微卫星基因分型法分析生殖器白念珠菌感染的传播特点

目的 建立适用于株间鉴别的白念珠菌快速微卫星基因分型方法,探索生殖器白念珠菌感染特点.方法 采集39例女性和27例男性生殖器念珠菌病患者生殖器、肛管和口腔的白念珠菌分离株.以三色荧光标记引物,PCR扩增白念珠菌保守基因CDC3、EF3和HIS3微卫星序列,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,行微卫星多态性基因分型.结果 三基因联合分析显示,男女生殖器白念珠菌感染者共获18种基因型,主要致病菌株基因型为116:124、122:131、160:200,占感染者的50%以上.3种共有基因型占71%.女性患者中肛管部位菌株基因型与生殖器部位完全一致的占80%,男性则仅占3.8%.女性患者口腔部位的菌株基因型与生殖器部位完全一致的仅占2.7%,男性未见口腔和生殖器一致的菌株基因型.71%的夫妻共患者间生殖器白念珠菌基因型完全相同,其中80%的致病菌株基因型为两性皆感染的主要致病性白念珠菌.结论 改良的白念珠菌微卫星多态性基因分型法能够特异、准确、稳定和快速地进行菌株间鉴别.生殖器白念珠菌感染存在优势基因型.     

多部位红色毛癣菌感染分离菌株DNA分型研究

目的 探讨多部位红色毛癣菌感染不同部位分离菌株基因型的差异。方法 采用巢式PCR扩增真菌rDNA非转录间隔区(NTS)中Trs-1片段,检测基因多态性。并比较同一患者不同感染部位分离菌株的基因型差异。结果 受试36株菌株按照PCR指纹图共分为10型,基因型分布与感染部位关系不大。在17例受试患者中,8例不同感染部位分离得到的菌株基因型有差异,且与不同感染部位的病程差异无关。结论 多部位红色毛癣菌感染可能为多菌株引起,提示部分多部位皮肤癣菌感染患者不同部位皮肤癣菌感梁的传染源可能来源于外界,而与机体原已存在的感梁灶关系可能不大。     

外阴阴道念珠菌病患者临床分离菌株的菌种及基因型分析

目的 探讨初发型、复发型外阴阴道念珠菌病患者及健康带菌者阴道分离的念珠菌菌种及菌株基因型与初发及复发的关系。方法 选择分别来自健康带菌者、外阴阴道念珠菌病患者和复发性外阴阴道念珠菌病患者。首先经菌种鉴定,然后用RAPD技术对来自3组人群的菌株进行基因分型。结果 临床分离株菌种鉴定结果为白念珠菌83株,非白念珠菌共14株。从9个随机引物中筛选出的2条引物(引物4和引物7)对初发组、复发组及健康带菌组分离株的扩增带型多数未表现出与菌株来源的联系,但少数菌株依来源不同表现出了一定区别。引物4和引物7可将来源于不同临床分型的97株菌及2株标准菌株分成19型和21型。结论 外阴阴道念珠菌病致病菌以白念珠菌为主,非白念珠菌中以光滑念珠菌为主。     

念珠菌性外阴阴道炎患者身体不同部位白念珠菌基因型研究

目的 研究念珠菌性外阴阴道炎患者身体不同部位的白念珠菌基因型分布情况。方法 采用PCR方法扩增白念珠菌包含Ⅰ类内含子的编码rRNA的25SrDNA区,根据扩增条带大小进行基因分型:A型(~450bp),B型(~840bp),C型(~450bp和~840bp)。结果 60例念珠菌性外阴阴道炎患者中,54例由白念珠菌感染所致,其中表现为非复发性感染者39例,复发性感染者15例;同时从2个或2个以上部位分离到白念珠菌的病例共32例(32/54),其中非复发性念珠菌性外阴阴道炎19例(19/39),复发性念珠菌性外阴阴道炎13例(13/15)。从54例白念珠菌性外阴阴道炎患者的阴道、肛门、口腔部位共分离到92株白念珠菌,其中A型80株,B型8株,C型4株。同一患者不同部位基因型相同者24例(24/32),不同者8例(8/32)。结论 在白念珠菌性外阴阴道炎中,主要以A型白念珠菌为主,B型、C型所占比例较少,且多分离自非阴道部位。在复发性念珠菌性外阴阴道炎患者中,身体其他部位念珠菌的定植率高于非复发性念珠菌性外阴阴道炎,肠道菌库理论在念珠菌性外阴阴道炎的反复发作中,具有一定的作用。     

阴道念珠菌随机扩增多态性DNA分型研究

目的 对分离自外阴阴道念珠菌病患者阴道的念珠菌进行基因分型,并对不同菌株间的亲缘关系作相似性分析。方法 用形态学及生化方法对分离到的致病性念珠菌进行鉴定,然后采用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对45株临床分离株基因组DNA进行扩增,并将DNA扩增带型进行聚类分析。结果 30株白念株菌可以分成7群共19个亚群,15株非白念珠菌(包括光滑念珠菌6株,克鲁斯念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌各3株)至少可鉴定到种水平。白念珠菌种内不同菌株间的相似性系数在90%以上,不同念珠菌种间的相似性系数介于80%~90%。结论 外阴阴道念珠菌病的主要致病菌是白念珠菌,用RAPD技术可将之分成不同的基因组型别。     

