单纯疱疹病毒2型临床分离株体外对阿昔洛韦和伐昔洛韦的敏感性测定

目的 测定南京地区收集的15株单纯疱疹病毒2型(HSV-2)对阿昔洛韦和伐昔洛韦的敏感性,初步建立空斑法提取阿昔洛韦耐药株.方法 Vero细胞培养法分离扩增出临床毒株,直接免疫荧光法分型,并用MTT法测定15株2型毒株对阿昔洛韦、伐昔洛韦的敏感性.体外阿昔洛韦诱导,空斑纯化HSV耐药株.结果 15株临床株对阿昔洛韦和伐昔洛韦的半数病毒抑制质量浓度(IC₅₀)分别为0.0215～0.2799μg/mL(平均0.0766μg/mL),0.0549～0.4575μg/mL(平均0.1605μg/mL).生殖器疱疹初发组与复发组、用药组与未用药组对2种药物的敏感性采用Wilcoxon秩和检验,P值均>0.05,差异无统计学意义.从15株HSV-2临床株中未提取到耐药空斑;从HSV-1 Sam实验室标准株提取到一个耐药空斑,MTT法测定阿昔洛韦IC₅₀为13.36μg/mL;从HSV-2 333标准株中提取到9个耐药空斑,扩增后MTT法测定其对阿昔洛韦的IC₅₀为1.04～5.08 μg/mL.结论 目前在南京地区收集的HSV-2型毒株对阿昔洛韦和伐昔洛韦敏感性较高,尚未发现耐药株.体外药物诱导、空斑纯化能较快提取到HSV耐药株.     

维胺酯对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨维胺酯对体外培养角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖和分化的影响.方法 将浓度为2,5,10,15,20,25,30 μg/mL的维胺酯作用于培养的HaCaT细胞,采用MTT法检测维胺酯对HaCaT细胞体外增殖的影响,流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测分化标记物角蛋白10及内披蛋白mRNA的表达水平.结果 2 μg/mL维胺酯处理的HaCaT细胞,48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物剂量加大,抗增殖作用愈明显;当药物质量浓度达到30 μg/mL时,48 h和72 h时的抑制率分别为57.67%和82.00%.与对照组相比,经维胺酯作用48 h后,细胞G₁期比例显著增加,S期与G₂期比例则显著下降,并可抑制G₁/G₂期转换,但对细胞凋亡无影响.细胞内披蛋白mRNA表达水平随维胺酯处理浓度增高而上升,药物浓度达30μg/mL时,表达水平由对照组的40.80%增高至156.12%;而角蛋白10 mRNA表达水平则下降,由96.46%降至14.60%.结论 维胺酯具有抑制角质形成细胞增殖及诱导其分化的作用.     

卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子生成的影响

目的 探讨卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子(VEGF)生成的影响.方法 采用RT-PCR法检测原代培养的人角质形成细胞及COLO16细胞中VEGFmRNA的水平.结果 卡泊三醇作用于正常人角质形成细胞4h和24h后,以及作用COLO16细胞24h后,均可抑制VEGFmRNA的表达,呈剂量依赖性,IC₅₀值分别为1.19×10^-4μg/mL、1.51×10^-4μg/mL和3.16×10^-5μg/mL.维A酸作用于正常人角质形成细胞4h后可抑制VEGFmRNA的表达,作用于正常角质形成细胞24h后及作用于COLO16细胞4h和24h均无抑制作用.雷公藤内酯醇对正常角质形成细胞和COLO16细胞中VEGFmRNA表达均无抑制作用.结论 在转录水平抑制VEGF生成可能是维A酸与卡泊三醇抗银屑病的作用机制之一.     

