.35±0.41, 12.55±3.12 vs 5.45±1.06; LPMC:22.44±3.46 vs6.26±1.15, 24.48±4.57 vs 6.87±1.02, 16.24±3.10 vs 5.56±1.44, 23.54±4.12 vs 8.45±1.68, 均P<0.05). 体外培养PBMC或LPMC, 使用IL-21刺激, 发现IL-21可显著诱导UC患者的PBMC和LPMC激活, 并分泌高水平的TNF-α和IFN-γ(346±72 vs 120±27, 3048±426 vs1182±242; 625±113 vs 154±35, 3827±418vs 1520±304, 均P<0.05).结论:IL-21R参与肠黏膜炎症损伤, 阻断IL-21生物学效应可能治疗UC的发生.     

分化抑制培养体系体外扩增脐血造血细胞的研究

目的:探讨分化抑制培养体系对脐血造血细胞体外扩增效应。方法:分化抑制培养体系与脐血单个核细胞(MNC)体外共同培养7 d,检测MNC细胞总数、CFC、CD34 细胞反应扩增效果,并检测CD34 细胞表面归巢相关黏附分子VLA-4(CD49d)、VLA-5(CD49e)、LFA-1(CD11a)、HCAM(CD44)、L-selectin(CD62L)的表达率。结果:分化抑制培养体系组明显扩增脐血MNC细胞总数、CFC、CD34 细胞(均P<0．05),对照组培养脐血MNC细胞总数明显下降,CFC和CD34 细胞完全死亡(均P<0．01)。CD34 细胞表面各黏附分子CD49d、CD44和C1362L表达与扩增前相当(均P>0．05),而CD49e和CD11a表达明显高于扩增前(均P<0．05)。结论:分化抑制培养体系体外显著扩增脐血造血细胞,并且扩增后的造血干(祖)细胞总体上保持其表面归巢相关黏附分子的表达,归巢功能不会减低,是一种安全有效的扩增体系。     

兔外周血与骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及生物学特性的研究

目的:探索并建立兔内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、鉴定方法。方法:采用密度梯度分离法分别从兔外周血和骨髓中分离出单个核细胞,接种于预包被明胶的培养瓶,并应用培养基(EBM-2)诱导培养,诱导分化为EPCs;在倒置显微镜下观察两种源性细胞生长过程;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种源性获得的EPCs增殖情况;采用免疫荧光染色观察EPCs相关抗原CD34、CD31、CD133及vWF因子的表达。结果:两种源性EPCs均于培养3～4d完全贴壁,呈克隆样生长,7～9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95%。两种源性获得的第2代细胞生长曲线近似"s"形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显,外周血源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为96.48%和3.52%,骨髓源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为97.11%和1.84%。第2代EPCs进行免疫荧光鉴定结果显示:两种源性内皮祖细胞均阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达。结论:两种源性的EPCs均可高效获得且在体外稳定培养。与传统的骨髓源性EPCs相比较,从外周血源获得的EPCs是一种可靠、简便的培养方法,为组织工程学提供理想的细胞来源。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞CD28 mRNA的表达

目的　探讨CD28在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达水平及其意义。方法　应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测了34例活动期SLE患者和30名正常人PBMC中CD28mRNA的表达水平。结果　活动期SLE患者CD28的阳性表达率为20.6%,明显低于正常人对照组(70.0%),差异非常显著(P＜0.001);活动期SLE组CD28的平均表达水平(0.19±0.21)亦明显低于正常对照组(0.43±0.11),差异显著(P＜0.05)。结论　CD28的异常表达可能在SLE发病机制中起作用,CD28mRNA的低水平表达可能与外周血CD28＋T细胞凋亡增加或迁移到炎症部位有关。     

骨髓源性内皮祖细胞与内皮细胞共培养促进其向成熟内皮细胞分化的研究

目的：探讨共培养的内皮细胞对内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化的影响。方法：分离1～2个月龄,SD大鼠股骨髓,个核细胞（MNCs）,MNCs,Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染鉴定内皮细胞的特性。应用贴块法培养大鼠腹主动脉的内皮细胞,vWF免疫组化染色进行鉴定。采用Transwell培养板,上、下室分别加入内皮祖细胞和内皮细胞,15%胎牛血清的NO.2 DMEM/F12培养液培养14 d,倒置相差显微镜观察培养内皮祖细胞的形态。RT-PCR检测eNOS、vWF mRNA,流式细胞术检测CD31及KDR的表达。结果：荧光双染显示培养的单个核细胞具有内皮祖细胞特性;共培养的内皮祖细胞呈短梭型、铺路石状,培养至4 w时有复杂的网状结构形成。RT-PCR检测显示,eNOS及vWF mRNA表达均较对照组显著增加（P〈0.05）。流式细胞术分析表明,共培养组的内皮祖细胞CD31及KDR的表达,也显著高于对照组（分别为P〈0.05及P〈0.01）。结论：与内皮细胞共培养可促进内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化。     