微孔板双探针杂交法快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌

目的 建立微孔板双探针杂交法,快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,并应用于临床分离株的快速鉴定。方法 利用真菌保守区核糖体基因和可变区内转录间隔区基因为靶序列,应用生物素标记的通用引物进行念珠菌DNA的PCR扩增,并将该PCR产物分别与固定在微孔板上的都柏林念珠菌和白念珠菌特异性探针杂交,经酶联显色反应测其A值。结果 能特异地鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌标准菌株。对108株常规培养方法从临床标本分离的白念珠菌检测,结果显示106株菌株仅白念珠菌探针检测阳性,另2株菌株仅都柏林念珠菌探针阳性。结论 微孔板双探针杂交法能快速、特异地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌。     

白念珠菌ERG11基因启动子部分序列分析

目的 探讨白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子部分(-440～-1)碱基序列的差异以及ERG11基因启动子突变与白念珠菌对氟康唑敏感性的关系。方法 分别提取从同一亲本来源、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因启动子序列及其编码序列设计一对引物,对ERG11基因上游启动子部分碱基序列(-503～53)进行PCR扩增,经PCR产物直接测序比较白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子序列(-440～-1)的差异以及对氟康唑敏感性不同的白念珠菌ERG11基因启动子序列的差异。结果 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11启动子序列未发现差异。氟康唑敏感株白念珠菌ERG11基因启动子的-365,-353,-328,-310,-308,-299,-295,-293,-292,290,-289位点为杂合状态,且在-284位点有一等位基因发生单碱基缺失(-284delT);而在白念珠菌氟康唑剂量依赖性敏感和耐药株上述杂合现象消失。结论 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子-440～-1区碱基序列无差异;ERG11基因启动子突变可能与白念珠菌对氟康唑耐药有关。     

白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶基因在急性念珠菌性外阴阴道炎中的表达

目的 了解白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)基因在人类阴道白念珠菌感染时的表达情况。方法 收集9例阴道念珠菌检测阴性及20例阴道念珠菌感染者的阴道分泌物,通过用特异引物系列进行RT-PCR反应来评价Sap1~Sap6在人体阴道环境中的表达情况。结果 Sap2和Sap5在阴道白念珠菌感染者中是最主要的表达基因;Sap3和Sap4在所有检查者中均被检测到;所有6种Sap基因在某些阴道念珠菌病患者中同时被检出。结论 Sap基因可能与阴道念珠菌病的发病机制有关。     

基于PCR-LIS-SSCP的白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因比较研究

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-LIS-SSCP图谱的比较,探讨两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提16株来自同一亲本且对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计7对引物,对其进行分段PCR扩增,扩增产物经单链变性后,以非变性聚丙烯酰胺凝胶进行SSCP分析。结果16株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出目的片段,SSCP图谱显示两相细胞的ERG11基因序列存在多位点差异。结论白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11,基因存在着差异。     

阴道分离的念珠菌体外抗真菌药物敏感性分析

目的 探讨念珠菌在女性阴道黏膜所致的不同表现与其对抗真菌药物敏感性之间的关系。方法 应用NCCLSM27-A方案推荐的微量液体稀释法,测定对来自外阴阴道念珠菌健康携带者、外阴阴道念珠菌病和复发性外阴阴道念珠菌病的念珠菌对抗真菌药物的敏感性。结果 8种抗真菌药对光滑念珠菌和克柔念珠菌的MIC值几乎均比白念珠菌高。来自复发性外阴阴道念珠菌病患者的菌株MIC值较高,而健康带菌者菌株的MIC值较低。耐药菌株主要来源于复发组,健康带菌者来源的白念珠菌菌株对伊曲康唑、氟康唑、酮康唑和制霉菌素未见有耐药菌株出现。结论 外阴阴道念珠菌病治疗中应重视非白念珠菌的耐药性,长期或间断应用抗真菌药物治疗,可能诱导耐药株的产生。     

Genotype analysis of Candida albicans isolates obtained from different body locations of patients with superficial candidiasis using PCRs targeting 25S rDNA and ALT repeat sequences of the RPS

BACKGROUND: Several molecular biology-based genotyping techniques have been adapted for studying the molecular characteristics of Candida albicans strains, which constitute the majority of the etiologic agents in candidiasis. Recently, we reported a PCR system targeting 25S rDNA and ALT repeat sequences in the repetitive sequence (RPS) for genotyping of C. albicans. OBJECTIVE: To assess the potential of 25S rDNA and RPS-based genotyping for studying the molecular epidemiology of C. albicans, and define the genotypic relationship of C. albicans between invasive and non-invasive lesions in the same individual. METHODS: C. albicans strains were isolated from infected lesions and commensal sites, such as oral mucosa and/or feces, of patients with superficial candidiasis. The genomic DNAs were amplified by PCRs using P-I and P-II to determine the 25S rDNA- and RPS-based genotypes of the isolates. RESULTS: Genotype A:3 C. albicans constituted the majority of the isolates, followed by A:3/4 and B:3 C. albicans. There was usually one genotype of C. albicans per person. The genotypes of infected lesion isolates and non-infected oral mucosa and/or feces isolates were identical in the same individual, even in serially isolated C. albicans. CONCLUSION: The results indicate that our combined PCR technique using P-I and P-II is a potential tool for molecular typing of C. albicans, and reveal that the genotypes of isolates are identical in the same individual, independent of the infective and non-infective phases or the body location.     