新生隐球菌对立福康唑和氟康唑的体外敏感性实验

目的 了解临床和环境中分离所得的新生隐球菌对立福康唑和氟康唑的体外敏感性。方法 采用美国国家实验室标准委员会(NCCLS)M27-A方案推荐的酵母菌微量稀释法,检测77株来自临床和环境中分离所得新生隐球菌对立福康唑和氟康唑的MIC值。结果 氟康唑、立福康唑的MIC范围分别为2.0～128μg/mL、0.008～0.5μg/mL,前者MIC₅₀、MIC₉₀几何均数值分别为4μg/mL、8μg/mL,后者几何均数值分别为0.125μg/mL、0.25μg/mL。其中,对氟康唑敏感菌株占81.8%(63/77),中度敏感或剂量依赖性敏感菌株占16.9%(13/77),耐药菌株占1.3%(1/77)。中度敏感和耐药的14株菌中,临床分离株占85.7%,尽管在临床菌株与环境分离株间差异无显著性(P>0.05),但仍应引起临床医师重视。结论 虽然部分新生隐球菌对氟康唑出现中度敏感或耐药,但立福康唑对其均具有较好的体外抗菌活性,有望成为治疗隐球菌病药物的又一选择。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A诱导黑素瘤B16细胞凋亡的体外研究

目的 探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导黑素瘤B16细胞凋亡.方法 用不同浓度的SEA(0.001、0.01、0.1、1 μg/mL)作用于体外培养的B16细胞,采用荧光法观察SEA诱导B16细胞凋亡的形态学改变,用末端标记法(TUNEL)计算细胞凋亡率,用流式细胞仪分析B16细胞的凋亡周期.结果 三种方法均显示SEA对小鼠B16细胞有明显的诱导凋亡作用,SEA在0.01 μg/mL浓度时B16细胞的凋亡率最高.结论 超搞原SEA对体外培养的小鼠B16细胞有诱导凋亡的作用.     

汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性的增效作用

目的 探讨体外汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性是否有增效作用.方法 参照微量稀释法确定汉防己甲素对白念珠菌的非细胞毒性剂量,并测定氟康唑单独及联合汉防己甲素时对16株白念珠菌的MIC.结果 在终质量浓度≤40μg/ml汉防己甲素的作用下,白念珠菌的存活率>95%.其中汉防己甲素(30～40μg/mL)可抑制白念珠菌菌丝相形成.氟康唑单独作用时,对16株白念珠菌的MIC值为0.250～64μg/mL;与汉防己甲素(40μg/mL)联合时,氟康唑对受试菌的MIC值降至0.125～16μg/mL,且终点清晰,“拖尾现象”消火.结论 汉防己甲素在体外对氟康唑的抗白念珠菌活性有增效作用.     

寻常型银屑病与单纯疱疹病毒1型相关性的研究

目的 探讨寻常型银屑病与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的可能相关性。方法 应用PCR法检测患者皮损、外周血单一核细胞(PBMCs)和咽拭子中HSV-1DNA,ELISA法检测患者血清中抗HSV-1的IgM、IgG抗体,并与正常人对照做比较。结果 患者皮损、PBMCs和咽拭子中HSV-1DNA检出率分别为37.5%、18.6%和18.8%,血清中抗HSV-1的IgM、IgG抗体检出率分别为37.2%和53.5%.经χ²检验,患者皮损、PBMCs中HSV-1DNA和血清中IgM抗体检出率显着高于正常人对照,点滴状患者的皮损、PBMCs和咽拭子中HSV-1DNA以及血清中抗HSV-1IgM抗体检出率显着高于斑块状患者。结论 寻常型银屑病尤其是皮损呈点滴状者与HSV-1显着相关,患者可能存在HSV-1的近期感染。     

小檗碱衍生物HB-13抗单纯疱疹病毒1型豚鼠皮肤感染的疗效

目的:评价小檗碱衍生物HB-13凝胶治疗单纯疱疹病毒1 型(herpes simplex virus, HSV-1)豚鼠皮肤感染的疗效.方法:用HSV-1在豚鼠皮肤造模,感染后1小时开始局部给药,每日2次,连续7天.同时以阿昔洛韦凝胶和喷昔洛韦乳膏阳性对照,及凝胶基质和空白对照.结果:与空白对照相比,0.5% HB-13凝胶可减轻皮损评分,促进结痂,但不能缩短病程.结论:0.5% HB-13凝胶对HSV-1感染有明显减轻临床症状的作用.     

