BRAFV600E突变基因对人黑素瘤细胞侵袭能力影响的研究

目的 探讨BRAFV600E突变基因对黑素瘤细胞侵袭能力的影响。方法　用构建成功的质粒载体转染人黑素瘤细胞株A375,在体外干扰BRAFV600E突变基因,用Transwell小室检测肿瘤细胞侵袭能力,用明胶酶法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的变化,采用RT-PCR和Western印迹检测MMP-2和血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。结果　特异性短发卡RNA抑制人黑素瘤细胞MMP-2和VEGF mRNA和蛋白的表达,MMP-2 mRNA和蛋白表达分别减少35%和80%,VEGF则减少45%和14%。转染特异性质粒的黑素瘤细胞穿过Metrigel的数目下降69%。结论 BRAFV600E突变增强黑素瘤细胞的侵袭能力,特异性shRNA可以使瘤细胞的侵袭性下降。     

短发卡RNA对人黑素瘤细胞BRAF基因的沉默作用

目的构建BRAF基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对人黑素瘤细胞BRAF基因的干扰作用。方法设计2条BRAF基因序列特异性的shRNA编码序列和1条非特异性阴性对照序列,插入质粒pGenesil-1,双酶切和测序鉴定。用构建成功的3条质粒转染人黑素瘤细胞株A375和M14,分别采用RT-PCR和蛋白印迹检测其BRAF基因的mRNA和蛋白表达。结果所设计的shRNA序列被正确插入质粒pGenesil-1。非特异性对照质粒neg对黑素瘤细胞BRAF基因表达不产生干扰,2条序列特异性质粒braf1和braf2抑制了BRAF基因mRNA和蛋白的表达,其中braf1干扰效果最为明显,最高抑制率可达90%。结论质粒介导的shRNA可成功干扰人黑素瘤细胞BRAF基因的表达,其抑制时间可持续至少1个月。     

BRAFV599E突变基因对A375细胞生长的影响

目的 探讨BRAFV599E突变对黑素瘤生长的作用。方法 使用BRAF表达受到抑制的黑素瘤细胞Abraf1和Abraf2,以及BRAF表达未受抑制的A375细胞和Aneg细胞,MTT比色实验和平板克隆形成实验分别检测4种细胞的生长和克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化。结果 与A375和Aneg细胞相比,Abraf1和Abraf2细胞的体外生长（F = 25.48,P < 0.001）和克隆形成（F ＝ 90.06,P < 0.001）均受到明显抑制,S期细胞减少（F = 147.87,P < 0.001）,G1期细胞增多（F = 9.14,P < 0.05）,但细胞凋亡没有显著增加（F = 2.27,P > 0.05）。结论 BRAFV599E突变基因能促使黑素瘤细胞从G1期进入S期,从而增强黑素瘤细胞的体外生长和增殖能力,但对黑素瘤细胞的体外凋亡没有影响。     

短发卡RNA对黑素瘤B16F10细胞BAG-1基因表达的抑制作用

目的 构建针对小鼠BAG-1（Bcl-2-associated athanogene 1）基因的短发卡RNA（shRNA）真核表达质粒，探讨其对小鼠黑素瘤B16F10细胞BAG-1基因表达的抑制作用。方法 以小鼠BAG-1 mRNA编码区作为RNA干扰靶点，构建shRNA真核表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1，应用lipofectaminTM 2000转染小鼠黑素瘤B16F10细胞，设阴性对照组（转染阴性对照质粒Neg）和空白对照组（未转染），转染后48 h开始G418筛选。转染1个月后采用RT-PCR、蛋白质印迹检测BAG-1基因的表达。结果 酶切及测序结果证实，重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1构建成功。质粒在B16F10细胞的转染效率为20% ~ 30%。阴性对照组细胞BAG-1基因表达与空白对照组无差异，shRNA质粒处理组细胞BAG-1基因表达较空白对照组显著下降（P < 0.05），表达抑制率在mRNA和蛋白水平分别为77% ± 4%和62% ± 2%。结论 针对小鼠BAG-1基因的shRNA真核表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1能高效特异地抑制小鼠黑素瘤B16F10细胞BAG-1基因的表达。     

RNA干扰下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭和失巢凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭的影响和可能机制。 方法 用PLK1小干扰核糖核酸分子（siRNA）转染人恶性黑素瘤A375细胞后,分别用实时定量PCR和 Western 印迹法检测PLK1mRNA和蛋白表达,Transwell方法检测细胞侵袭能力,以平板集落形成方法了解癌细胞集落形成情况,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测癌细胞失巢凋亡情况。 结果 恶性黑素瘤A375细胞经PLK1 siRNA转染后,PLK1 mRNA和蛋白表达明显下调;siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制。与空白对照组和脂质体对照组比较,siRNA细胞转染组侵袭性明显下降。失巢凋亡检测发现,琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯度图谱。TUNEL结果显示,PLK1 siRNA可诱导恶性黑素瘤A375细胞凋亡,siRNA细胞转染组较空白对照组和脂质体对照组凋亡指数明显升高［3.86% ± 0.35%（3.125 nmol/L siRNA组）,7.35% ± 0.36%（6.250 nmol/L siRNA组）,17.56% ± 0.38%（12.500 nmol/L siRNA组）比1.15% ± 0.25%和1.18% ± 0.22%）,均P < 0.01］。 结论 PLK1 siRNA可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关。     

