外源性重组人骨形态发生蛋白-2应用于兔腰椎植骨融合中细胞增殖的实验研究

目的 探讨外源性重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)应用于兔腰椎后路横突植骨融合中的促成骨效应细胞增殖作用及其成骨机制. 方法 45只新西兰大白兔随机分为三组(n=15),建立腰椎后路横突间植骨融合模型,分别植入rhBMP-2/异体骨复合骨条(复合骨组)、自体髂骨条(自体骨组)、单纯异体髂骨条(异体骨组).用流式细胞仪检测2、7、14、28、35 d具有成骨效应的骨髓基质细胞(MSCs)、成骨细胞、血管内皮细胞的增殖量. 结果复合骨组MSCs增殖量在术后2、7、35 d均比自体骨组和异体骨组高,差异均有统计学意义(P<0.05).复合骨组成骨细胞增殖量除在术后2 d高于自体骨组,差异有统计学意义(P=0.028)外,在其他时间点差异均无统计学意义(P>0.05),但复合骨组成骨细胞增殖量在术后2、7、14、28、35 d时均高于异体骨组,差异有统计学意义(P<0.05).复合骨组血管内皮细胞增殖量在术后2、7、28 d均高于自体骨组和异体骨组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在脊柱融合的不同时间段,外源性rhBMP-2能有效地促进MSCs、成骨细胞、血管内皮细胞增殖.     

负载不同浓度骨形态发生蛋白的组织工程骨体内成骨的量效关系

目的以聚乳酸-羟基乙酸[poly-(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA]为支架,负载不同浓度的骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP),与骨髓基质干细胞(bonemarrowstemcells,BMSCs)构建成新型的组织工程骨,并观察其体内成骨的量效关系。方法制作新西兰大白兔桡骨中段15mm骨缺损实验模型,植入不同含量BMP的组织工程骨。24只兔随机分为三组:第一组:植入同时负载5.0mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的组织工程骨(10只);第二组:植入同时负载2.5mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的组织工程骨(7只);第三组:植入同时负载1.0mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的组织工程骨(7只)。术后对动物进行大体观察,摄X线片观察各组术后4、8、12周骨缺损修复情况,比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度。于术后第4、8、12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察,图像分析骨缺损区域骨小梁的生成数量;取第12周标本行生物力学检测。结果X线片显示术后4周三组动物的桡骨缺损区域均有明显骨痂生成;12周时三组的骨缺损完全愈合率分别为7/8、3/5、3/5;各时相局部X线阻射密度值与新生骨小梁百分比计量显示第一组的新生骨痂及骨小梁最多,并可见髓腔再通现象。生物力学检测结果显示第一组的压缩刚度、扭转刚度、三点弯曲断裂载荷均大于其他两组。结论含5.0mgBMP的PLGA支架与BMSCs复合构建的组织工程骨修复兔桡骨15mm骨缺损的效果最佳。     

基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损及相关免疫学研究

目的：观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损效果及异种骨支架体内应用的安全性。方法：①制备去抗原牛松质骨块（BCB），植入小鼠股四头肌袋内，术后行淋巴细胞转化试验和组织学观察。②在腺病毒载体介导下将BMP-2基因导入兔骨髓间质干细胞后，种植到BCB支架中，构建基因修饰的组织工程骨。于兔双侧桡骨中段造成15mm骨缺损，采用5种方法进行处理：BMP-2基因转染细胞＋B（B（A组）；未转染细胞＋重组BMP-2＋BCB（B组）；对照基因转染细胞＋BCB（C组）；未转染细胞＋B（B（D组）；单纯BCB（E组）。术后4、8、12周行X线、组织学和生物力学检测。结果：①BCB具有较低的抗原性和良好的组织相容性；②A组术后4周诱导生成软骨组织并向编织骨转化，12周骨缺损修复，髓腔再通，新骨强度明显优于其他各组（P〈0．01）。结论：BMP-2基因修饰的组织工程骨是修复节段性骨缺损的好方法。     

