皮肤感染性肉芽肿常见病原菌微孔板反向杂交检测法的研究

目的 探讨微孔板反向分子杂交技术与PCR-ELISA相结合的“拟芯片”法检测和鉴定皮肤感染性肉芽肿常见病原菌的方法。 方法 选取、设计真菌和分枝杆菌两对通用引物,及10种皮肤感染性肉芽肿常见的病原菌：结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、偶遇分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、申克孢子丝菌、卡氏枝孢霉、裴氏着色真菌、F. Monophora、白念珠菌的特异性探针;采用标准株验证通用引物、特异性探针并检测“拟芯片”法的敏感性、特异性;对19株临床分离株进行检测和鉴定。 结果 两对通用引物均可扩增出对应的菌种基因序列,PCR产物经测序分析与预期相符;“拟芯片”法检测阴性标本吸光度为0.041 ± 0.02,公式计算得临界值为0.101,在此基础上测得其敏感性为1 × 10 ~ 1 × 102个菌细胞/ml。各病原菌与相应的探针杂交,吸光度均 ＞ 0.101,为阳性;而与非对应的探针杂交,则吸光度 ＜ 0.101,为阴性,特异性高;对临床分离株的菌种鉴定准确率高。 结论 “拟芯片”法可应用于皮肤感染性肉芽肿常见病原菌的实验室快速检测和鉴定。     

皮肤分枝杆菌感染的研究进展

皮肤分枝杆菌感染是一类复杂的皮肤疾病,临床和病理无特异表现,易漏诊误诊。临床上大致分为3类,皮肤结核、麻风、非结核分枝杆菌感染性皮肤病。本文就各类分枝杆菌感染相关的皮肤疾病进行流行病学特征、临床表现、诊断及治疗进展进行综述。     

皮肤结核分枝杆菌感染1例

患者女,86 岁.因右侧颈部出现环状斑块5 个月,伴轻度疼痛,于2010 年3 月至我科门诊就诊.皮损初发时为黄豆大,曾在外科以脓肿切除,但伤口不愈合,并逐渐扩大,当时外科发现右耳下淋巴结轻度肿大,未处理.3 年前摔倒后右肩部骨折,未手术逐渐恢复.近2 年有慢性肾功能不全,口服肾衰宁等药物,病情维持稳定.     

PCR-RFLP分析鉴定皮肤组织中的分枝杆菌

目的 探讨用PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中分枝杆菌。方法 皮肤感染性肉芽肿患者组织标本9份.提取组织DNA,进行PCR扩增,PCR产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ2种限制性内切酶进行酶切,3%Nusieve 3:1琼脂糖凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性分析,并与培养结果进行比较。结果 从5份临床诊断为游泳池肉芽肿的组织标本中检测出海分枝杆菌,从另4份诊断为皮肤感染性肉芽肿的标本中检测出2份结核分枝杆菌和2份脓肿分枝杆菌,此9份结果与培养鉴定结果完全一致。结论 用PCR-RFLP方法可以快速鉴定皮肤感染性肉芽肿组织中的分枝杆菌。     

皮肤非结核分枝杆菌感染

正非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)是指除结核杆菌和麻风杆菌以外的分枝杆菌,可引起多种不同系统和器官感染,主要受累器官为肺、淋巴结、皮肤、软组织和骨,其临床表现错综复杂。随着HIV感染患者的增多及免疫抑制剂等使用的增加,NTM感染的报道日     

皮肤苏尔加分枝杆菌感染一例

患儿女,7岁,因左侧面部斑块4年就诊。皮肤科检查：左侧面部见6 cm × 5 cm境界清楚环状斑块,质韧,无明显触痛,皮损表面可见脓痂。组织病理：表皮部分破溃、坏死,真皮内弥漫性淋巴、组织细胞及上皮样细胞浸润,局灶伴较多嗜中性粒细胞。过碘酸雪夫染色（PAS）阴性、抗酸染色阴性。组织培养25 d后见暗产色分枝杆菌菌落。菌落涂片抗酸染色阳性。PCR扩增16S rRNA、hsp65基因产物发现与苏尔加分枝杆菌同源性最接近,分别为100%、99%。给予利福平、异烟肼、乙胺丁醇治疗后好转。     

皮肤非结核分枝杆菌感染1例

患者男,31岁,从事污水排放设备修理。左手指、手背及上肢相继出现结节3个月。发病前工作中左手中指曾被擦破,后出现肿胀,当地医院予抗感染半个月,但左手中指肿胀无改善,且左手背部相继出现7个蚕豆大结节,无疼痛,伴轻度瘙痒。饲养多种鱼类。皮损组织病理示:感染性肉芽肿改变,部分呈结核样肉芽肿结构。真菌培养阴性,分支杆菌培养和抗酸染色均阴性。诊断:皮肤非结核分枝杆菌感染;游泳池肉芽肿?予口服利福平、乙胺丁醇和克拉霉素治疗4个月,痊愈。     

