细菌性皮肤病

20050852 用PCR-RFLP技术检测皮肤感染性肉芽肿组织中的分枝杆菌/蔡林(北京大学人民医院皮肤科),张建中//北京大学学报.-2004,36(5).-462-465 采用皮肤感染性肉芽肿患者的组织标本5份,提取组织DNA进行巢式PCR扩增,对PCR产物分别用Hha Ⅰ、Mbo Ⅰ、BstⅥ3种限制性内切酶进行酶切,聚丙烯胺凝     

用PCR-限制性片段长度多态性分析法检测游泳池肉芽肿中海分枝杆菌

目的：探讨用PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）分析法快速检测游泳池肉芽肿组织中海分枝杆菌。方法：对疑诊为游泳池肉芽肿患者5份皮损组织DNA进行PCR扩增,扩增产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ两种限制性内切酶进行酶切,再用琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并与培养结果进行比较。结果：5份标本中均检测出海分枝杆菌,与培养结果一致。经过3～7个月治疗,4例患者治愈,1例患者好转。结论：用PCR—RFLP可以快速鉴定海分枝杆菌,有利于该类疾病的早期诊断和及时治疗。     

PCR-RFLP法直接检测分枝杆菌皮肤感染的临床应用

目的:评价分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)基因检测分枝杆菌皮肤感染标本的敏感性和特异性。方法:多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-砒LP)的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶法直接检测Hsp65基因,PCR-RFLP检测阳性的标本再经Hsp65基因和16S rRNA DNA基因测序验证。结果:与培养法相比,PCR-RFLP法检测临床分枝杆菌皮肤感染的敏感性为30%(3/10),特异性为100%(10/10)。结论:分枝杆菌PCR-RFLP的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶法可用于分枝杆菌皮肤感染的临床检测。     

脓肿分枝杆菌致全身播散性皮肤感染一例

目的 报道1例罕见的全身播散性脓肿分枝杆菌皮肤感染.方法 对患者作全面临床检查.应用流式细胞仪检测患者细胞免疫水平,同时进行组织病理检查、组织培养.用PCR-RFIJP、基因测序方法对分离自患者皮损的分枝杆菌做鉴定.结果 患者女,22岁,1年多前,无明显诱因面颈部出现对称性红斑,并在此基础上渐出现丘疹、结节和斑块,逐渐扩展至躯干四肢;患者CD4⁺T细胞低于正常,HIV抗体检测阴性.对皮损进行两次多管体外培养,3～5天后,Löwenstein-Jensen培养基上(37℃和32℃)出现阳性菌落.PCR-RFLP比较分析发现,临床分离株的酶切(BstEⅡ和HaeⅢ)图谱与脓肿分枝杆菌的酶切图谱相符合;对临床分离株的hsp65、16S rRNA基因进行了序列分析,发现该二序列与脓肿分枝杆菌同源性最接近,分别是99.75%和100%.予以患者口服利福平、异烟肼、左氧氟沙星、克拉霉素,胸腺肽肌内注射,2个月后皮损明显好转.复查该患者的免疫状况,CD4⁺T细胞已在正常范围;6个月后颈部、躯干及四肢皮损基本痊愈.结论 结合表型特征、DNA酶切图谱和序列分析,临床分离株符合脓肿分枝杆菌;抗生素联合化疗辅以免疫调节剂综合治疗有效.     

麻风病患者皮损中分离出的分枝杆菌的分子鉴定

目的：在分子水平上鉴定麻风病患者皮损中分离培养出的抗酸杆菌。方法：首先对麻风病患者皮损中分离出的9株分枝杆菌的hsp65基因进行PCR扩增;其次,对其PCR扩增产物进行酶切,然后,对该9株菌的PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）分析的酶切带型进行分析;最后,再据上述初步鉴定结果,用特异性引物进行PCR扩增予以证实。结果：PCR-RFLP获得的酶切带型皆与细胞内分枝杆菌的酶切带型一致;用细胞内分枝杆菌的特异性引物分别对该9株临床分离株的模板DNA进行PCR扩增后,均获得271bp大小的特异性阳性条带。结论：麻风病患者皮损中分离出的9株分枝杆菌,其基因型表现属于细胞内分枝杆菌。     

