念珠菌对唑类药物耐药机理的探讨

文献报道念珠菌对唑类药物耐药机制有三，即膜通透性降低、靶酶改变及靶酶产生过多。本文对２６株分离自艾滋病患者的耐氟康唑白念珠菌及通过诱变获得的白念珠菌ＡＴＣＣ１４０５３五个氟康唑耐药突变菌落的耐药机制进行了初步探讨。根据唑类药物靶酶编码序列设计六对上下之间交叉重叠的引物，分六段（包括相当于调控序列所在部位）将目的基因扩增出来，采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、限制性片段多态性分析及聚合酶链反应－单链构象多态性分析等方法对所获目的片段进行了分析。结果排除了所有受试菌株因靶酶编码基因缺失而耐药的可能，单链构象多态性分析结果呈阳性，且耐药株之间也存在差异。故此，推测耐药性系因为靶酶编码序列多位点突变造成，这一点尚有待进一步证实。另外，本实验结果不能排除另两条耐药机理的存在     

滚环扩增技术检测耐氟康唑白念珠菌TAC1点突变

目的 利用滚环扩增技术检测耐氟康唑白念珠菌的TAC1点突变,建立一种准确、快速、特异的检测核酸单点突变的方法,同时进一步了解TAC1点突变与耐药的关系。方法 收集33株耐氟康唑白念珠菌（8株来自美国,25株来自澳大利亚）,根据文献报道的与耐药有关的点突变和挂锁探针设计原则设计4个挂锁探针。提取DNA、PCR扩增获得TAC1的三个目的片段;然后用滚环扩增技术检测耐药株的点突变。将滚环扩增所得结果与测序结果进行比较。结果 33株耐氟康唑白念珠菌中,有5株TAC1出现与耐药相关的点突变,分别为T225A（1株）和A736V（4株）,其中4株菌来自美国。4株氟康唑敏感白念珠菌中TAC1未见与耐药相关的点突变。结论 滚环扩增技术能准确、快速检测核酸单点突变;TAC1点突变与耐药的关系有待进一步研究。     

ERG11和ERG3基因突变与念珠菌对氟康唑耐药的关系

目的探讨热带念珠菌、白念珠菌的ERG3、ERG11基因突变与其对唑类抗真菌药物耐药的关系,以初步探讨热带念珠菌对唑类药物耐药的机制。方法收集本院2015年3月-2016年10月期间临床分离的念珠菌52株,经体外药敏试验得到耐氟康唑的热带念珠菌6株、白色念珠菌1株;提取基因组DNA,通过PCR分别扩增6株热带念珠菌与1株白色念珠菌ERG11、ERG3基因,将扩增后的产物分别进行双向测序;将测序结果与热带假丝酵母菌标准菌株、白色念珠菌标准株的序列通过BLAST比对分析,找出突变基因。结果 6株热带念珠菌ERG11基因序列共发现3个同义突变与2个错义突变,ERG3基因共发现4个同义突变,6个错义突变;1株白色念珠菌耐药株ERG11基因共发现2个同义突变与2个错义突变,ERG3基因共发现2个同义突变,未发现错义突变。结论耐药菌株ERG11或ERG3存在不同程度的突变,这些突变可能参与热带念珠菌、白念珠菌耐药性的形成。     

白念珠菌临床株氟康唑敏感性试验与ERG11基因突变检测

目的 了解白念珠菌临床株对氟康唑的敏感性,筛查临床菌株的ERG11突变,探讨其与耐药的关系.方法 收集鉴定白念珠菌临床株,采用微量稀释法和药敏纸片法体外测定试验菌株对氟康唑的敏感性.分段扩增ERG11基因的第295～777bp(483bp)、第723～1204bp(482bp)和第1179～1667bp(489bp)等3个片段,并测序.结果 共收集念珠菌80株,分离白念珠菌52株,52株白念珠菌均为敏感株.经测序的5株敏感白念珠菌ERG11基因共出现19处突变,其中14处为同义突变,其余5处错义突变(T495A、A530C、G640A、A945C、G1609A)分别可引起羊毛甾醇14α-去甲基酶的下列氨基酸改变:D116E、K128T、E165K、E266D、V488I.结论 白念珠菌临床株对氟康唑敏感性较高;E165K和V488I可能与耐药无关.     