纤维蛋白凝胶复合rhBMP-2及骨髓基质干细胞应用于兔脊柱融合的实验研究

目的观察纤维蛋白凝胶（fibrin glue，FG）复合rhBMP-2及骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）用于兔横突间脊柱融合的效果。方法取1月龄日本大耳白兔股骨MSCs体外原代培养，传代培养时加入成骨诱导物向成骨方向诱导分化。40只1岁龄日本大耳白兔随机分为4组，根据植入的材料分别为：MSCs／rhBMP-2／FG组，MSCs／FG组，rhBMP-2／FG组，FG组。复合物置于皮质已打磨的左侧k-6横突上。脊柱标本均于术后6周取材，应用手法检测、DR拍片、CT扫描三维重建、灰度分析、生物力学检测、组织学染色等方法观察各组脊柱融合效果。结果手法检测和DR片示MSCs/rhBMP-2/FG组融合率分别为70％和80％，rhBMP-2/FG组经两种方法检测融合率均为40％。MSCs/FG组和FG组无脊柱融合标本。MSCs／rhBMP-2／FG组与rhBMP-2／FG组在融合率上虽无统计学差异，但在成骨密度和面积上存在显著差异，生物力学检测结果示MSCs，rhBMP-2/FG组在各方向上的融合强度均显著高于其他三组。CT扫描三维重建显示MSCs／rhBMP-2／FG组k-6横突间有连续骨组织生成。组织学染色示MSCs／rhBMP-2／FG组和rhBMP-2/FG组融合标本横突间为成熟骨组织。结论MSCs／rhBMP-2／FG复合物应用于兔横突间脊柱融合可以取得良好成骨质量。     

重组人骨形态发生蛋白-2/异体骨复合骨用于兔腰椎融合的正电子发射计算机体层摄影-CT研究

目的 通过应用正电子发射计算机体层摄影-CT(PET-CT)研究重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)/异体骨复合骨行兔腰椎融合术后不同时间点融合骨组织再血管化程度及成骨活性的变化.方法 成年雄性新西兰大白兔45只,随机分为3组,每组15只.在每只兔的L4、L5横突间行腰椎后路植骨融合术,3组分别植入rhBMP-2/异体骨复合骨条(复合骨组)、自体髂骨条(白体骨组)及异体髂骨条(异体骨组),每组于术后2、4、6周注射18F-NaF,利用PET-CT对各组动物进行全身显像,对比各组植骨区摄取值(SUV).结果 2、4、6周时复合骨组和白体骨组植骨区对18F-NaF的SUV均优于异体骨组,差异有统计学意义(P＜0.05);复合骨组植骨区的SUV在4、6周时高于自体骨组,差异有统计学意义(P＜0.05),2周时与自体骨组差异无统计学意义(P＞0.05).同一组内不同时间点复合骨组和白体骨组均在4、6周时局部SUV高于2周时,差异有统计学意义(P＜0.05);4周与6 周之间差异无统计学意义(P＞0.05).异体骨组的SUV 3个时间点问差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 兔腰椎后路植骨融合术中PET-CT检测显示:rhBMP-2/异体骨复合骨可促进骨形成并改善局部血液供应,可作为替代自体骨的理想材料.     

脊柱后外侧融合过程中BMP-2、BMP-4基因的动态表达

目的：研究脊柱后外侧融合过程中骨形态发生蛋白(BMP)的表达情况，探讨BMP对融合过程的作用。方法：36只成年雄性新西兰白兔，制作L4、L5双侧横突间自体骨植骨模型，按术后处死时间(0d、2d、4d、1周、2周、3周、4周、5周、6周、10周、6个月、10个月)随机平均分为12组。将融合组织平均分为3等份，与横突交界的上、下区域定为边缘区，中间区域定为中央区。以RT-PCR法检测不同时间段、不同融合区域BMP-2 mRNA、BMP-4 mRNA的表达水平。结果：在脊柱融合术后1～6周，BMP-2和BMP-4表达量明显增高，并各自出现相应的峰值。中央区BMP表达水平的增幅及峰值明显低于边缘区，其开始增高的时间及峰值出现的时间滞后于边缘区1～3周，表现出明显的时间和空间差别：结论：脊柱融合中央区BMP低表达及时间滞后可能是不融合发生的重要原因。在融合早期补充外源性BMP可能有助于提高融合率。     