人外周血内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的:从人外周血中分离培养内皮祖细胞(EPCs),并探讨其体外诱导培养的条件。方法:密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞,置于鼠尾胶原包被的培养瓶中进行体外培养,流式细胞术和免疫荧光法检测分化细胞表面特异性抗原标记物的表达。结果:人外周血单个核细胞在鼠尾胶原包被的培养瓶中培养后呈梭形,并表达内皮细胞的特异性抗原CD34和KDR,和干/祖细胞抗原CD133。提示这些培养细胞既具有内皮细胞的表面标志和功能,又具有祖细胞特性。结论:成功从外周血中培养出EPCs。鼠尾胶原可取代EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs的更节省的一种方法。     

氧化低密度脂蛋白对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的　观察氧化低密度脂蛋白(ox LDL)对外周血内皮祖细胞(EPC)数量和功能的影响。方法　密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞并加入不同浓度ox LDL(分别为25,50,100,200μg/ml)和LDL(100μg/ml)培养一定的时间(6、12、24和48h)。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPC,分别观察EPC的增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力。结果　Ox LDL显著减少外周血EPC数量,200μg/mlox LDL作用24h对EPC数量的影响最为显著(较对照组减少了近70%,P<0.01)。另外,100μg/mlox LDL呈时间依赖关系减少EPC数量,于24h达到高峰(P<0.01)。Ox LDL也显著损害了外周血EPC的黏附、迁移、增殖和体外血管生成能力。结论　Ox LDL可减少EPC数量并损害EPC功能。     

Soluble factors released by endothelial progenitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells

Circulating endothelial progenitor cells (EPC) are incorporated into newly formed capillaries, enhance neovascularization after hind limb ischemia and improve cardiac function after ischemic injury. Incorporated progenitor cells may also promote neovascularization and cardiac regeneration by releasing factors, which act in a paracrine manner to support local angiogenesis and mobilize tissue residing progenitor cells. Therefore, we analyzed the expression profile of cytokines in human peripheral blood-derived EPC as opposed to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human microvascular endothelial cells (HMVEC), and CD14(+) monocytes by microarray technology. A gene tree analysis revealed a distinct expression pattern of angiogenic growth factors in EPC, mature endothelial cells, and CD14(+) monocytes. VEGF-A, VEGF-B, SDF-1, and IGF-1 mRNA levels were higher in EPC as compared to HUVEC or HMVEC. The enhanced mRNA expression was paralleled by a significant release of VEGF, SDF-1, and IGF-1 protein into the cell culture supernatant of EPC. Moreover, immunohistological analysis of ischemic limbs from nude rats revealed that VEGF is also released from recruited human EPC in vivo. As a functional consequence, conditioned medium of EPC induced a strong migratory response of mature endothelial cells, which was significantly inhibited by VEGF and SDF-1 neutralizing antibodies. Finally, conditioned medium of EPC significantly stimulated the migration of cardiac resident c-kit(+) progenitor cells in vitro. Taken together, EPC exhibit a high expression of angiogenic growth factors, which enhanced migration of mature endothelial cells and tissue resident cardiac progenitor cells. In addition to the physical contribution of EPC to newly formed vessels, the enhanced expression of cytokines may be a supportive mechanism to improve blood vessel formation and cardiac regeneration after cell therapy.     

冠心病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的变化

目的 :观察冠心病 (CHD)患者外周血内皮祖细胞 (endothelialprogenitorcells,EPC)数量和功能的改变。方法 :选择CHD患者和非CHD患者各 2 0例 ,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞 ,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板 ,培养 7d后贴壁细胞进行细胞化学分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝血素Ⅰ和DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性细胞为正在分化的EPC。采用二苯基四氮唑嗅盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验观察EPC的增殖能力、迁移能力和黏附能力。 结果 :CHD患者外周血EPC数量明显减少 [(31.8± 7.7)∶(5 9.5± 10 .6 )EPC/视野 (× 2 0 0 ) ,P <0 .0 5 ],且CHD患者外周血EPC的黏附能力、迁移能力和增殖能力也明显受损。结论 :CHD患者外周血EPC数量减少、功能减退。     