外阴阴道念珠菌病复发前后分离菌株基因型分析

目的 比较从外阴阴道念珠菌病患者复发前后分离菌株的RAPD指纹图谱的异同。方法 通过流行病学调查表来收集病例和采集样本。所有临床分离菌株均经芽管形成试验、念珠菌显色培养基（CHROMagar Candida） 和API20C系统鉴定，然后用RAPD技术对2株白念株菌标准菌株和来自24例患者连续2次及1例患者连续3次分离出的临床菌株共51株菌株进行基因分型。结果 引物4的RAPD扩增结果表明，66.7%的患者再次发作前后菌株的扩增带型一致。引物7的RAPD扩增结果为，58.3%的患者复诊前后菌株的扩增带型一致。25例患者中有4例患者前后2次分离的菌种从白念珠菌替换成光滑念珠菌。结论 从外阴阴道念珠菌病患者分离的菌株半数以上在再次发作前后无明显基因型上的差别，仅有部分菌株会在复发前后基因型发生改变。     

耐氟康唑白念珠菌两种基因分型方法的比较研究

目的比较钳位均匀电场电泳(CHEF)和限制性核酸内切酶BssHII电泳核型(PFGE-BssHII)分型方法对耐氟康唑白念珠菌基因型的区分能力,探索不同部位、不同地区、不同耐药性菌株DNA核型的差异。方法采用CHEF和PFGE-BssHII分型方法对54株不同来源白念珠菌(氟康唑耐药株16株,剂量依赖型敏感株7株,敏感株31株)进行核型分析。结果54株白念珠菌经CHEF和PFGE-BssHII分别分出20种和37种DNA核型。16株从同一AIDS患者口咽部念珠菌病多次发作中分离的白念珠菌对氟康唑的敏感性发生变化,通过两种方法检测的DNA核型完全相同,显示为同一菌株,且核型不随耐药性的变化而改变。结论PFGE-BssHII方法区分DNA核型的能力高于CHEF。本研究白念珠菌菌株间的基因型具有个体差异,但与分离的部位、不同地区来源及抗真菌药耐药性间差异无显著性。     

甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染分离株DNA同源性分析

目的 探讨甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染分离株基因型的差异。方法 采用PCR扩增红色毛癣菌rDNA非转录间隔区（NTS）中TRS1片段,并用随机引物OPAA11随机扩增DNA,检测基因多态性。比较同一患者不同感染部位分离菌株的基因型差异。结果 共分离30株红色毛癣菌,按照PCR扩增TRS1区指纹图分为5型,随机引物OPAA11扩增指纹图分为11型,基因型分布与感染部位关系不大。在10例受试患者中,PCR扩增TRS1区显示,7例不同感染部位分离得到的菌株基因型有差异;随机引物OPAA11扩增显示,8例不同感染部位分离得到的菌株基因型有差异。结论 甲真菌病患者不同部位红色毛癣菌感染可能为不同菌株引起,提示部分甲真菌病患者不同部位皮肤癣菌感染可能存在不同菌株的感染。     

甲真菌病患者多部位红色毛癣菌分离株的DNA分型

目的探讨甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染不同部位分离菌株基因型的差异。方法采用PCR扩增红色毛癣菌rDNA非转录间隔区(NTS)中Trs-1片段,检测基因多态性并比较。结果30株受试菌株按照PCR指纹图共分为3型,基因型分布与感染部位无相关。10例受试患者中,5例不同感染部位分离出的菌株基因型存在差异。结论甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染可能为多菌株引起,部分患者可能存在多菌株的混合感染。     

阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的对分离自外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道的常见致病性非白念珠菌进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法的鉴定。方法首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、法国科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统将分离自VVC患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种,然后采用真菌通用引物将4种常见非白念珠菌(包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌)进行PCR扩增,并选用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果在4种非白念珠菌中光滑念珠菌15株(7.50%),近平滑念珠菌7株(3.50%),克柔念珠菌5株(2.50%),热带念珠菌2株(1.00%);PCR扩增后均产生稳定、清晰的条带,扩增产物经MspⅠ,HaeⅢ酶切后分别产生4种和2种特异性带型。结论外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌为主;PCR-RFLP方法在鉴定常见致病性非白念珠菌中比较可靠、稳定、特异,但仍有方法繁琐等不足之处。