噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

从噬菌体肽库中筛选并鉴定CD13特异性结合肽

目的 筛选并鉴定可和单核细胞表面CD13分子特异性结合的特异性短肽.方法 以CD13为靶分子,用噬菌体展示十二肽库进行筛选,通过亲和富集法筛选表达有特异性结合肽的噬菌体,ELISA鉴定所挑选噬菌体和CD13的亲和力,根据噬菌体基因序列推导出多肽序列.对筛选到的并经比对分析认为有生物学特性的多肽进行人工合成,通过免疫荧光技术检测多肽和THP-1细胞的结合情况、位置及WM15对多肽和细胞结合的阻断作用.结果 经过四轮筛选,与CD13特异性结合的噬菌体得到有效富集并最终接近饱和状态.第4轮筛选后回收率与第1轮相比,富集了30倍.挑取的20个噬菌体单克隆中,经ELISA鉴定有10个和CD13的亲和力较高,有阳性意义.经比对得到2个有生物学功能的多肽序列P9、P7,它们分别和人巨细胞病毒(HCMV)UL38、UL105基因编码的相应氨基酸序列有83%、100%相似性.免疫荧光检测可见多肽P9、P7和THP-1细胞的结合位于细胞膜表面.WM15可以不同程度的阻断多肽和细胞的结合.结论 成功筛选出了2条可和CD13特异性结合的短肽P9、P7,而且P9、P7可以和THP-1细胞膜表面的CD13分子特异性结合.     

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的：随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17（Sp17）特异性结合的短肽序列,并进行鉴定.方法：以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛.富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析.结果：随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRMII、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMRIMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRRIRKQ.结论：从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列.     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

利用噬菌体肽库筛选Survivin结合肽

目的：将纯化的Survivin蛋白作为诱饵,从噬菌体肽库中筛选出结合肽。方法：用纯化的Sur-vivin蛋白包被35 mm的塑料培养皿,加入随机12肽的噬菌体肽库,用靶分子溶液竞争性洗脱结合的噬菌体,通过测定噬菌体滴度检测Survivin蛋白的吸附、富集效果,筛选阳性噬菌斑,制作DNA测序模板进行测序。结果：经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效果。从第3轮筛选产物中挑取8个蓝色噬菌斑（阳性克隆）进行测序,DNA测序结果表明,具有一致性序列GIANNFFTLKIS。结论：从噬菌体随机肽库中,筛选到能与Survivin蛋白特异性结合的一段短肽,为Survivin蛋白的进一步研究奠定基础。     

用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白

目的:用T7噬菌体筛选系统筛选乙型肝炎病毒PreS1的相互作用蛋白.方法:应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到的乙型肝炎病毒PreS1作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行生物筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果:经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与乙型肝炎病毒PreS1相互作用的蛋白可能为:细胞色素C氧化酶1(Cytochrome c Oxidase Subunit Ⅰ,COX1).结论:T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨PreSI的致病机制提供重要依据.     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

噬菌体展示随机十五肽库的构建

为了满足药物筛选的需要,本实验以pCANTAB 5E噬菌粒为载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十五肽库。通过自行设计引物与模板,人工合成编码随机十五肽的寡核苷酸片段及含有酶切位点的引物。通过PCR技术进行模板扩增获得编码随机十五肽的基因。将扩增后的目的基因经过Sfi Ι,Not Ι两个限制性内切酶双酶切后,与经同样双酶切的5′去磷酸化的噬菌粒载体连接,将重组产物电转入大肠埃希菌TG1感受态细胞。集合菌落后进行库容和多样性检验。所建肽库库容可达5×10⁸。随机挑取20个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机。成功构建了库容量与多样性都满足筛选要求的噬菌体展示随机十五肽库。     

噬菌体展示肽库技术应用的研究进展

噬菌体展示肽库技术是一种新的肿瘤筛选技术，它将随机多肽文库表达于丝状噬菌体的表面，使高通量筛选多肽配体变得容易些。该技术在研究蛋白质之间的相互作用、寻找肿瘤特异性抗原和治疗性靶肽以及在新型诊断试剂和疫苗研制中都有重要用途。     