组织工程化脂肪基质细胞诱导脊柱融合的实验研究

目的 探讨组织工程化脂肪基质细胞诱导脊柱融合的能力.方法 从成年大鼠腹股沟处无菌获取脂肪组织,消化分离培养出脂肪基质细胞.在大鼠脊柱融合模型中将32只大鼠随机分为4组,每组8只,分别植入骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因重组的腺病毒载体转染的脂肪细胞(A组)、LacZ基因重组的腺病毒载体转染的脂肪细胞(B组)、未转染脂肪细胞(C组)、胶原海绵对照(D组).测定A组和B组的BMP-2的定量表达.比较4组术后4、6、8周X线片评分.8周后处死大鼠,进行MicroCT扫描分析和组织学观察.结果 ELISA法结果显示A组BMP-2表达水平为3.46 ng/mL,而B组无BMP-2表达.A组4、6、8周X线片评分分别为(4.56±1.01)分、(4.72±0.24)分、(4.92±0.13)分,均明显高于其他组,差异有统计学意义(P＜0.05).Micro CT和组织学切片均显示A组全部获骨性融合,而其他组均未融合.结论 组织工程化的脂肪基质细胞能够很好地诱导脊柱融合,有望成为一种新颖、有效的治疗方法.

Abstract：

Objective To assess the capability of inducing spinal fusion by adipose derived stromal cells in a rat model. Methods Adipose derived stromal cells were isolated from inguinal fat pads in rats.In the rat model of spinal fusion,32 rats were randomized into 4 groups.In group A,the cells infected with AdBMP-2 were implanted.In group B,cells infected with AdLacZ were implanted.In group C,uninfected cells were implanted.In group D,only collagen sponges were implanted.Expressions of BMP-2 were quantified in groups A and B.The radiographic scores were compared at weeks 4,6 and 8 among the 4 groups.After sacrifice at week 8,the spine samples were assessed by radiographs,MicroCT,and histological analysis. Results ELISA revealed a 3.46 ng/mL expression of BMP-2 in group A but no expression in group B.The mean radiographic scores for group A at weeks 4,6 and 8 were 4.56 ± 1.01,4.72 ± 0.24,4.92 ±0.13,significantly higher than those for the other groups ( P ＜ 0.05) .MicroCT and histological analysis revealed spinal fusion in all the rats in group A.None of the rats in the control groups developed fusion.Conclusion Because tissue engineered adipose derived stromal cells can induce spinal fusion,they may be a promising strategy for spinal fusion in the future.     

rhBMP-2在老年兔后外侧脊柱融合中作用的实验研究

目的:通过对老年和青年兔采用基因重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)和自体骨移植进行腰椎后外侧横突间融合手术实验研究,揭示rhBMP2在老年动物脊柱融合中的作用效果。方法:采用24只雌性新西兰大白兔,体重3.5～4.5kg,6月龄(青年)和24月龄(老年)各12只。随机分成4组:①青年自体髂骨移植组[ICBG(Y),6只];②青年rhBMP2组[rhBMP2(Y),6只];③老年自体髂骨移植组[ICBG(O),6只];④老年rhBMP2组[rhBMP2(O),6只]。同一天施行腰椎后外侧横突间融合术。rhBMP2和自体髂骨分别植入两侧L5-L6横突间。术后3、6周分别处死一半。结果采用手动触诊,X线摄片,CT三维扫描和组织学评估。结果:X线片及三维CT显示rhBMP2组的融合率均高于自体髂骨移植组,而青年各组融合率比老年组高,各组之间比较差异具有统计学意义(P0.05)。CT三维重建显示由于rhBMP2是液态,有流动性,成骨范围较大,不局限于计划融合区。组织学显示老年rhBMP2组成骨面积较青年rhBMP2组小,而且骨小梁结构也不如后者密集。结论:与自体髂骨移植比较,rhBMP2可显著增强老年兔脊柱后外侧融合率和新骨生成量,加快融合时间,可以取代自体髂骨移植。rhBMP2促进骨再生能力受年龄影响。     