脂肪基质细胞分泌的细胞因子对内皮细胞的作用

目的:分离培养脂肪基质细胞(ASCs),探讨其分泌的细胞因子及其生物活性作用。方法:人脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化后培养获得ASCs,流式细胞术鉴定其表型,ELISA法测定其分泌的血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)等,RT-PCR测定相应mRNA表达。ASCs培养液培养人脐静脉内皮细胞,细胞计数测定内皮细胞的增殖,AnexinⅤ/PI双染色法测定内皮细胞的凋亡情况。结果:培养获得ASCs,表型为CD34 、CD105 、CD31-、CD45-,VEGF、HGF、SDF-1α的含量分别为(75±16)、(637±157)、(482±113)ng/L,能促进内皮细胞的增殖(P<0·05),降低其凋亡(P<0·05),并能上调其bcl-2的基因表达(P<0·05)。结论:ASCs能分泌细胞因子,且对内皮细胞的增殖与凋亡有明显作用。     

Circulating endothelial and endothelial progenitor cells in patients with severe sepsis

Elevated circulating endothelial cell (CEC) and circulating endothelial progenitor cell (CEPC) counts may indicate vascular damage and disease status, but data on these cell populations in patients with severe sepsis are limited. This study compared CEC and CEPC counts in patients with and without severe sepsis following intensive care unit (ICU) admission. Venous blood samples were collected within 24 h, 48-72 h, and 120-144 h. Baseline demographics, 28-day mortality, ICU and hospital days, and Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) scores were recorded. Patients with (n = 18) and without (n = 28) severe sepsis were balanced for mean age (63.7 and 61.3 years, respectively) and gender. There were no differences in 28-day mortality, ICU days, or hospital days. Baseline SOFA scores were higher in the sepsis group. At 48-72 h, patients with severe sepsis had significantly higher median CEC counts (51.5 vs. 28.0 cells/4 ml of blood, P = 0.02). CEC values for all ICU patients were significantly (P < 0.05) higher than in healthy volunteers. CEPC counts in both cohorts ranged from 0 to > 21 colonies/4 ml blood (mean = 1.13 ± 2.25; median = 0) without significant differences at any time point. This study demonstrates the ability to quantify CECs and CEPCs using consensus methodology. Understanding the relationship between CEC/CEPC counts and outcomes may provide insight into the mechanisms of endothelial cell changes in severe sepsis.     

内皮祖细胞在肺动脉高压的作用

内皮祖细胞是成熟血管内皮细胞的前体细胞,属于干细胞群体,其在血管再生与修复方面的应用越来越受到关注.肺动脉高压作为一种致死性很高的肺血管疾病,其发病与血管内皮损伤密切相关.目前的研究证实,内皮祖细胞在肺动脉高压血管内皮修复中具有重要作用,内皮祖细胞移植有可能成为临床治疗肺动脉高压的一种有效手段.     

通心络对高血压患者血内皮微粒的影响

目的:探讨通心络对高血压患者循环血内皮微粒(EMPs)和血管内皮功能的影响。方法:94例高血压病患者被随机分为通心络组(48例)和常规治疗组(46例),另以20例健康者作为健康对照组。于治疗前、治疗后6个月采集静脉血,采用流式细胞术(FCM)测定患者血浆EMPs水平,同时测定血流介导的内皮依赖性血管舒张功能(FMD)的变化。结果:治疗前,与健康对照组比较,通心络组和常规治疗组EMPs水平明显升高,FMD明显降低(P均<0.01);在治疗后6个月,通心络组和常规治疗组EMPs和血压较治疗前明显降低,FMD明显升高,且与常规治疗组比较,通心络组EMPs水平[(785.4±119.4)个/μl比(727.2±128.2)个/μl]和血压[(140.9±9.6/80.8±6.5)mmHg比(136.1±10.8/76.1±7.4)mmHg]降低、FMD[(8.6±2.5)%比(9.7±2.1)%]升高得更为显著(P均<0.05)。直线相关分析显示,EMPs与收缩压水平呈显著正相关(r=0.463,P=0.002),与FMD呈显著负相关(r=-0.523,P=0.001)。结论:通心络治疗可明显降低高血压患者内皮微粒水平和改善其内皮功能;内皮微粒对评价高血压患者内皮功能障碍程度具有一定的临床意义。