从噬菌体展示随机肽库中筛选豌豆凝集素的结合肽

目的:从噬菌体展示随机肽库中筛选能与豌豆凝集素(PSA)特异结合的短肽.方法:①用豌豆凝集素(PSA)作为靶蛋白,对噬菌体展示的随机六肽库进行亲和筛选;②α-甲基-D-甘露糖苷对筛选出的噬菌体和PSA结合的影响实验(点印迹法); ③选择性地合成了3条6肽ARMWSF、RYDYSY、LRLRQL,用不同浓度的6肽对PSA、ConA与HRP的结合进行竞争抑制实验.结果:经过三轮筛选后,这些噬菌体展示肽有明显的富集,从第三轮挑选的22个克隆的插入氨基酸序列可分为三大类;点印迹结果表明,这些噬菌体展示肽能与PSA特异结合,而α-甲基-D-甘露糖苷不同程度地抑制这种结合; LRLRQL不溶于水,ARMWSF和RYDYSY对PSA和HRP的结合有抑制,而对ConA和HRP的结合没有明显抑制.结论:人工合成的2条6肽和PSA的结合部位与α-甲基-D-甘露糖苷和PSA结合的部位并非相同.     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位

目的：筛选能识别庚型肝炎病毒（ＨＧＶ） Ｅ２区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽。方法：利用抗ＨＧＶ Ｅ２区的３株单克隆抗体Ｍ６,Ｍ１３,Ｍ３０作为筛选配基,对构象限制性的随机环９肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定。结果：证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出１６个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有１４个克隆与Ｍ６抗体有较强的特异结合;其中１０个克隆在竞争抑制实验后中抑制率大于５０％     

运用噬菌体展示随机肽库筛选与内毒素结合的高亲和性多肽

目的 从噬菌体展示随机肽库中筛选与内毒素结合的多肽序列,并进行鉴定.方法 以内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为靶分子对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮亲和筛选,获得与LPS结合的噬菌体克隆,应用结合实验和克隆斑抑制实验进一步确证.挑选结合力强的克隆进行DNA测序,推导出呈现的多肽序列,应用生物信息学软件进行多肽序列分析和同源性分析.结果 经4轮亲和筛选从噬菌体展示随机十二肽库中筛选获得了86个克隆,挑选12个结合力强的克隆进行DNA序列测序及生物信息学分析,结合本项目组的噬菌体展示随机七肽库筛选结果推导出呈现的多肽序列为HWQWPHWSPPP(命名为P11肽).检索相关数据库发现此肽序列未被申请专利,体内约908种蛋白与其结构相匹配,其中包含有与LPS相互作用的位点.结论 通过对噬菌体展示随机肽库的淘选,获得与LPS结合的高亲和性多肽,为进一步以这些多肽为先导物进行定向进化研究提供了实验依据和结构基础.     

噬菌体肽库筛选隐丹参酮高亲和性结合肽

通过噬菌体十二肽库,以隐丹参酮为靶分子,筛选与隐丹参酮具有高亲和性的结合短肽。经过噬菌体十二肽库的3轮淘选,获得阳性噬菌体克隆,挑选结合力强的克隆进行测序,得到隐丹参酮的高亲和性结合短肽序列,并进行生物信息学分析。本试验共筛选到10个隐丹参酮的高亲和性结合短肽序列,有614种蛋白质与其结构相匹配。多肽序列的核心序列为VILDFGEI。本研究获得了与隐丹参酮结合的高亲和性多肽,为深入研究隐丹参酮的作用靶点以及分子作用机制提供了实验依据和结构基础。     

乙型肝炎病毒S1抗原检测及其与HBeAg的关系探讨

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原与HBeAg及HBV在体内复制和感染的存在关系。方法采用ELISA法对280例乙肝肝炎病毒感染者中HBeAg阳性患者血清进行前S1抗原检测。结果乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原在血清学表达上与HBeAg的阳性符合率高达91.43％。结论乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原与HBeAg平行存在,是乙型肝炎病毒在体内存在的复制和感染的可靠指标。     

TGF-beta1 phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit the activity of keloid fibroblasts