基因修饰细胞和成骨蛋白在脊柱融合中作用比浇

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导大鼠脊柱融合的能力,并与已广泛商品化使用的BMP-2蛋白比较.方法 分别将携带BMP-2和β-半乳糖苷酶的腺病毒转染BMSCs,在大鼠脊柱融合模型中建立5个实验组,每组8只,分别植入:Ⅰ组,5×106个BMP-2转染细胞;Ⅱ组,5×106个β-半乳糖苷酶转染细胞;Ⅲ组,10μgBMP-2蛋白;Ⅳ组,5×106个未转染细胞;Ⅴ组,单独的胶原海绵.8周后处死大鼠,进行各项观察.结果 手触力学评价显示Ⅰ、Ⅲ组全部达到骨性融合,而其他组均未融合.X线评分Ⅰ组(5.02)和Ⅲ组(4.21)也明显高于其他组.Micro-CT和组织学切片显示Ⅲ组的新骨骨量较少,骨小梁较细.结论 基因修饰的骨髓间充质干细胞能够很好地诱导脊柱融合,诱导效果要好于商品化的BMP-2蛋白.     

丝素蛋白增强型磷酸钙复合rhBMP-2用于绵羊腰椎椎体间融合的实验研究

目的 评价可注射丝素蛋白增强型磷酸钙(silk fibroin/calcium phosphate cement,SF/CPC)复合人重组骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)应用于绵羊腰椎椎体间融合的效果.方法 24只绵羊均建立L1.2、L3.4和L5.6前路椎体间融合模型.每只绵羊的3个腰椎间隙随机植入SF/CPC、CPC/rhBMP-2、SF/CPC/rhBMP-2和自体髂骨中的3种.分别于术后6个月和12个月各处死12只绵羊.每个时段均获得36个腰椎手术节段,每种材料9个节段.通过大体观察、手触检测、CT扫描、非破坏性生物力学测试和组织学观察分析脊柱融合状况.结果 术后6个月时,手触检测SF/CPC、CPC/rhBMP-2、SF/CPC/rhBMP-2以及髂骨的融合率分别为0、33.33%(3/9)、55.56%(5/9)和77.78%(7/9);12个月时为11.11%(1/9)、44.44%(4/9)、77.78%(7/9)和77.78%(7/9).生物力学显示6个月时,前屈、后伸、左屈和右屈的融合刚度:髂骨＞SF/CPC/rhBMP-2＞CPC/rhBMP-2＞SF/CPC;12个月时SF/CPC/rhBMP-2刚度与髂骨相近,SF/CPC最小.组织学定量表明:6个月时,髂骨新生骨量＞SF/CPC/rhBMP-2＞CPC/rhBMP-2＞SF/CPC;而钙磷残留量依次增多;12个月时,SF/CPC/rhBMP-2新生骨量与髂骨相近;SF/CPC最少;钙磷残留量依次增多.结论 SF/CPC/rhBMP-2人工骨具有骨传导和骨诱导性,降解与成骨能力匹配,是一种理想的脊柱融合材料.     

骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及复合纳米羟基磷灰石体外构建组织工程骨的研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(rBMSCs)后复合到纳米羟基磷灰石(Nano-HA)体外构建仿生人工骨的可行性. 方法 采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,溶胶-絮凝法制备Nano-HA,用Ad-BMP-2转染体外培养的rBMSCs,免疫组化、RT-PCR和蛋白印迹方法检测转染后细胞的BMP-2表达.将转染48 h的细胞均匀接种到Nano-HA支架上,第3、5天取细胞载体复合物扫描电镜观察细胞贴附、生长状况,消化收集贴附支架的细胞,蛋白印迹检测贴附支架细胞BMP-2的表达.结果 转染后BMP-2基金在mRNA水平和蛋白水平均有高表达;扫描电镜见转染细胞在支架材料分布均匀,黏附良好,转染后及复合后Western Blot检测BMP-2表达较高.结论 利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外成功地构建了仿生人工骨.     