鸟分支杆菌聚合酶链反应检测的研究

目的 建立敏感性高、特异性强的快速检测鸟分支杆菌的方法.方法 用特异性引物对连续稀释的鸟分支杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性;并用该引物对除鸟分支杆菌外的其他17株分支杆菌DNA进行扩增,验证其特异性;将正常皮肤组织与鸟分支杆菌的菌悬液混合以模拟临床皮肤感染标本,初步探讨适宜的临床标本前处理的方法,以提高PCR方法在检测临床皮肤组织感染中的敏感性.结果 PCR方法可扩增427bp的鸟分支杆菌DNA片段,敏感性达1×10²个菌细胞/mL,对其他分支杆菌进行扩增,结果均为阴性.对模拟临床皮肤感染标本进行PCR检测,敏感性降低为1×10⁴个菌细胞/mL;将组织匀浆连续倍比稀释后,再加入细菌悬液,结果当组织匀浆稀释度≥1:4时,PCR的敏感性提高到1×10²个菌细胞/mL.结论 PCR方法能敏感、特异地快速检测鸟分支杆菌.     

分枝杆菌在北京水源环境中的分布:M.arupense国内首次报告

目的:研究北京水源中分枝杆菌的分布,应用表型鉴定方法和分子生物学方法进行分枝杆菌鉴定,并比较两种方法的准确性和优缺点.方法:采集水源环境标本,进行分枝杆菌分离培养,通过生化反应对所有分离株进行鉴定.同时从培养菌落中提取分枝杆菌DNA,用PCR扩增65 ku热休克蛋白基因,扩增产物分别应用两种限制性内切酶BstEⅡ和Hae Ⅲ酶切,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析和PCR产物的测序分析.结果:从30份养鱼水中分离出35株分枝杆菌.①表型鉴定结果:Runyon Ⅰ群1株,可疑为海分枝杆菌;Runyon Ⅱ群7株,确定为戈登分枝杆菌或疑似戈登分枝杆菌;Runyon Ⅲ群9株,未鉴定到种;Runyon Ⅳ群18株,其中龟-偶发分枝杆菌复合群9株,其余9株未鉴定到种.②PCR-RFLP鉴定结果:戈登分枝杆菌8株,龟-偶发分枝杆菌复合群8株(包括M.peregrinum 1株),疑似日内瓦分枝杆菌10株,其余9株未鉴定到种.③PCR产物测序鉴定:戈登分枝杆菌10株,M.arupense9株,偶发分枝杆菌7株,土分枝杆菌6株,不产色分枝杆菌1株,M.peregrinum 1株,脓肿分枝杆菌1株.结论:非结核分枝杆菌(NTM)广泛存在于养鱼水中,分枝杆菌采用65 ku热休克蛋白基因PCR扩增配合测序鉴定较传统表型鉴定和PCR-RFLP更准确.     

四种分枝杆菌快速检测方法的研究

目的 建立敏感、特异的快速检测4种分枝杆菌的方法。方法 用特异性引物对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性和特异性。将上述4种分枝杆菌的特异性引物同时放入PCR扩增反应体系中,以此反应体系分别对该4种分枝杆菌菌悬液DNA、及其两两组合或特定的三重组合进行扩增,同时验证其敏感性。结果 4种分枝杆菌的特异性引物分别放入各自的PCR扩增反应体系中,可分别特异性地扩增出该4种分枝杆菌对应的DNA片段,敏感性达1×10¹～1×10²个菌细胞/mL。4种分枝杆菌的特异性引物同时放入同一PCR扩增反应体系中可分别特异性地扩增出对应的4种分枝杆菌单菌及其两两组合或三种分枝杆菌组合的DNA片段,敏感性达1×10²～1×10³个菌细胞/mL;4种分枝杆菌的特异性引物对其他分枝杆菌进行扩增,结果均为阴性。结论 多重PCR方法能敏感、特异地快速检测4种分枝杆菌。     

中国南方部分城市泌尿生殖道沙眼衣原体基因分型研究

目的 了解中国南方4个城市性病高危人群中沙眼衣原体(Ct)基因型的分布特征。方法 从衡阳、上海、广州、江门四个城市的性病门诊收集1180份泌尿生殖道标本,经质粒PCR筛选后,阳性者用巢式PCR扩增Ctomp1基因片段,酶切omp1扩增产物,分析Ct各临床株omp1基因的限制性片段长度多态性(RFLP),将临床株分型。结果 Ct质粒PCR阳性者301份,用于分型者286份。通过RFLP分型,共检出10个基因型,其中常见的是E(30.8%)、J(23.8%)、D(17.5%)、F(10.5%)、G(6.2%)型,并且不同城市间基因型的分布差异无统计学意义(χ²=0.981,P>0.05)。结论 4个城市存在Ct多种基因型,并且基因型的分布大致相同。     

银屑病患者血小板活化因子乙酰水解酶基因突变的研究

目的 探讨血小板活化因子乙酰水解酶基因突变(Arg92→His)与银屑病的关系.方法 对47例银屑病患者及52例健康对照者,分别用聚合酶链反应技术(PCR)及限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析血小板活化因子乙酰水解酶基因组DNA的突变等位基因.结果 银屑病组突变率显著高于对照组(P<0.05).结论 血小板活化因子乙酰水解酶基因突变(Arg92→His)与银屑病存在相关性,其突变可能为银屑病的一个发病高危因素.     