恶性黑素瘤中BRAF癌基因突变研究新进展

恶性黑素瘤是死亡率较高的皮肤肿瘤之一,研究发现恶性黑素瘤中存在高频BRAF癌基因突变.紫外线是引起突变的高危因素,不同种族、发病部位以及病理类型的恶性黑素瘤间BRAF突变率存在差异.此突变与遗传、预先存在的色素痣、肿瘤侵袭性及预后之间的关系还存在争论.BRAF突变相关的MAPK信号传导分子是治疗恶性黑素瘤的靶点.综述近几年的研究,以认识BRAF突变与恶性黑素瘤的关系.     

iRNA抑制人黑素瘤M14细胞生存素的表达

目的 通过构建生存素(survivin)的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人黑素瘤M14细胞生存素表达的抑制作用,为后续研究奠定基础.方法 设计有小发夹结构的生存素siRNA对应模板DNA序列,克隆至pRNAT-H1.1/neo质粒,构建重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin,转染人黑素瘤M14细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹检测生存素表达.结果 酶切及测序结果 证实重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin构建成功.将重组质粒及空载体(阴性对照)转染M14细胞48 h后,siRNA处理组M14细胞生存素表达较空白对照组显著下降,表达抑制率在mRNA和蛋白水平分别为62.3%±1.5%和53.6%±0.9%.结论 生存素siRNA表达质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin可抑制人黑素瘤M14细胞生存素的表达.     

RNA干扰技术抑制人恶性黑素瘤细胞A375中淋巴样增强因子mRNA及蛋白表达

目的 利用RNA干扰技术,以淋巴样增强因子(LEF-1)为靶基因,设计、构建重组体,研究其对人恶性黑素瘤细胞A375中LFF-1表达的抑制作用。方法 设计、合成针对LEF-1 mRNA序列的有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后与表达载体Psilencer3.1-H1 neo相连接,经鉴定正确后转染人恶性黑素瘤细胞A375,以G418筛选,获得稳定转染细胞株,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)和免疫细胞化学方法检测转染细胞中LEF-1 mRNA及蛋白表达水平的改变。结果 成功构建了靶向人LEF-1基因的siRNA表达载体,获得稳定转染细胞株,转染细胞LEF-1 mRNA及蛋白水平明显下调。结论 靶向LEF-1的RNA干扰重组体可抑制人恶性黑素瘤细胞A375中LEF-1表达。     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

黑素瘤BRAF V600E突变的临床检测方法进展

针对黑素瘤BRAF V600E突变的靶向治疗为黑素瘤的治疗提供了新方法。BRAF基因突变的准确检测是实施靶向治疗的前提。以Sanger测序法为"金标准"的基因测序是目前临床检测黑素瘤BRAF V600E突变的主要方法。近年来,针对BRAF V600E突变的单克隆抗体VE1在组织学上显示V600E突变蛋白,还可显示异质性肿瘤细胞,其高敏感性和特异性是对BRAF突变基因检测的重要补充。该文对BRAF V600E突变检测方法做一综述,为临床应用提供信息。     

短发夹RNA干扰STAT3基因对恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 研究短发夹RNA（shRNA）沉默STAT3基因表达对人恶性黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的作用。 方法 设计和构建靶向STAT3基因有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后克隆入psiRNA-hH1neo质粒,使用脂质体转染A375。实验分为对照组、空载体组和STAT3转染组。通过RT-PCR和Western印迹检测A375细胞中STAT3 基因mRNA和蛋白表达水平,MTT比色法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期分布,观察细胞凋亡。结果 STAT3转染组A375细胞STAT3 mRNA和蛋白表达水平（分别为0.2136 ± 0.0626、0.8214 ± 0.0430）明显低于对照组（0.7826 ± 0.0701、3.1693 ± 0.0846）和空载体组（0.8518 ± 0.0783、3.2180 ± 0.0780）,P值均 < 0.01。STAT3转染24、48、72 h组的细胞增殖抑制率明显增高（分别为21.35% ± 2.12%、32.52% ± 2.64%、40.40% ± 3.08%）,与正常对照组（1.39% ± 0.53%、3.05% ± 1.16%、4.41% ± 1.42%）、空载体组（2.63% ± 1.38%、5.84% ± 2.47%、10.32% ± 2.48%）比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）。流式细胞仪检测显示,STAT3转染组细胞的凋亡率（81.06% ± 2.10%）较对照组（26.28% ± 0.47%）和空载体组（27.31% ± 1.05%）明显增高,差异有统计学意义（P < 0.01）。细胞周期分析显示,STAT3转染组G0 / G1期细胞比例（68.43% ± 4.00%）增高,S期细胞比例（17.40% ± 2.05%）降低,与对照组（分别为60.07% ± 2.47%、28.40% ± 2.09%）及空载体组（分别为60.29% ± 2.26%、27.34% ± 3.63%）相比,差异有统计学意义（P < 0.01或 < 0.05）。结论 针对STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒能够下调STAT3 基因和蛋白表达,抑制A375的增殖能力,诱导细胞凋亡。     