艾滋病患者白念珠菌ERG11基因突变的研究

目的 探讨艾滋病患者的白念珠菌唑类耐药株中唑类抗真菌药物(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑)的作用靶位基因ERG 11基因突变与耐药的关系.方法 用PCR对临床分离的93株白念珠菌的Erg11基因进行扩增、测序,DNAman软件将测序结果与基因库中的X13296进行比对,将突变碱基翻译为氨基酸,确定是否发生错义突变.结果 共检出40个碱基突变位点,包括27个同义突变位点和13个错义突变位点.耐一种药物的突变菌株中每株菌只发生一处错义突变或无错义突变,而耐二种或三种药物的菌株中每株菌还可以同时出现两处或三处错义突变.结论 ERG 11基因错义突变与白念珠菌耐药有关.     

PCR—DNA直接测序检测1例单纯型大疱性表皮松解症Weber—Cockay…

单纯型大疱性表皮松解症（ＥＢＳ）是一组常染色体显性的遗传性疾病，研究表明本病存在角蛋白Ｋ５／Ｋ１４基因点突变。ＥＢＳ的各个亚型突变发生部位有一定差异，其中Ｗｅｂｅｒ－Ｃｏｃｋａｙｎｅ亚型（ＷＣ－ＥＢＳ）突变多位于Ｋ５／Ｋ１４的连接区Ｌ１－２。本研究设计了扩增Ｋ５基因Ｌ１－２区ＤＮＡ片段的引物，应用ＰＣＲ对－ＷＣ－ＥＢＳ家系的患者及未发病成员进行扩增。ＰＣＲ产物测序发现患者Ｋ５第３４６密码子发生了Ａ     

白念珠菌的药物敏感性与基因型的研究

目的 探讨甲紫等5种抗真菌药物对白念珠菌的药物敏感性,分析白念珠菌药物敏感性与其基因型的关系。 方法 根据M27－A2方案检测甲紫、两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑对67株白念珠菌的药物敏感性。提取白念珠菌基因组DNA,应用PCR扩增白念珠菌25S核糖体 rDNA基因内含子区,根据PCR扩增片段将白念珠菌分为A（36株）、B（23株）、C（8株）基因型,分析白念珠菌不同基因型与药物敏感性的关系。结果 药敏实验结果显示,67株白念珠菌中,8.96%对氟康唑、2.98%对伊曲康唑、1.49%对酮康唑耐药,两性霉素B无耐药菌株。甲紫的最低抑菌浓度在0.125 ~ 4 mg/L。统计学分析显示,白念珠菌对5种抗真菌药物的敏感性与其基因型无明显相关关系,P值均 > 0.05。结论 氟康唑和伊曲康唑耐药菌株的增多在临床用药选择上应引起注意,甲紫的抗真菌作用值得重视。白念珠菌基因型与抗真菌药物耐药的发生可能无明显相关关系。     

皮肤念珠菌病患者多部位分离菌株DNA分型研究

目的 比较皮肤念珠菌病患者不同部位分离菌株基因相似性,推测皮肤念珠菌病多部位感染的可能途径。方法 采用PCR扩增引物P-Ⅰ和P-Ⅱ扩增出白念珠菌染色体25SrDNA片段和特征性的基因片段重复序列片段,结合两种扩增结果进行分型,并将870bp大小的特征性的基因片段重复序列片段用限制性内切酶EcoRⅠ和ClaⅠ消化。结果 来自19例皮肤念珠菌病患者的41株白念珠菌被分为6型,同一患者不同部位分离菌株基因型相似,不同个体间基因型有差异。结论 分离自皮肤念珠菌病患者不同部位的致病菌株基因型相同,提示其发病可能与外源性再发感染无关。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-RFLP比较分析