皮肤分枝杆菌DNA提取方法比较分析

目的 比较分枝杆菌DNA提取的常用方法。 方法 分别采用传统的冻融法和两种试剂盒（A、B）对不同浓度结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和耻垢分枝杆菌纯菌悬液及模拟标本进行总DNA提取。通过检测DNA纯度和PCR产物比较3种方法的提取效果,并应用临床皮肤组织标本进一步验证。 结果 3种方法提取的分枝杆菌DNA均能用于PCR检测。试剂盒A获得的DNA纯度最高,冻融法其次,试剂盒B杂质最多;灵敏性检测显示3种方法可检测出的纯菌悬液最低浓度皆为102菌细胞/ml;对于模拟标本,在103菌细胞/ml时检出率为100%,在102菌细胞/ml时试剂盒A、B和冻融法检出率分别为60%（12/20）、55%（11/20）、55%（11/20）;临床标本检测结果提示,试剂盒B可用于石蜡标本DNA的提取,对分枝杆菌感染组织提取率同其它两种方法基本一致。 结论 试剂盒A通过多次过柱洗涤可快速获得分枝杆菌的优质基因组DNA,为实验研究及临床检测的首选;试剂盒B单次试剂处理除适用于石蜡标本提取DNA外,可用于新鲜组织标本的协同检测。     

皮肤非结核分枝杆菌感染三例

目的评价T-SPOT.TB在皮肤非结核分枝杆菌感染中的诊断价值。方法对3例拟诊为游泳池肉芽肿的患者在治疗前后进行T-SPOT.TB检测。结果例1显示相对分子质量6 000早期分泌靶向抗原(ESAT-6)阴性,相对分子质量10 000培养滤过蛋白肽段库(CEP-10)阳性;例2显示ESAT-6及CEP-10均阳性;例3显示ESAT-6阳性,CEP-10阴性。3例患者经过口服利福喷丁、乙胺丁醇和克拉霉素治疗4个月,皮损均获得痊愈。治疗后检测T-SPOT.TB,例1和例3阳性结果全部转阴。结论初步研究显示,在拟诊皮肤非结核分枝杆菌感染中检测T-SPOT.TB在快速和准确诊断方面有重要的参考意义。     

儿童皮肤非结核分枝杆菌感染1例

患儿女,3岁6个月。右臀部皮疹3年,局部曾有蚊虫叮咬史。皮损特征为边界清楚的紫红色溃疡性斑块。病理显示为结核样肉芽肿改变,抗酸染色阳性。诊断:非结核分枝杆菌感染。予口服利福平联合克拉霉素治疗3个月,皮损愈合。     

检测泌尿生殖道感染常见性病病原体基因芯片的构建

目的 建立检测泌尿生殖道性传播感染常见病原体的基因芯片技术。方法 首先将9种目的病原体分为病毒、细菌及低级真核生物三类,分别设计1对荧光标记的通用引物,利用多重PCR技术使3对引物置于同一反应体系进行扩增,再将特异性探针点样于玻片上制备成基因芯片,与扩增产物进行杂交、扫描并分析结果。结果 单重PCR和多重PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳均可见相应的阳性条带。扩增产物与基因芯片杂交后扫描,各病原体均可见荧光信号,与所对应的特异性探针位置相吻合。结论 本研究初步构建的基因芯片技术具有特异、灵敏、快速及能一次性同时检测多种病原体的特点。     

多重PCR结合反向线点杂交方法检测七种性病病原体

目的 建立多重PCR结合反向线点杂交技术同时检测淋球菌、 沙眼衣原体、生殖支原体、人型支原体、微小脲原体、解脲脲原体和毛滴虫的方法。方法 设计7对生物素标记的上述病原体特异性引物同时扩增病原体靶基因。扩增产物与预先标记在尼龙膜上的特异性探针杂交、显影，判读结果。多重PCR结合反向线点杂交方法检测211个尿道、宫颈分泌物临床标本（男107例，女104例），并与传统单一引物PCR检测结果比较，评价反向线点杂交的敏感性和特异性。结果 多重PCR结合反向线点杂交技术能敏感和特异地检测所有这7种病原体标准株，能敏感地检测病原体100拷贝的靶基因。在211个临床标本的检测中，2.8% （6 /211）的标本使用多重PCR结合反向线点杂交技术检测为阳性，而单一引物PCR检测为阴性，再使用巢式PCR检测这6个标本，结果为阳性。结论 多重PCR结合反向线点杂交技术能快速、敏感和特异地检测多种性病病原体。     