皮肤分枝杆菌感染微孔板反向杂交检测法的研究

目的 探讨微孔板反向分子杂交技术与PCR-ELISA相结合的“拟芯片”法检测和鉴定几种常见的皮肤分枝杆菌感染的方法。方法 首先对5种分枝杆菌标准菌株(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶遇分枝杆菌)16s rRNA DNA进行PCR扩增获得其PCR产物:其次对"拟芯片"法反应条件进行优化;并对其敏感性、特异性进行检测;再用建立的方法对9例临床分离株进行检测和鉴定。结果 "拟芯片"法反应条件优化结果为:探针包被浓度为100 nmol/mL,探针包被时间为15 min,杂交的温度为55℃,杂交时间为45 min,辣根过氧化物酶标记的亲和素的稀释度为1:800;"拟芯片"法敏感性为1×10¹～1×10²个菌细胞/mL;特异性较好,各菌探针与其他分枝杆菌间无交叉。结论 "拟芯片"法是快速、敏感及特异的皮肤分枝杆菌感染诊断方法之一。     

PCR直接检测皮肤分枝杆菌感染的研究

目的 探讨PCR直接检测皮肤分枝杆菌感染作为诊断的可能性.方法 PCR检测方法及培养方法(Löwenstein-Jensen培养基)比较分枝杆菌纯菌悬液、模拟皮肤分枝杆菌感染标本前处理前后、疑似皮肤分枝杆菌感染的临床标本前处理前后的检测结果.结果 分枝杆菌纯菌悬液的PCR法和培养法敏感性皆为1×10²个菌细胞/mL.模拟临床标本在经过前处理后在浓度为1×10²个菌细胞/mL的数量级上PCR检测阳性率为60%,而未经过前处理的模拟临床标本在此数量级上PCR检测阳性率为0,培养方法的阳性率为100%,但在浓度为1×10³个菌细胞/mL数量级上PCR检测阳性率为100%.37例临床疑似皮肤分枝杆菌感染标本经前处理后,PCR检测7例阳性,而未经前处理的标本同法检测2例阳性,但培养方法可检出9例阳性.结论 临床皮肤标本经前处理后,PCR检测的敏感性已接近80%,但能明显缩短检测时间.     

Identification of mycobacterial DNA in cutaneous lesions of sarcoidosis

Sarcoidosis is a multisystemic granulomatous disease of uncertain etiology. Recently, mycobacterial DNA especially Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complex were detected in lung tissue and bronchial lavage fluid from patients with sarcoidosis by polymerase chain reaction (PCR) assays in 30% to 50% cases. Moreover, cell wall-defective form (CWDF) acid-fast bacteria have been isolated from skin lesions of patients with sarcoidosis which were later confirmed as M. avium complex by PCR assays. CWDF acid-fast bacteria were also found to grow from the blood of 95% patients with active sarcoidosis demonstrating a mycobacterial origin similar to M. tuberculosis. In view of these reports, we investigated 20 cases of cutaneous sarcoidosis using PCR/restriction enzyme pattern analysis (PCR/REPA) to detect mycobacterial DNA from paraffin-embedded skin biopsy samples. The method involves restriction enzyme analysis of nested PCR products obtained with primers encoding for the 65-KDa protein common to all mycobacteria. Using three restriction enzymes, the mycobacterial DNA from PCR product was differentiated to the species level. All the 20 cases had clinical and histologic evidence of sarcoidosis. Special stains for fungi (PAS) and mycobacteria (Fite) were negative and no foreign body was identified on polaroscopic examination in any of the cases. The cell lysates of M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium kansasii and Mycobacterium marinum from Centers for Disease Control (CDC) were used as standard control for PCR/REPA. Eight cases of foreign body granuloma, seven normal skin samples from the margin of surgical excisions and 5 cases of dermatitis were used as negative controls, and 4 cases of cutaneous tuberculosis were used as positive controls. Mycobacterial DNA was detected by PCR in 16 of the 20 cases of sarcoidosis. PCR/REPA subtyped 8 of these to M. tuberculosis complex (2 cases), M. avium-intracellulare (4 cases), M. kansasii (2 cases) while the other 8 cases were non-tuberculous mycobacteria. All four cases of cutaneous tuberculosis were positive by PCR and had a typical M. tuberculosis PCR/REPA pattern. Mycobacterial DNA was not detected in any of the negative controls. Our results demonstrated that mycobacterial DNA is present in 80% of cutaneous lesions of sarcoidosis and these mycobacteria may play a role in the pathogenesis of sarcoidosis.     