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因限制性片段长度多态性分析,比较两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提来自同一亲本、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1,CA-2,CA-4,CA-6,CA-7,CA-9,CA-11,CA-13~CA-17)菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计一对引物,对其进行PCR扩增(包括部分上游和下游非编码区),扩增产物分别用AccⅠ和MunⅠ消化、琼脂糖凝胶电泳后观察。结果各株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出约1 734bp大小的目的片段,CA-7,CA-14,CA-16和CA-17株两相细胞ERG11基因RFLP图谱存在差异,其余受试菌株未见差异。结论从DNA全貌来看,白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因存在差异。     

外阴阴道念珠菌病患者临床分离菌株的菌种及基因型分析

目的 探讨初发型、复发型外阴阴道念珠菌病患者及健康带菌者阴道分离的念珠菌菌种及菌株基因型与初发及复发的关系。方法 选择分别来自健康带菌者、外阴阴道念珠菌病患者和复发性外阴阴道念珠菌病患者。首先经菌种鉴定,然后用RAPD技术对来自3组人群的菌株进行基因分型。结果 临床分离株菌种鉴定结果为白念珠菌83株,非白念珠菌共14株。从9个随机引物中筛选出的2条引物(引物4和引物7)对初发组、复发组及健康带菌组分离株的扩增带型多数未表现出与菌株来源的联系,但少数菌株依来源不同表现出了一定区别。引物4和引物7可将来源于不同临床分型的97株菌及2株标准菌株分成19型和21型。结论 外阴阴道念珠菌病致病菌以白念珠菌为主,非白念珠菌中以光滑念珠菌为主。     

3492例生殖器炎症患者假丝酵母菌病原学及药敏情况分析

目的:了解江门地区生殖器假丝酵母菌病病原菌分布及药敏情况。方法:采用科玛嘉假丝酵母菌显色培养基和YBC(酵母菌)鉴定卡对3 492例生殖器炎症患者标本的致病真菌进行分离和鉴定,用ROSCO纸片扩散法检测分离菌株对制霉菌素、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、咪康唑和特比奈芬的药敏情况。结果:共分离出11种891株致病假丝酵母菌,其中白色假丝酵母菌占85.19%,热带假丝酵母菌占7.41%,近光滑假丝酵母菌占3.37%,其他假丝酵母菌占4.03%。891株假丝酵母菌对制霉菌素、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、咪康唑和特比奈芬的敏感性分别为98.09%、95.96%、88.33%、71.42%、45.68%和35.81%。结论:江门地区生殖器假丝酵母菌病致病菌种类较多,对药物的敏感性有降低趋势,耐药菌株在假丝酵母菌的构成比中有增高趋势,应加强假丝酵母菌的检测和药敏分析。     

耐氟康唑的白念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性检测

目的测定耐氟康唑白念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性,并探讨pH值对微量液基稀释法的影响。方法参照美国临床实验室标准研究所(CLSI)颁布的酵母菌抗真菌药物敏感性试验方案M27-A2,测定氟康唑(FLC)、伏立康唑(VOR)、伊曲康唑(ITC)、两性霉素B(AMB)和米卡芬净(MCFG)的最小抑菌浓度(MIC),并调整RPMI-1640液体培养基的pH值至4.5,测定FLC、VOR和ITC的MIC值。结果FLC的MIC值均>64μg/mL;VOR的MIC值,6株菌>16μg/mL,1株为2μg/mL,3株<1μg/mL;ITC的MIC值,7株≥1μg/mL,3株为0.25～0.5μg/mL;MCFG的MIC值为0.125～0.25μg/mL,AMB的MIC值为1～2μg/mL;使用pH值为4.5的RPMI-1640液体培养基,5种抗真菌药物的MIC值变化不明显。结论10株耐氟康唑的白念珠菌对MCFG均敏感,部分菌株对VOR和(或)ITC交叉耐药;部分耐FLC的白念珠菌对AMB的敏感度有所降低。降低RPMI-1640的pH值,可明显减少拖尾现象,但不影响药敏结果的判定。     

汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌增效活性的分子机制探讨

目的 探讨汉防己甲素在体外对氟康唑增效作用的分子机制。方法 分别提取 16 株白念珠菌酵母相总 RNA，采用 RT-PCR 方法比较汉防己甲素作用前及作用24 h后白念珠菌药物外排泵基因 MDR1、FLU1、CDR1、CDR2在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株中的表达情况。结果 在汉防己甲素作用前，MDR1、FLU1、CDR1、CDR2表达水平在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株间的差异均有统计学意义（P < 0.05）。汉防己甲素作用24 h后，与作用前相比，MDR1 在氟康唑耐药株中、FLU1在氟康唑剂量依赖性敏感、耐药株中、CDR1和CDR2在氟康唑敏感、剂量依赖性敏感、耐药株中表达水平的差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论 汉防己甲素在体外对氟康唑抗白念珠菌活性增效作用的分子机制与抑制药物外排泵基因MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表达均有关。     

唑类药物体外诱导白念珠菌耐药的初步研究

目的：了解不同抑菌浓度的唑类药物体外诱导白念珠菌的耐药情况。方法：将质控株及敏感白念珠菌在含不同抑菌浓度的氟康唑(FCZ)、酮康唑(KCZ)、伊曲康唑(ICZ)的液体培养基中进行人工传代诱导耐药。结果：敏感白念珠菌在高浓度的唑类药物培养基中能诱导耐药，且为交叉耐药，而在低浓度中经传20代仍不能诱导耐药；诱导后的耐药菌株在无药物培养基中传代可恢复敏感性。结论：唑类药物能诱导耐药白念珠菌的产生，但与诱导药物的浓度有关，且为不稳定耐药。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较研究

目的 通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较,探讨两相在DNA水平的差异。方法 对5株分离自同一HIV阳性患者的白念珠菌分别进行菌丝相与酵母相培养后,抽提基因组DNA,PCR扩增ERG11基因(包括部分上游和下游非编码区),用下游引物对部分ERG11基因进行测序。结果CA-7菌丝相与酵母相ERG11基因序列存在差异,分别位于第1547,1587和1617位点。结论 白念球菌菌丝相与酵母相在DNA水平存在差异,在进行白念珠菌的病原真菌学研究中菌丝相为适宜的研究对象。     

DNA芯片鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变

目的 建立DNA芯片技术鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变。方法 根据6种常见念珠菌内转录间隔（ITS2）区种特异性序列和白念珠菌ERG11基因中已证实可导致对氟康唑耐药的6种突变序列设计探针,制备DNA芯片,鉴定12条50 bp的念珠菌种特异性序列和ERG11突变序列及34株念珠菌（其中白念珠菌29株,热带念珠菌、光滑念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌各1株）。结果 ①芯片正确鉴定12条人工合成序列;②正确鉴定34株试验菌株的菌种;③正确鉴定29株白念珠菌ERG11基因中可致耐药的已知突变。敏感性和特异性均为100%。结论 用DNA芯片进行念珠菌菌种鉴定和白念珠菌ERG11突变筛查,结果可靠。     

应用微卫星对白念珠菌种内分型

目的:用rDNA以外的重复序列(微卫星)对白念珠菌进行种内分型。方法:选取临床分离株20株以及标准株1株,设计针对保守基因CDC3的引物进行PCR,PCR产物连接到载体,转化,然后测序和分型。结果:21株菌株依微卫星型别被分为5种基因型,依片段长度型别分为7型。2株临床分离株和1株标准株经转种10次以后基因型仍然保持稳定。结论:CDC3中的微卫星遗传稳定,可以作为基因分型标记。用该方法可以进行白念珠菌种内分型,将为开展白念珠菌病流行病学调查提供一个方法。