盐酸小檗碱对HaCaT细胞内游离钙离子及线粒体膜电位的影响

目的 探讨盐酸小檗碱对角质形成细胞的作用机制。方法 用激光扫描共聚焦显微镜及其技术观察盐酸小檗碱作用前后,单个活细胞内Fluo-3/AM及罗丹明-123(Rhodamine-123)荧光强度的变化,推测盐酸小檗碱对HaCaT细胞内游离钙离子和线粒体膜电位的作用及能量代谢的影响。结果 对Fluo-3/AM及罗丹明-123标记的HaCaT细胞观察发现:静息状态下,Fluo-3/AM的荧光强度较弱,细胞内呈局限性分布;罗丹明-123的荧光强度在细胞周边最高,核区的荧光强度最低。PBS加入后,细胞内Fluo-3/AM及罗丹明-123荧光强度没有明显变化。盐酸小檗碱呈浓度依赖性持续增强HaCaT细胞内Fluo-3/AM荧光强度,但迅速降低罗丹明-123荧光强度。结论 盐酸小檗碱可能通过增加HaCaT细胞内游离钙离子的浓度,降低HaCaT细胞线粒体膜电位,达到其抑制角质形成细胞增殖的作用。     

HB-13和HP-13对HaCaT细胞NF-KB活化和p38MAPK磷酸化的影响

目的 探讨盐酸13-己基小檗碱(HB-13)和盐酸13-己基巴马汀(HP-13)对肿瘤坏死因子α(TNF-ot)信号刺激HacaT细胞后核因子-KB(NF-KB)活化和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化的影响.方法 在HaCaT细胞培养体系中,用30 ng/mL外源性重组人TNF-α(rhTNF-α)分别刺激120 min和15 min,用免疫印迹法检测磷酸化-I KB-α(p-I KB-α)和磷酸化-p38MAPK(p-p38)的表达,并观察HB-13和HP-13对p-I KB-α和p-p38表达的影响.结果 HB-13和HP-13在0.39～1.56 μg/mL实验浓度范围内抑制rhTNF-α信号刺激下p-I KB-α表达(n=3,P<0.05),抑制作用具有剂量依赖趋势,IC50值分别约为0.441μg/mL(r=-0.990,m=3,P>0.05)和0.832 μg/mL(r=-0.992,n=3,P>0.05).HB-13和HP-13在0.39-1.56 μg/mL实验浓度范围内对rhTNF-α信号刺激下p-p38的表达均无明显抑制作用n=3,P>0.05).结论 HB-13和HP-13在实验浓度范围内对TNF-α信号引起的NF-KB活化均有抑制作用,对TNF-α信号引起的p38MAPK磷酸化均无抑制作用.     

喷昔洛韦对单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的抑制作用

目的　评估喷昔洛韦钠盐在体内外对HSV Ⅰ和HSV Ⅱ感染的抑制作用。方法　在组织培养中用CPE抑制实验测定喷昔洛韦钠盐对HSV Ⅰ和HSV Ⅱ所致vero细胞病变的抑制作用 ;在BALB/c小鼠中测定其对HSV Ⅰ感染BALB/c小鼠所致耳部皮损的治疗作用。结果　喷昔洛韦钠盐能有效抑制 10 0TCID50 HSV Ⅰ (sm44株 )和HSV Ⅱ (3 3 3株 )感染vero细胞所产生的细胞病变作用 ,半数有效剂量 (IC50 )分别为 1.95 μg/ml和 3 .90 μg/ml ;使HSV Ⅰ病毒感染性滴度下降 99%的药物浓度 (IC99)为 2 .40 μg/ml。在HSV Ⅰ (sm44)感染BALB/c小鼠中 ,喷昔洛韦钠盐大剂量组 (2 5 0mg/kg·d)、中剂量组 (10 0mg/kg·d)、小剂量组 (5 0mg/kg·d)均能明显降低HSV Ⅰ感染BALB/c小鼠所致耳部皮损作用。 结论　喷昔洛韦钠盐在体内外具有抗HSV Ⅰ和HSV Ⅱ感染的作用。     