皮肤感染性肉芽肿常见病原菌微孔板反向杂交检测法的研究

目的 探讨微孔板反向分子杂交技术与PCR-ELISA相结合的“拟芯片”法检测和鉴定皮肤感染性肉芽肿常见病原菌的方法。 方法 选取、设计真菌和分枝杆菌两对通用引物,及10种皮肤感染性肉芽肿常见的病原菌：结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、偶遇分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、申克孢子丝菌、卡氏枝孢霉、裴氏着色真菌、F. Monophora、白念珠菌的特异性探针;采用标准株验证通用引物、特异性探针并检测“拟芯片”法的敏感性、特异性;对19株临床分离株进行检测和鉴定。 结果 两对通用引物均可扩增出对应的菌种基因序列,PCR产物经测序分析与预期相符;“拟芯片”法检测阴性标本吸光度为0.041 ± 0.02,公式计算得临界值为0.101,在此基础上测得其敏感性为1 × 10 ~ 1 × 102个菌细胞/ml。各病原菌与相应的探针杂交,吸光度均 ＞ 0.101,为阳性;而与非对应的探针杂交,则吸光度 ＜ 0.101,为阴性,特异性高;对临床分离株的菌种鉴定准确率高。 结论 “拟芯片”法可应用于皮肤感染性肉芽肿常见病原菌的实验室快速检测和鉴定。     

Histopathological spectrum of cutaneous tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial infections

The non-specific clinical findings and variable histopathological features of cutaneous tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial infections often make it difficult to establish a diagnosis and initiate appropriate therapy. We investigated 25 patients diagnosed with mycobacterial infections of the skin in Hanyang University Hospital between 2001 and 2011. Skin biopsy specimens were re-evaluated by various histopathological criteria and molecular studies. To identify the mycobacteria, we performed staining for acid-fast bacilli and also completed polymerase chain reaction analysis. The non-tuberculous mycobacterium species were identified by genetic sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Immunocompromised status was more frequent in non-tuberculous mycobacterial infections than in tuberculosis (p = 0.017) while disease duration was longer in tuberculosis (p = 0.026). Microscopically, neutrophil infiltration, interstitial granuloma, small vessel proliferation and increased numbers of bacilli were found to be associated with non-tuberculous mycobacterial infections (all p < 0.05). In contrast, giant cells, plasma cells, tuberculoid granulomas and necrosis were associated with tuberculosis (all p < 0.05). There were no species-specific histopathological findings in non-tuberculous mycobacterial infections. The significant histopathological differences between cutaneous tuberculous and non-tuberculous mycobacterial infections are helpful in considering differential diagnoses. In addition, molecular techniques together with clinico-pathological findings may assist in making accurate diagnoses of cutaneous non-tuberculous mycobacterial infections.     

球形马拉色菌是马拉色菌毛囊炎患者皮损毛囊内的主要菌种

目的 确定引起马拉色菌毛囊炎的主要菌种,比较皮损毛囊内和毛周表面皮肤菌种是否一致,患者性别、年龄、病情与分离菌种的关系。方法 菜子油培养基培养,根据形态及生理生化特点进行鉴定。结果 从毛周表面皮肤分离的319株菌中鉴定出合轴马拉色菌247株(77.43%)、糠秕马拉色菌40株(12.54%)、球形马拉色菌27株(8.46%)、钝形马拉色菌5株(1.57%);从毛囊内分离的314株菌中鉴定出球形马拉色菌252株(80.25%)、合轴马拉色菌57株(18.15%)、糠秕马拉色菌4株(1.27%)、钝形马拉色菌1株(0.32%),菌种构成差异有显著性(P<0.01)。毛囊内菌种构成与患者的性别和年龄有关,与病情无关。毛囊内和毛周表面皮肤同时阳性的279株中菌种不一致204株,菌种一致75株。结论 马拉色菌毛囊炎毛囊内的主要菌种为球形马拉色菌,其表面皮肤则以合轴马拉色菌为主。