结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因,酶切,克隆至PGEM-TEasy质粒,测序确定插入片段的正确性,再克隆至表达载体pET30a中,并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导,表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因,构建了重组表达质粒,得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,纯度〉90%。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白,可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因，酶切，克隆至PGEM—TEasy质粒，测序确定插入片段的正确性．再克隆至表达载体pET30a中，并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导，表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因，构建了重组表达质粒，得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，纯度〉90％。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白，可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础．     

蛔虫抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

目的在毕赤酵母表达系统中表达蛔虫抗菌肽cecropin P1并检测其生物活性。方法根据毕赤酵母的密码子偏好性,人工设计并合成3条cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到cecropin P1基因,构建重组载体pMD18-T-CecP1。双酶切pMD18-T-CecP1,将cecropin P1基因克隆到载体pPICZα-A信号序列α-因子之后,构建酵母分泌表达载体pPICZα-A-CecP1,用SacⅠ将其线性化后转化毕赤酵母X-33,采用Zeocin抗性筛选阳性菌株并进行诱导表达,发酵上清进行SDS-PAGE分析,抑菌试验鉴定其抑菌活性。结果获得酵母分泌表达载体pPICZα-A-CecP1。SDS-PAGE证实pPICZα-A-CecP1/X-33甲醇诱导产物的分子质量单位为6.3 ku。表达产物对大肠埃希菌DH5α的生长有抑制作用。结论应用毕赤酵母表达系统能表达cecropin P1。该抗菌肽具有抑菌作用。     

甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的 将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株.方法 通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI 和KpnI 酶切消化后连接,构建真核表达载体pPICZα-HSA/M2e,线性化后电转化毕赤酵母X-33.用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDS-PAGE和Western印迹法筛选高表达HSA/M2e菌株.结果 经RT-PCR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致,构建的pPICZα-HSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆.SDS-PAGE和Western印迹分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HSA/M2e,分子量约为68 kD.结论 成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建

目的　扩增SjCL2基因 ,构建巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2 ,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础。方法　运用RT -PCR技术 ,从日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫总RNA中扩增获得SjCL2基因 ;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB质粒 ;经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序分析SjCL2基因并确定其读码框的正确插入。结果　利用RT -PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约 1Kb大小的SjCL2基因 ,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB中。 结论　成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2质粒     

结核分枝杆菌Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的克隆结核分枝杆菌hspx(acr、Rv2031c)基因,扩增后测序,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白Hsp16.3(Heat Shock Protein16.3)。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出hspx基因片段,连接进入pTA2载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProEX HTb并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白SDS-PAGE分析后,分别与6×His mAb、16k Da mAb和结核病人血清进行Western-blot,最后用Ni-NTA进行亲和层析纯化蛋白。结果获得结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白基因,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量与文献报道一致;Western-blot结果显示,在相对分子量约16kDa处有与6×His mAb和鼠抗16k Da mAb的特异性结合带,而与结核病人血清杂交没有出现结合带。表达产物为包涵体,通过Ni-NTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白。结论成功地表达、纯化和鉴定了Hsp16.3蛋白,它有可能作为新型结核疫苗的靶抗原。     

结核分枝杆菌复苏促进因子基因克隆及其蛋白质的表达

目的通过对结核分枝杆菌复苏促进因子基因的克隆、融合蛋白的表达、纯化，以获得高活性的结核分枝杆菌复苏促进因子蛋白质。为临床标本结核分枝杆菌复苏培养及功能研究提供物质基础。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv的5个复苏因子基因，经内切酶酶切、胶回收，将片段亚克隆到T载体中，转化至DH5α。以PCR鉴定的阳性菌落转至LB中培养，菌液进行质粒提取、酶切、胶回收，回收片段再克隆至表达载体pET30a中，转化至DH5α中。PCR阳性菌落转至LB中培养，测序确定插入片段的正确性，菌液提取质粒，并再转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过适当的IPTG浓度诱导，适宜温度和时间下，诱导蛋白表达，经SDS—PAGE电泳分析，Western blot检测目的蛋白，在最佳条件下大量表达目的蛋白，并纯化。结果获得有活性的高纯度复苏促进因子蛋白，纯度〉90％。结论复苏促进因子蛋白的成功表达为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养最佳方案及复苏基因的功能研究打下良好基础。     

重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFPlO-ESAT-6)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆人pQE30质粒，表达、纯化rCFPl0-ESAT-6蛋白，通过Western blot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型，建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体，并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30-CFPl0-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％，分子质量为26000，纯化后的蛋白纯度为98％，浓度为1.2g／L。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应。以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值 2s为正常界限值，以融合蛋白为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应；以PPD为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应。结论 pQE30-CFPl0-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFPl0-ESAT-6融合蛋白，该蛋白兼具CFPl0和ESAT-6两种蛋白的抗原性，能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体。本研究为rCFPl0-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定

