戊型肝炎病毒ORF2片段与ORF3嵌合重组抗原的纯化与免疫学性质

目的 考察具有多个优势原表位区段嵌合表达的戊型肝炎病毒（HEV）重组抗原的免疫学性质。方法 将构建的含有3个不同HEV抗原表位基因（ORF2.1:6287-6403nt,ORF2.2:6743-7126nt,ORF3）的表达质粒pThioHisORF(2.1 2.2 3）在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,其表达产物P（2.1 2.2 3）在8mol/L尿素下经阳离子柱SP Sepharose FF层析纯化,透析复性,以P(2.1 2.2 3）免疫家兔和小鼠,通过ELISA检测实验动物血清及戊型肝炎患者阳性血清IgG抗体,以Western蛋白印迹检测动物免疫血清对杆状病毒系统表达的抗原片段及嵌合抗原P（2.1 2.2 3）对患者阳性血清的免疫反应性。结果 纯化的抗原纯度达90％以上;免疫动物血清中检测到特异性抗体的滴度分别为1：25600（家兔）和1：12800（小鼠）以上,抗血清能够特异识别杆状病毒系统表达的HEV抗原片段,P（2.1 2.2 3）能与患者阳性血清特异反应。结论 嵌合表达的HEV重组抗原P（2.1 2.2 3）具有良好的免疫原性和免疫反应性,为进一步研究开发HIV诊断试剂盒及基因工程疫苗提供了基础。     

重组戊型肝炎病毒抗原免疫恒河猴及其对病毒攻击的保护

目的：了解重组抗原免疫恒河猴的抗体应答情况及其对病毒攻击的保护作用。方法：利用大肠杆菌表达的戊型肝炎（HEV）病毒3个不同的片段,分别为Agl(ORF2 C端431aa)、Ag2(ORF2 C端128aa片段）、Ag3[ORF3 122aa与ORF2 6287－6404碱基编码的39aa片段以及C端128aa依次以（Gly)n短臂连接的嵌合抗原]免疫恒河猴,用ELISA方法检测IgG抗体水平,3周后达到较高水平应答时,用HEV阳性粪便样静脉注射进行攻击,经肝脏病理切片观察、血清IgG、丙氨酸转氨酶（ALT）水平测定及粪便排毒的RT－nPCR检测来评价抗原对病毒攻击的保护作用。结果：对照组3只猴中两只发现肝脏组织产生明显的病理性改变,而免疫了抗原的试验组12只猴正常;对照组均在攻毒后3－4周发生ALT异常,为正常值的10－20倍,而试验组有部分猴不同程度轻微的ALT异常,其余正常;试验组免疫抗原后IgG水平迅速上升,滴度可达1：12800;对照组粪便中病毒RNA的检出在攻毒后7－50d左右,而试验组7－21d内以低水平存在。结论：重组的抗原片段诱发机体产生针对HEV的抗体应签,能够抑制HEV感染引起的肝炎症状的产生。     

表达戊型肝炎病毒ORF2蛋白的重组腺病毒构建及其经粘膜途径免疫小鼠

目的 构建可表达戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)ORF2蛋白(112-660ea)的重组腺病毒Adasy-EORF2,探讨其经鼻腔和腹腔免疫小鼠后。诱导机体产生特异性体液免疫和粘膜免疫应答的能力,为研制戊型肝炎疫苗探索新的途径。方法 经PCR扩增编码ORF2蛋白(112-660aa)的基因片段,将其连接于重组腺病毒Adasy系统的穿梭质粒pTrack-CMV上,与腺病毒基因组质粒pAdEasy-l共转化宿主菌BJ5183,经细菌内同源重组获得重组腺病毒基因组质粒,转染293细胞以产生、扩增重组腺病毒。将重组腺病毒以10^7pfu的剂量经鼻腔和腹腔免疫小鼠,通过ELISA检测血液IgG和粘膜IgA的应答情况。结果 重组腺病毒经鼻腔免疫小鼠后可刺激机体产生特异性IgA、IgG免疫应答,IgG最高滴度达l：l000。经腹腔免疫可刺激小鼠产生IgG免疫应答,最高滴度可达l：10000,未检测到明显的IgA应答。结论 表达HEV ORF2蛋白的重组腺病毒能刺激机体产生有效的免疫应答,具有成为新型戊型肝炎疫苗的潜力．     