PCR反向线点杂交鉴定常见念珠菌的研究

目的 建立PCR反向线点杂交技术（PCR-RLB）快速检测和鉴定常见念珠菌的方法。方法 以念珠菌属间隔序列Ⅱ（ITS2）为靶基因设计通用引物，用生物素标记反义引物，PCR扩增白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌DNA，然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交，并进行临床标本和分离株的检测。结果 念珠菌标准菌株可扩增出302 ~ 441 bp DNA片段，6种特异性寡核苷酸探针可分别与相应念珠菌PCR产物杂交，其敏感性为10 cfu/mL。通过对100例分离株的检测，然后与培养法鉴定（Merieux Vitek）的结果比较，有97株与培养结果一致，另外3株通过DNA测序结果证实与PCR-RLB测定结果一致。通过对200例女性阴道拭子进行检测，PCR-RLB阳性率为49%，而涂片法和培养法阳性率分别为27%和39%，明显高于涂片法和培养法（P < 0.05）。结论 该方法可快速、敏感、准确鉴定临床上常见的念珠菌。     

DNA芯片技术在诊断恶性黑素瘤中的应用

人类基因组序列的研究成功,为基因组功能分析奠定基础.而DNA芯片技术允许同时检测上千个基因,成为基因组功能分析的方法之一.从正常的黑素细胞、非典型痣、原位黑素瘤到侵袭性黑素瘤的发展过程,使恶性黑素瘤成为使用DNA芯片技术研究肿瘤发病机制的模型.使用DNA芯片技术根据恶性黑素瘤基因表达谱的不同,对恶性黑素瘤进行新的分型,发现恶性黑素瘤形成过程中的基因表达异常、染色体变异及与恶性黑素瘤转移相关的基因等.     

Oligo芯片技术分析阴道念珠菌病患者阴道分泌物中致病相关因子的表达谱

目的 借助Oligo基因芯片的优势,整体地分析探讨阴道念珠菌病患者阴道分泌物中各致病相关因子的表达。方法 分别提取10例阴道念珠菌病患者及3例无症状带菌者阴道分泌物标本的RNA,将其与疾病相关因子Oligo表达谱芯片杂交,筛选出表达改变超过2倍（比值≥2或≤0.5）的因子,并绘制成差异基因表达谱进行分析。结果 与正常人对照组相比,在患者组中表达上调的基因有44个,其中,MIP-1α、NF-κB、TNF-α、IFN-γ、TLR4、HWP1、SAP2、SAP5、LIP4、EFG1、CPH1在80%以上的标本中表达上调（平均比值为4.013）;表达下调的基因有17个,其中,LIP6、WH11在80%以上的标本中表达下调（平均比值为0.326）。分析表达差异明显因子的生物信息功能,MIP-1α、NF-κB、TNF-α、IFN-γ、TLR4与机体天然免疫相关,HWP1与菌丝黏附及形成相关,SAP2、SAP5、LIP4、LIP6与菌株胞外水解酶相关,EFG1、CPH1、WH11与菌株表型转换有关。结论 宿主适应性免疫功能受限以及致病菌株毒力增强均参与阴道念珠菌病的发病机制,TLR4在该病局部宿主免疫机制中可能起一定作用。     

雄激素性秃发患者毛乳头细胞基因表达谱分析

【摘要】 目的 探讨3D培养下,雄激素性秃发患者毛乳头细胞基因表达谱的差异。 方法 分离雄激素性秃发患者毛乳头细胞进行3D培养,实验组经双氢睾酮处理,提取总RNA进行扩增,Cy3标记,用NimbleGen人类全基因组表达谱芯片杂交,筛选差异表达基因进行GO分析及pathway分析,实时 PCR对结果进行验证。结果 全基因组表达谱分析显示,有622 个基因有差异性表达,上调基因数359个,下调基因数为263个。其中GO分析显示,抑制细胞增殖、促进凋亡的基因出现上调,如CHEK1及Tob1等。促进细胞增殖、参与表皮生长发育的分子表达下调,如BAMBI、EFNA3、Dlx3及UCGC等。实时 PCR验证结果与芯片结果的差异趋势一致。Pathway分析显示,调节细胞周期信号转导通路的分子富集在首位。 结论 雄激素性秃发发病受多种信号分子及信号转导通路调节,可能集中在调节细胞周期、细胞增殖及凋亡等方面。     

CpG序列促进马疫锥虫kDNA诱生IgG型抗dsDNA抗体

目的 探讨CpG寡核苷酸序列参与马疫锥虫动基体DNA(kDNA)诱生IgG型抗双链DNA(dsDNA)抗体过程中的作用。方法 分别以CpG寡核苷酸序列、不完全弗氏佐剂(IFA)或两者混合物作为佐剂,将纯化的马疫锥虫kDNA通过皮下注射途径免疫正常的BALB/c小鼠。免疫结束后,检测其血清中抗dsDNA抗体等指标。结果 未添加免疫佐剂的马疫锥虫kDNA仅能诱生IgM型抗dsDNA抗体,而添加CpG序列或IFA后皆能诱生IgG型抗dsDNA抗体,但CpG序列诱生的IgG型抗体水平更高(P<0.05)。结论 CpG序列能更有效地促进马疫锥虫kDNA诱生IgG型抗dsDNA抗体。     