人角质形成细胞与MV3人黑素瘤细胞体外构建人工皮肤黑素瘤组织模型

目的 用人角质形成细胞（KC）和MV3人黑素瘤细胞混合接种培养于去表皮的真皮（DED）,体外构建人工皮肤黑素瘤组织模型,探讨KC对黑素瘤侵袭性的影响。方法 用两步酶消化法处理小儿包皮,获得表皮细胞悬液,用KC无血清培养基培养并传代KC。用RPMI 1640培养基培养及传代MV3人黑素瘤细胞。分别取对数生长期KC、MV3人黑素瘤细胞制备细胞悬液。将KC、 MV3人黑素瘤细胞悬液接种于DED表面（KC ∶ MV3人黑素瘤细胞约为3 ∶ 1）。采用液下培养和空气-液面培养相结合方式进行混合培养,2周后取出进行HE染色、S-100蛋白、HMB45及角蛋白免疫组化染色。结果 HE染色显示,MV3人黑素瘤细胞在DED表面形成条带状瘤团或瘤灶,KC间杂于瘤细胞间,未形成典型的表皮样结构;部分瘤细胞浸润到DED浅层,呈群聚性分布;瘤细胞侵入DED管腔内,呈环形附着于管壁上,部分瘤细胞穿过管壁进入周围真皮组织;在DED底面及侧面,瘤细胞呈单个细胞弥散状浸润分布。瘤灶S-100蛋白阳性表达,HMB45弱阳性表达,角蛋白阳性表达。结论 KC增强MV3人黑素瘤细胞在人工皮肤黑素瘤组织模型中的侵袭。     

HINT1对人黑素瘤A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤生长及凋亡的影响

目的 探讨组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HINT1）对人黑素瘤A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤生长及凋亡的影响。方法 三组裸鼠随机皮下接种HINT1-A375、neo-A375及未转染的A375细胞,观察各组移植瘤的生长情况,计算成瘤率。组织病理切片观察移植瘤组织形态学改变,并应用TUNEL法检测移植瘤组织中细胞凋亡情况。结果 三组裸鼠皮下异种移植瘤成瘤率均为100%。HINT1组移植瘤生长速度慢,接种后18 d移植瘤生长速度显著低于neo组及A375细胞组（P < 0.01）。HINT1组、neo组及A375细胞组肿瘤重量分别为（0.04 ± 0.00） g、（0.23 ± 0.00） g、（0.29 ± 0.03） g;肿瘤体积分别为（0.06 ± 0.04） cm3、（0.34 ± 0.15） cm3、（0.43 ± 0.19） cm3。HINT1组肿瘤重量及体积均显著低于neo组及A375细胞组（P值均 < 0.01）。组织病理结果显示,与neo组及A375细胞组相比,HINT1组肿瘤团块较小,细胞异形小,病理性核分裂象少见,瘤团内未见大片坏死灶。HINT1组中平均凋亡细胞百分比为12.87% ± 1.18%,显著高于neo组（3.22% ± 0.49%）及A375细胞组（3.00% ± 0.53%）（P值均 < 0.01）。结论 高表达HINT1可显著抑制A375细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型肿瘤的生长,促进其凋亡,提示HINT1基因可能是人黑素瘤的抑癌基因之一。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A诱导黑素瘤B16细胞凋亡的体外研究

目的 探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导黑素瘤B16细胞凋亡.方法 用不同浓度的SEA(0.001、0.01、0.1、1 μg/mL)作用于体外培养的B16细胞,采用荧光法观察SEA诱导B16细胞凋亡的形态学改变,用末端标记法(TUNEL)计算细胞凋亡率,用流式细胞仪分析B16细胞的凋亡周期.结果 三种方法均显示SEA对小鼠B16细胞有明显的诱导凋亡作用,SEA在0.01 μg/mL浓度时B16细胞的凋亡率最高.结论 超搞原SEA对体外培养的小鼠B16细胞有诱导凋亡的作用.     

慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.