戊型肝炎病毒（HEV）基因疫苗免疫小鼠的初步研究

本研究将含ＨＥＶＯＲＦ３ｃＤＮＡ的真核表达质粒作为基因疫苗直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨胳肌内，引发了实验小鼠特异性抗－ＨＥＶＩｇＧ反应。小鼠经２次基因疫苗接种或１次基因疫苗，然后用ＨＥＶ重组蛋白加强免疫后，血清抗－ＨＥＶＩｇＧ滴度较接种１次基因疫苗组明显升高。     

戊型肝炎病毒（HEV）基因疫苗免疫小鼠的初步研究

本研究将含ＨＥＶ ＯＲＦ３ ｃＤＮＡ的真核表达质粒作为基因疫苗直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内，引发了实验小鼠特异性抗－ＨＥＶ ＩｇＧ反应。小鼠经２次基因疫苗接种或１次基因疫苗，然后用ＨＥＶ重组蛋白加强免疫后，血清抗－ＨＥＶ ＩｇＧ滴度较接种１次基因疫苗组明显升高。     

戊型肝炎病毒抗原基因片段及其组合表达质粒的构建

目的：选择及组合戊肝病毒（ＨＥＶ）抗原基因片段,进行表达与免疫学特性研究。方法：根据已公布的ＨＥＶ序列,选择三段优势抗原表位,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增基因片段,产物以单独或经甘氨酸连接肽串联组合的方式克隆到载体ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ中,经ＤＮＡ序列分析后,将构建的重组质粒转入大肠杆菌中进行表达,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析初步考察其免疫学特性。结果：构建的六个重组质粒在大肠杆菌中获得了不同程度的表达,表达的目的蛋白具有与戊型肝炎患者阳性血清特异性结合的能力。结论：ＨＥＶ抗原片段及其组合在大肠杆菌中得到了高效表达,并为优良诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供了基础。     

戊型肝炎重症化与慢性化免疫学机制研究进展

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒感染引起的一种传染性疾病,是全球范围内的重要公共卫生问题。尽管戊型肝炎通常被认为是一种无症状、自限性疾病,但其临床表现呈多样性变化,部分患者可出现重症化或慢性化进展,造成不良预后,危害较为严重。免疫反应是决定戊型肝炎患者临床表现和结局的关键因素,正常的免疫反应有助于病毒清除和疾病康复,而过度或紊乱的免疫反应则可参与其重症化和慢性化进程,导致疾病进展。本文通过文献回顾,从天然免疫反应和适应性免疫反应两个方面对戊型肝炎重症化及慢性化的免疫学机制进行综述,以期为该类患者的早期预测、临床防治和疾病管理提供理论依据和新思路。     

戊型肝炎病毒IgA抗体检测及临床意义

<正>戊型肝炎病毒(HEV)感染后,机体的特异性抗体呈现各自的免疫应答规律。文献报道HEV急性感染后,患者血中抗HEV-IgG持续时间较长,不能区分是否急性、既往感染;也有一些患者不产生IgM抗体,造成戊型肝炎病人的漏诊和误诊。作为早期抗体的IgA,其意义如何尚不清楚。本研究通过建立抗HEV-IgA检测方法,探讨其出现的动态变化和临床意义。     

丙型肝炎病毒H株包膜蛋白在昆虫细胞中的表达及意义

OBJECTIVE: To acquire stable expression of envelope proteins of hepatitis C virus in insect host cells and use the expressed envelope proteins for detecting the serums of patients with hepatitis C. METHODS: The envelope gene of HCV H strain was amplified by PCR and inserted in baculovirus vector BacPAK8, and then recombined with linear BacPAK6 DNA in insect cells. The recombinant baculoviruses were selected by the plaque assay. The insect cells were infected by the recombinant baculoviruses that contained the target gene produced E1, E2 proteins, which were characterized with the immunoblot assay and the immunofluorescence and were used to determine 35 serum samples of patients with hepatitis C. RESULTS: The expressed E1, E2 proteins showed that the relative molecular mass of E1 is about 21 x 10(3) and 33 x 10(3), and that of E2 is about 60 x 10(3). Detection of immunofluorescence indicated that E1, E2 proteins are localized in the cytoplasm of the infected cells. Four of the 35 serums responded to expressed E1; one of them was found to recognize E2 protein. Three of 9 serums which were HCV RNA positive by PCR testing got united to E1, E2. CONCLUSION: The HCV envelope protein can be expressed stably in the insect cells. Expressed E proteins could be used in the serologic analysis of the patients' serums.     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的:利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法:用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果:重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/ml,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论:利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

丙型肝炎病毒外膜E_2／NS_1区基因在大肠杆菌中的表达

将丙型肝炎病毒外膜Ｅ_２／ＮＳ_１基因亚克隆至融合型表达载体，在大肠杆菌中进行表达，表达的重组蛋白经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ鉴定具有丙型肝炎病毒外膜蛋白的抗原性，能与丙型肝炎病毒感染血清发生特异性结合反应，为研究外膜蛋白抗体的意义创造了条件。     

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.     

丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用

目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）Ｅ２ 包膜蛋白,并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测ＨＣＶＲＮＡ 阳性血清中Ｅ２ 抗体,研究其检测Ｅ２ 抗体的敏感性和特异性。方法：将ＨＣＶＥ２ 蛋白基因克隆到原核表达载体中,并转化大肠杆菌。用ＩＰＴＧ 诱导细菌表达Ｅ２ 蛋白,经离子交换层析纯化蛋白。用纯化的包膜蛋白包被微孔板,经ＥＬＩＳＡ方法检测ＨＣＶＲＮＡ阳性血清中的Ｅ２ 抗体。结果：在大肠杆菌表达了相对分子质量为４５ ０００ 的可溶性Ｅ２ 蛋白,占细菌总蛋白量的２１％ ,纯化后,蛋白纯度为８５％ 。用其检测ＨＣＶ 患者血清１７１ 例,Ｅ２ 抗体的检出率为６３％ 。在Ｅ２ 抗体阳性的血清中,部分为抗ＨＣＶ 阴性。结论：Ｅ２ 蛋白的表达及初步纯化的成功,可能用于临床检测。各基因型ＨＣＶＥ２ 包膜蛋白的抗体之间有交叉反应,在目前的抗ＨＣＶ 诊断试剂中加入可溶性、非融合Ｅ２ 包膜蛋白,可以改善抗ＨＣＶ 诊断试剂的特异性和敏感性。     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

神经营养素—4（NT—4）在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势,表达出具有生物学活性的神经营养系－4（hNT－4）蛋白。方法 通过PCR方法获得hNT－4成熟肽的基因。将其连接到昆虫表达载体pAcgp67B上,在昆虫细胞Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得hNT－4蛋白的表达产物,SDS－PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为15000。经Western-blot验证,表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人NT－4抗体发生特异性免疫反应的条带。经PC12细胞测定。表达上清中的rNT－4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT－4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究hNT－4的功能及其在临床中的应用提供了条件。     

抗戊型肝炎病毒开放读码框架及IgM和IgG抗体的消长规律及临床意义

目的研究戊型肝炎病人抗戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）开放读码框架２（ＯＲＦ２）和３（ＯＲＦ３）及ＩｇＭ和ＩｇＧ抗体的消长规律及其临床意义。方法采用ＨＥＶＯＲＦ２、ＯＲＦ３合成多肽单独和联合酶联免疫法,动态检测５２例病人血清抗ＨＥＶ。结果起病初期ＯＲＦ２抗体和ＯＲＦ３抗体水平均较高,随病程的延长两者均下降,ＯＲＦ３抗体尤为明显。联合检测ＯＲＦ２和ＯＲＦ３抗体可提高试验的敏感性。血清抗ＨＥＶＩｇＭ和抗ＨＥＶＩｇＧ阳性率于起病半个月内分别为７１．１％（３２／４５）和９７．８％（４４／４５）,随病程的延长抗ＨＥＶＩｇＭ较早阴转。结论ＨＥＶ抗体诊断试剂盒至少应含有ＯＲＦ２和ＯＲＦ３两种抗原。抗ＨＥＶＩｇＭ的特异性好而抗ＨＥＶＩｇＧ的灵敏度高。     

人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶C端片段在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备

目的：为了表达人ＡＣＴＣ端片段并制血表达载体其抗体。方法：将编码人ＡＣＡＴ羧基端包含跨膜（４６３－５５０氨基酸残基）的ｃＤＮＡ片断克隆至不同的大肠杆菌表达载体中,构建了毓表达质粒,并在多种大肠杆菌中进行了表达研究。结果：在详细探索到达条件的基础上,经温敏诱导,成功地在大肠杆菌ＡＲ６８中表达了Ｎ端融合ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＢＣ ｄｏｍａｉｎ的人ＡＣＡＴ羧基末端包含第二个跨膜区的片段,表达量约２０ｍｇ／Ｌ