原代培养人毛乳头细胞cDNA酵母表达文库的构建和鉴定

目的 构建原代培养人毛乳头细胞cDNA酵母表达文库。方法 采用二步酶消化法分离正常人毛乳头细胞并置于DMEM培养基中培养;待细胞出现凝集性生长特性后,收集细胞并提取总RNA,采用CloneMinerTM cDNA Library Construction Kit试剂盒构建初级cDNA文库及cDNA酵母表达文库。结果 初级文库的平均滴度为7.0 × 106 cfu/ml,文库总容量为1.4 × 107 cfu（colony-forming unit）。cDNA酵母表达文库的平均滴度为5.5 × 106 cfu/ml,文库总容量为1.1 × 107 cfu;菌落PCR验证鉴定平均插入片段大于1.2 kb,重组率大于95%。结论 成功构建原代人毛乳头细胞cDNA酵母表达文库,为应用酵母双杂交筛选毛乳头细胞中与HSPC016相互作用的蛋白奠定基础。     

鲍恩样丘疹病皮损中细胞周期调控蛋白表达与人乳头瘤病毒感染的研究

目的 探讨鲍恩样丘疹病（BP）皮损中人乳头瘤病毒（HPV）感染与细胞周期相关因子细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白E（Cyclin E）及其依赖性蛋白激酶抑制蛋白p27表达的相关性。方法 基因芯片法检测BP皮损组织中人乳头瘤病毒感染（HPV）类型,免疫组化方法检测44例BP皮损组织及10例正常包皮环切组织中细胞周期调控蛋白Cyclin D1、Cyclin E及p27的表达水平。结果 44例BP中HPV感染率为100%,高危型感染38例,占86.36%,其中含HPV16感染者30例,占68.18%,单一HPV16感染者16例,合并其他高低危混合感染者14例,其他高危型感染为8例,低危感染6例,主要为HPV6型感染。在BP组织中,HPV高危组（u = 53.00,P < 0.05）、高低危混合组（u = 12.00,P < 0.01）,低危组（u = 5.00,P < 0.01）中Cyclin D1表达较正常组显著增高,高低危混合组（u = 44.00,P < 0.01）、低危组（u = 22.50,P < 0.05）Cyclin D1表达较高危组显著增高;Cyclin E在HPV高危组（u = 0.00,P < 0.01）,高低危混合组（u = 4.00,P < 0.01）,低危组（u = 1.50,P < 0.01）的表达显著高于正常组织,高危组显著高于低危组（u = 11.00,P < 0.01）;p27的表达在HPV高低危感染中差异无统计学意义。p27在年龄 > 50岁组较20 ~ 30岁组（u = 47.00,P < 0.05）、31 ~ 50岁组（u = 55.50,P < 0.05）显著增高。Cyclin E的表达在年龄 > 50岁组较20 ~ 30岁组（u = 45.50,P < 0.05）显著增高。还发现,女性患者Cyclin E的表达明显高于男性患者（u = 137.50,P < 0.05）。结论 不同HPV感染类型中,细胞周期调控蛋白Cyclin D1、Cyclin E及p27的表达存在差异。     

基因芯片表达谱筛选Kaposi肉瘤相关基因

目的 筛选Kaposi肉瘤相关基因。 方法 新疆本地1例经典型Kaposi肉瘤患者,提取病灶组织及正常皮肤组织的总RNA,逆转录成 cDNA,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法检测Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi sarcoma-associated herpersivirus,KSHV）基因K8.1、K2、ORF50在组织中的表达来确定所取标本有无交叉污染。随后进行荧光标记制备探针,与含有25100条人类基因的35K cDNA基因表达谱芯片进行杂交,用扫描仪扫描芯片荧光信号图像,并用软件对扫描图像进行数字化处理和分析。结果 RT-qPCR检测到 KSHV基因在Kaposi肉瘤病灶组织中的存在,而正常皮肤组织中未检测到,说明样本取材无交叉污染。在25 100个基因中,共有1313条差异基因,其中756条基因表达上调,557条基因表达下调。差异表达显著的基因涉及细胞凋亡、血管发生、细胞信号传导、蛋白加工和细胞周期调节等,如髓样细胞白血病-1基因（MCI-1）、膜联蛋白基因、丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPINK5）基因等。结论 MCI-1、SPINK5等基因可能与Kaposi肉瘤的发病有关联。