香莲外洗液对硝酸咪康唑抗白念珠菌增效作用的体外实验研究

目的:探讨体外香莲外洗液对硝酸咪康唑抗白念珠菌的增效作用.方法:从单纯性外阴阴道念珠菌病患者的阴道分泌物中培养分离白念珠菌菌株,参照微量稀释法,以氟康唑药敏操作方法为标准,测定联合应用硝酸咪康唑溶液和香莲外洗液对12株白念珠菌的药物最小作用浓度,并与二者单独应用进行比较;用联合抑菌指数来判断两者的联合效应.结果:单用硝酸咪康唑溶液的MIC均值为(7.92±6.13) μg/mL;单用香莲外洗液的MIC均值为(5.78±4.66) mg/mL;二者联用时,平均MIC值分别为:硝酸咪康唑(1.32±1.41) μg/mL,香莲外洗液(1.59±1.62) mg/mL; 两者的FICI为0.46.结论:香莲外洗液对硝酸咪康唑溶液抗白念珠菌有增效作用.     

耐伊曲康唑烟曲霉临床分离株对四种抗真菌药物的敏感性测定

目的 测定耐伊曲康唑烟曲霉临床株对4种抗真菌药物的敏感性。方法 自一例对伊曲康唑无效的肺曲霉球患者体内系列分离6株烟曲霉。利用美国临床实验室标准化研究所（CLSI）的微量液基稀释法M38-A方案和E-test法测定6株烟曲霉临床分离株对两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净、伏立康唑和伊曲康唑的敏感性。结果 6株烟曲霉中，2株对伊曲康唑的最低抑菌浓度（MIC）为 0.5 μg/mL，其他4株的MIC均 ＞ 16 μg/mL；两性霉素B和伏立康唑对6株烟曲霉的MIC分别为1 μg/mL和0.25 ~ 1 μg/mL，卡泊芬净和米卡芬净对6株烟曲霉的最低有效浓度均 ≤0.03 μg/mL。E-test法测定结果也显示，卡泊芬净和伏立康唑对6株烟曲霉有良好的抑制活性。结论 耐伊曲康唑烟曲霉临床株对两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净和伏立康唑敏感。     

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体开放读码框3对Vero细胞凋亡的影响

目的 研究单纯疱疹病毒2型 （HSV-2）潜伏相关转录体（LAT）开放读码框3（ORF3）对顺铂诱导的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）凋亡的影响。方法 构建重组质粒pEGPF-ORF3,并转染Vero细胞,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证目的基因的表达。顺铂诱导Vero细胞凋亡,通过荧光显微镜观察凋亡小体,Giemsa染色检测细胞核形态,噻唑蓝法（MTT法）检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡情况。实验结果采用SPSS13.0进行分析,各组间两两比较采用单因素方差分析和t检验。 结果 成功克隆HSV-2 333株ORF3基因,构建pEGFP-ORF3真核表达载体,RT-PCR验证该真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染pEGFP-ORF3的Vero细胞经顺铂诱导凋亡后Giemsa染色,显示胞核蓝染,胞质淡浅,细胞形态正常。MTT 法分析显示,细胞增殖在转染pEGFP-ORF3组（2.56 ± 0.21）与未经任何处理的正常对照组（2.66 ± 0.13）比较,差异无统计学意义（P ＞ 0.05）,但高于顺铂诱导凋亡的正常对照组（1.65 ± 0.11）和pEGFP-C2组（1.56 ± 0.18）,差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）;流式细胞仪分析细胞凋亡率,转染pEGFP-ORF3组（4.03% ± 1.04%）与正常对照组（2.13% ± 0.09%）比较,差异无统计学意义（P ＞ 0.05）,但低于空质粒pEGFP-C2组（19.45% ± 2.05%）,且差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 HSV-2 LAT ORF3在Vero 细胞中具有抗顺铂诱导的凋亡作用。     