Background Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) is known to have a role in keloid formation through the activation of fibroblasts and the acceleration of collagen deposition. The objective of this current study was to isolate TGF-beta1 phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their therapeutic effect on inhibiting the activity of keloid fibroblasts. Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human TGF-beta1 as the target to obtain specific phages containing ectogenous model peptides similar to TGF-beta1. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to select monoclonal phages with good binding activity, which underwent DNA sequencing. MTT assay and apoptosis assessment were used to evaluate the biological effects of the phage model peptides on keloid fibroblasts. Immunofluorescence assay was employed to show the binding affinity of the model peptides on phages causing keloid fibroblasts. Quantitative real-time PCR analysis was carried out to detect the expressions of Nuclear factor kappa B (NF-kappa B) mRNA, connective tissue growth factor (CTGF) mRNA and TGF-beta receptor II (TβRII) mRNA in keloid fibroblasts. Results Specific phages with good results of ELISA were beneficiated. Four phage model peptides were obtained. The data of MTT showed that TGF-beta1 and one phage model peptide (No.4) could promote keloid fibroblasts proliferation, however, three phage model peptides (No.1-3) could inhibit keloid fibroblasts proliferation. The results of apoptosis assessment showed that the three phage model peptides could slightly induce the apoptosis in keloid fibroblasts. The data of immunofluorescence assay revealed that the model peptides on phages rather than phages could bind to keloid fibroblasts. The findings of quantitative real-time PCR analysis suggested that the expressions of NF-Kappa B mRNA and CTGF mRNA in the three phage model peptides groups decreased, while the expression of TβRII mRNA slightly increased. Conclusions Three phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit keloid fibroblasts proliferation and induce the apoptosis in keloid fibroblasts. They can inhibit the activity of keloid fibroblasts by blocking TGF-beta1 binding to its receptor and then regulating the expressions of NF-kappa B, CTGF and TβRII.     

汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定

目的：应用噬菌体展示肽文库筛选可与肾综合征出血热病毒mAb B11特异性结合的短肽。方法：采用Protein-A亲和纯化的单抗为筛选配基，对噬菌体展示的随机12肽文库进行生物亲和淘选，夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果：通过4轮淘选，ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽多数能与B11单抗特异性地结合（12／15），序列分析表明8个阳性克隆氨基酸序列分为4组，同源性分析显示核心序列可能为（M／F）HR（H／T）X（H／W）或（R／F）HX（H／T）P（W／M）（L／Y）。结论：基于表位水平的HFRSV特异性诊断试剂的研制和小分子多肽疫苗的设计提供了重要依据     

用噬菌体随机12肽库筛选单纯疱疹病毒2型gD基因模拟抗原表位的研究

目的用针对HSV-2gD的单克隆抗体（McAb）从噬菌体展示随机12肽库中筛选HSV-2gD基因的抗原模拟表位，寻找更有效的小片段短肽作为HSV新型基因工程疫苗的候选抗原。方法利用HSV gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库，经“吸附-洗脱-扩增”的4轮筛选，随机挑取噬菌体克隆经酶联免疫吸附实验（ELISA）进行鉴定，并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定和计算机辅助分析。结果经4轮生物淘筛后特异性噬菌体克隆得到了富集，对阳性克隆的分析结果表明P-PLW和PYH--H氨基酸序列是模拟妒基因抗原表住的骨架结构，携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合。结论从噬菌体随机12肽库中筛选到的外源序列可以模拟HSV-2 gD McAb针对的抗原表位，可能是HSV-2gD一个抗原表住的替代抗原，为进一步研究HSV-2基因疫苗奠定了基础。     

HBV感染者血清HBV PreS1抗原检测与病毒复制的关系

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)PreS1抗原与HBV复制的关系.方法采用ELISA法检测HBV血清标志物和HBV PreS1抗原;采用荧光定量PCR方法检测HBV-DNA,对检测结果作分析.结果HBVPreS1抗原和HBV-DNA在HBeAg阳性标本组中的检出率明显高于其在HBeAg阴性标本组中的检出率(P＜0.01);HBV PreS1抗原和HBV-DNA有较高相关性(P＜0.01).结论HBV PreS1抗原与具有病毒活动性复制意义的指标(HBeAg和HBV-DNA)有良好的相关性,HBV PreS1抗原的检测结果可以较好地反映HBV的复制情况.