目的 构建Mtb重组蛋白Rv0222的重组质粒,评价其用于结核病血清学诊断的价值。方法 通过PCR从Mtb染色体基因组中扩增出Rv0222基因片段,插入pMD18-T载体后,再亚克隆入表达载体pET30a中,诱导表达重组菌,组氨酸标签（His-tag）亲和层析纯化蛋白,通过免疫印迹法分析重组蛋白的免疫反应性,通过间接ELISA方法检测142例血清样本,来自82例结核病患者（痰涂片或痰培养阳性,抗结核治疗症状减轻者）,28例非结核病患者（8例肺癌、15例肺炎和5例肺气肿）和32例健康体检者,检测数据通过专业医学软件MedCalc 11.5.0分析ROC曲线下面积和最佳阳性判定值。 结果 成功构建重组载体,重组蛋白Rv0222经电泳后显示相对分子质量约为27 000,镍柱纯化后蛋白纯度达95%以上,通过蛋白免疫印迹法证实重组蛋白Rv0222与结核病患者血清能特异性结合。酶联免疫检测ROC曲线下面积为0.893,最佳阳性判定值为0.12时,结核病患者组抗体检测敏感度为69.5%（57/82）,非结核病患者和健康体检者抗体检测特异度为90.0%（54/60）,结核病患者与非结核病患者及健康体检者相比,差异有统计学意义（t=25.78,P＜0.0001）。结论 成功构建pET30a-Rv0222表达载体,获得高纯度的重组蛋白Rv0222,ELISA结果显示Rv0222蛋白有望成为结核病血清学诊断的有效抗原之一。     

Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达

目的　克隆 2型登革病毒E基因并用酵母真核表达 ,获得全长的重组E蛋白 ,为其结构与功能的研究提供条件。方法　从感染DEN2 (NGC株 )后病变的C6 /36细胞上清中提取RNA ,通过RT -PCR扩增E基因片段 ,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒 ,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定 ,取Mut+菌诱导表达 ,SDS -PAGE、免疫印迹检测表达产物。结果　RT -PCR得到 1 5kb的E基因片段 ,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因 ;Mut+ 酵母转化菌可分泌表达约 6 9kDa的蛋白 ,与DEN2E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白。结论　成功将克隆的全长DEN2E基因在酵母菌中表达 ,获得的重组E蛋白具有免疫反应性。     

结核分枝杆菌MPT64在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆结核分枝杆菌MPT64基因全长，构建毕赤酵母分泌型表达载体，获得表达MPT64的重组毕赤酵母工程菌。方法利用PCR技术扩增MPT64基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZotA中；将正确的表达载体线性化后，电击导人到毕赤酵母GS115中，Zeocin^TM抗性筛选正确的重组子；SDS—PAGE及Western-blot鉴定分泌表达MPT6d的重组毕赤酵母。结果克隆获得了正确的MPT64酵母分泌表达载体，并获得了相应的重组酵母株，该重组子经甲醇诱导培养后能分泌大小约30kDa的蛋白，该蛋白能特异地与His抗体结合。结论本实验获得了酵母重组的结核杆菌MPT64蛋白，为探讨其生物学性能和临床上的应用奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌Hsp65的表达、纯化与鉴定

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接。将完整的hsp65基因克隆到pProEX HTa载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析。结果获得的结核分枝杆菌Hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65 kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65 kDa处与鼠抗MTB Hsp65 mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致。结论成功表达、纯化和鉴定了Hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2660c蛋白原核重组表达及其免疫活性研究

目的利用原核表达系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2660c,评价其在血清学方面用于结核病诊断的价值。方法合成Rv2660c全基因核酸序列,构建pET28a-Rv2660c融合表达载体,在原核系统内进行重组表达,亲和层析纯化重组Rv2660c蛋白,采用Western-Blot、ELISA实验分析重组蛋白的免疫反应。结果pET28a-Rv2660c在大肠杆菌内成功表达重组Rv2660c蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白分子量为10.2 KD,与预期一致,Western-Blot结果表明重组蛋白Rv2660c只能与活动性结核患者血清反应,出现一条杂交条带;ELISA结果发现重组Rv2660c蛋白与结核患者血清能产生较强的反应,结核病菌阳患者组、菌阴患者组、潜伏感染组以及健康对照组A450平均值分别为0.52、0.48、0.28和0.25。结论重组结核分枝杆菌Rv2660c蛋白具有一定的免疫原性,对活动性结核病的诊断具有一定的价值,但对结核分枝杆菌潜伏感染的诊断没有价值。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。