小干扰RNA抑制2型单纯疱疹病毒作用的研究

目的 研究小干扰RNA（siRNA）在体外抑制2型单纯疱疹病毒（HSV-2）的作用。方法 根据HSV-2 VP16和DNA聚合酶基因序列设计、合成siRNA。采用病毒产量减少实验测定siRNA对病毒复制的抑制,在预防性作用研究中,24孔板Vero细胞转染siRNA,4 h后换液并接种HSV-2病毒（0.02 ～ 0.05 PFU/细胞）;在治疗性作用研究中,24孔板Vero细胞接种HSV-2,1 h后转染siRNA。荧光定量RT-PCR测定siRNA对病毒靶基因mRNA水平的影响。结果 分别针对HSV-2 VP16基因及DNA聚合酶基因设计的siRNA--VP2-1和DP2-1,在预防性及治疗性作用研究中均能有效抑制病毒复制,使病毒滴度降低约1个log10 。siRNA VP2-1使病毒VP16 mRNA的水平在感染后6 h和12 h分别降低58.6％和79.5％,而siRNA DP2-1使病毒DNA多聚酶的mRNA水平分别降低59.8％和77.4％。结论 HSV-2 VP16和DNA聚合酶基因的siRNA体外能有效抑制HSV-2复制,VP16和DNA多聚酶基因可以作为RNA干扰抑制HSV病毒复制的靶基因。     

壳聚糖碘液体外抗人单纯疱疹病毒2型的作用

目的研究壳聚糖碘液体外对人单纯疱疹病毒2型的作用效果。方法采用非洲绿猴肾细胞(Vero)培养单纯疱疹病毒2型(HSV-2),观察病毒半数感染量(TCID50)和病毒感染后的细胞病变效应(CPE),并通过MTT法测定药物对HSV-2感染细胞的保护率EC50。结果壳聚糖碘液对HSV-2的50%抑制浓度(EC50)为0.025mg/mL,治疗指数(TI50)为24;壳聚糖碘液对HSV-2的90%抑制时间在感染后的2h之前;且壳聚糖碘液和HSV-2预作用的时间越长,HSV-2的滴度越小。结论壳聚糖碘液在体外对人单纯疱疹病毒2型活性具有抑制作用。     

豚鼠生殖器疱疹模型及细胞培养法观察中药抗病毒胶囊的抗病毒作用

目的 探讨病毒胶囊治疗生殖器疱疹的作用机理。方法 用雌性豚鼠生殖道单纯疱疹病毒（HSV）2型感染的模型,采取抗病毒胶囊内服,观察豚鼠阴道内病毒滴度、外阴症状;用体外细胞培养法观察抗病毒胶囊对HSV－2的直接灭活和三种给药途径下对HSV－2的抑制作用。结果 抗病毒胶囊组豚鼠阴道内病毒滴度与阿昔洛韦组比较差异无显著性（P＞0．05）;外阴症状评分在第2、3、5、7、8天显著低于生理盐水对照组（P＜0．05）,与阿昔洛韦组大致相同（P＞0．05）;细胞培养结果：抗病毒胶囊1号、2号对HSV－2的最低有效抑制浓度分别0．390625mg/ml和1．5625mg/mL。结论 中药抗病毒胶囊在动物体内和体外对HSV－2均有抑制作用。     

小檗碱抑制人黑素瘤A375细胞增殖的机制研究

目的 探讨小檗碱对人黑素瘤A375细胞周期相关miRNA及其靶基因表达的影响。方法 体外培养人黑素瘤A375细胞,经不同浓小檗碱（20、40、60、80 μmol/L）处理48 h后,采用qRT-PCR检测miRNA-582-5p及其靶基因CDK1 mRNA的表达,以及miRNA-188-5p和其靶基因CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA的表达。Western印迹检测细胞周期相关蛋白CDK1、CDK2、Cyclin D1和Cyclin A的表达。结果 qRT-PCR显示,与空白对照组相比,20、40 μmol/L小檗碱组miRNA-582-5p的表达无明显变化（均P > 0.05）,60、80 μmol/L组miRNA-582-5p的表达明显上调（均P < 0.05）。与空白对照组相比,各浓度小檗碱组miRNA-188-5p表达均增强（F = 22.600,P = 0.002）,CDK2、CDK1、Cyclin A、Cyclin D1mRNA表达随小檗碱浓度增加逐渐减弱（F = 51.976、248.510、626.671、312.740,均P < 0.001）。Western印迹显示,小檗碱可降低CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白的表达（F = 138.124、110.966、278.772、140.167,均P < 0.001）。结论 小檗碱可能通过降低mRNA表达量与升高miRNA-582-5p和miRNA-188-5p含量共同使黑素瘤A375细胞周期相关蛋白CDK1、CDK2、Cyclin D1和Cyclin A表达降低,进而阻滞细胞周期进程,抑制肿瘤生长。