Experimental study of carriers of bone morphogenetic protein used for spinal fusion

Many materials have been used experimentally as carriers of osteoinductive growth factors. However, there is some doubt about whether the biomechanical strength of the materials affects spinal fusion from early stages of recovery. The aim of this study was to clarify which carrier was biomechanically more effective for bone morphogenetic proteins in spinal fusion. Three biomaterials, each having a different structure and biomechanical strength, were selected as carriers of recombinant human bone morphogenetic protein-2: (1) -tricalcium phosphate cement, which has sufficient biomechanical strength; (2) sintered bovine bone (True Bone Ceramics) coated by type I collagen, which is similar to artificial hydroxyapatite; and (3) type I collagen sheet. Bilateral lumbar intertransverse process arthrodeses were designed in a rabbit model. Spinal fusions were evaluated by radiographic analysis, manual palpation, biomechanics (uniaxial tensile test), and histologic analysis (hematoxylin and eosin, and Villanueva-Goldners trichrome stains) 3 and 6 weeks after surgery; they were then compared for the three carriers. For achieving the earliest solid spinal fusion, -tricalcium phosphate cement (which has good inherent strength) and True Bone Ceramics (which has good porosity to allow bone penetration) did better than plain collagen (the commonly used carrier).     

低温保存对组织工程骨特性影响的实验研究

目的 了解不同低温保存方法对组织工程骨支架生物特性和成骨细胞功能的影响。方法 组织工程骨分别在4℃和-196℃环境下保存3，6个月，以未行保存的组织工程骨和单纯生物衍生骨作为对照。实验分为7组，组织工程骨4℃保存3个月为A3组，保存6个月为A6组，-196℃保存3个月为B3组，保存6个月为B6组，未行保存的组织工程骨为C组，单纯生物衍生骨组为D组，新鲜人体骨为S组（仅作生物力学）。观察细胞的黏附与生长，并行材料的生物力学、碱性磷酸酶活性（ALP）、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率等检查。结果 所有组织工程骨各组均可见成骨细胞在材料表面黏附，细胞在材料孔隙内生长、分化和增殖；材料的力学性能检测显示A3、A6、B3、B6、D组各组间最大载荷比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；A3、A6、B3、B6、D组分别与S组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；各组成骨细胞ALP活性、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率依次为C组〉B3组〉B6组〉A3组〉A6组。结论 4℃保存方法和-196℃保存方法对生物衍生骨的生物力学性能无明显的影响。4℃保存方法和-196℃保存方法对细胞的存活率和细胞的生物活力有明显的影响，但均能在一定程度上保存细胞的存活率和的细胞的生物活力。-196℃保存方法优于4℃保存方法，但4℃保存方法操作简单、方便和经济。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSc),检测外源基因的表达.方法常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达.结果原位杂交和免疫组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现.结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达.     

Promoting lumbar spinal fusion by adenovirus-mediated bone morphogenetic protein-4 gene therapy

Objective: To determine whether an adenoviral construct containing bone morphogenetic protein-4(BMP-4) gene can be used for lumbar spinal fusion. Methods: Twelve New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups, 8 in the experimental group and 4 in the control group. Recombinant, replication-defective type 5 adenovirus with the cytomegalovirus (CMV) promoter and BMP-4 gene (Ad-BMP-4) was used. Another adenovirus constructed with the CMV promoter andβ-galactosidase gene (Ad-β-gal) was used as control. Using collagen sponge as a carrier, Ad-BMP-4 (2.9×108 pfu/ml) was directly implanted on the surface of L5-L6 lamina in the experimental group, while Ad-β-gal was implanted simultaneously in the control group. X-ray was obtained at 3, 6, and 12 weeks postoperatively to observe new bone formation. When new bone formation was identified, CT scans and three-dimensional reconstruction were obtained. After that, the animals were killed and underwent histological inspection. Results: In 12 weeks after operation, new bone formation and fusion were observed on CT scans in the experimental group, without the evidence of ectopic calcification in the canal. Negative results were found in the control group. Histological analysis demonstrated endochondral bone formation at the operative site and fusion at early stage was testified. Conclusions: In vivo gene therapy using Ad-BMP-4 for lumbar posterolateral spinal fusion is practicable and effective.