慢病毒介导兔脑红蛋白基因感染骨髓间充质干细胞的实验研究

[目的]构建携带兔脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)基因的重组慢病毒,感染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs),建立稳定表达兔Ngb的BMSCs/Ngb细胞。[方法]构建携带Ngb基因的重组慢病毒载体,在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293 T细胞,Real-time PCR检测慢病毒滴度;以Ngb重组慢病毒感染BMSCs,通过荧光表达法判定感染复数(multiplicities of infection,MOI),实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)判定感染后的BMSCs中Ngb的表达情况。[结果]构建Ngb重组慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能够转染293 T细胞并表达,滴度为2×108 TU/ml,Ngb重组慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为100,且Ngb重组慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Ngb mRNA和蛋白。[结论]成功构建Ngb重组慢病毒,并将Ngb基因稳定感染至BMSCs中,实现Ngb的持续稳定高水平表...     

兔脊髓损伤后脑红蛋白的表达变化及其意义

[目的]探讨兔脊髓损伤(SCI)后脑红蛋白(Ngb)的表达变化规律及其意义。[方法]健康新西兰大白兔48只,随机分为8组,采用球囊压迫SCI模型,应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白质印迹(West-ern blot)检测伤段脊髓组织Ngb mRNA和蛋白的表达变化情况。[结果]Ngb在正常兔脊髓组织内表达,SCI后6 hNgb表达逐渐增强,伤后24 h达到高峰;随后逐渐下降但维持较高水平至损伤后72 h,伤后7 d Ngb表达接近正常水平。[结论]Ngb存在于正常的脊髓组织内,Ngb的高表达与SCI的时间密切相关,SCI后Ngb表达上调是机体内源性保护机制之一。     

慢病毒介导RNA干扰Nogo受体基因治疗脊髓损伤的实验研究

目的 观察慢病毒介导RNA干扰大鼠神经元Nogo受体(NgR)基因表达对脊髓损伤的修复作用.方法 将前期实验中构建好的针对NgR的特异性小干扰RNA系列siNgR199慢病毒重组体,按感染复数=3体外转染已培养好的大鼠皮层神经元细胞.荧光电镜观察慢病毒重组体的转染效率,采用实时荧光定量PCR检测NgR基因沉默效率,验证慢病毒重组体的有效性.建立大鼠重度脊髓损伤模型,大鼠分组后分别于大脑皮层运动区注射生理盐水、慢病毒重组体,采用BBB评分法观测大鼠后肢运动恢复情况,采用神经示踪法观察脊髓损伤区神经纤维生长情况.结果 慢病毒重组体体外转染神经元细胞的效率＞99%,NgR基因沉默效率为61%.大鼠模型给药后8周,慢病毒重组体组大鼠脊髓损伤区可观察到神经纤维生长通过,而生理盐水组大鼠脊髓损伤区未见神经纤维生长通过,BBB评分结果提示慢病毒重组体组大鼠后肢运动功能恢复优于生理盐水组(P＜0.01).结论 慢病毒siNgR199重组体能够促进脊髓损伤区神经纤维的生长,在一定程度上促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复.     

体外转基因成肌细胞移植对大鼠损伤脊髓细胞凋亡的影响

目的：探讨大鼠脊髓损伤后胚胎脊髓和腺病毒介导的脑源性神经生长因子（AxCA-BDNF)体外转基因成肌细胞移植对大鼠脊髓细胞凋亡的影响。方法：将动物分为：大鼠脊髓半切洞损伤明胶海绵填充组（A组）,大鼠脊髓半切洞损伤应用胚胎脊髓移植组（B组）,脊髓半切洞损伤损伤AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组（C组）大鼠脊髓半切洞损伤后应用胚胎脊髓和AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组（D组）。手术后1、3、7、14、28d应用行为学和电生理检查观察大鼠功能恢复情况,对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测（TUNEL）以及Bcl-2蛋白表达的测定（免疫组化法）。采用计算机图像分析技术,进行定量分析。结果：A、B、C、D四组中均发现凋亡细胞及Bcl-2蛋白阳性表达细胞,图像分析发现,各组凋亡细胞核为A＞B＞C＞D;Bcl-2免疫反应阳性细胞表达顺序为D＞C＞B＞A,Bcl-2免疫反应阳性细胞的表达与大鼠后肢功能恢复有同样的变化趋势。结论：大鼠胚胎脊髓和体外转基因成肌细胞移植能抑制脊髓损伤后的细胞凋亡。     

脑源性神经生长因子转基因细胞移植和大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的：探讨大鼠脊髓损伤后腺病毒介导的脑源性神经生长因子（AxCA-BDNF）体外转基因成肌细胞移植和静脉内注射大剂量甲基强的松龙（MP）对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响。方法：120只Wistar大鼠分为：脊髓挫伤组（A组），脊髓挫伤后AxCA-BDNF基因转染的成肌细胞移植组（B组），脊髓挫伤后静脉内注射大剂量MP治疗组（C组），脊髓挫伤后同时应用AxCA-BDNF和MP组（D组）。手术后1、3、7、14、28d用行为学和电生理检查观察大鼠功能恢复情况，并用计算机图像分析技术对脊髓损伤区细胞凋亡（TUNEL法）和Bcl-2蛋白表达（免疫组化法）进行定量分析。结果：四组中均发现凋亡细胞及Bcl-2蛋白阳性表达细胞．图像分析发现四组凋亡细胞核数为A组〉B组〉C组〉D组；Bcl-2免疫反应阳性细胞表达顺序为D组〉C组〉B组〉A组。大鼠后肢功能恢复和电生理检查也有类似的变化趋势。结论：体外转基因成肌细胞移植和大剂量MP都能抑制大鼠脊髓损伤后的细胞凋亡，促进大鼠后肢功能恢复，两者联合应用具有协同作用。     

神经妥乐平对兔脊髓放射性损伤的治疗作用

目的:观察神经妥乐平(NTP)对兔放射性脊髓损伤的治疗效果。方法:新西兰大白兔60只,体重2.5~3kg,随机分成实验组与对照组,每组30只,各组再随机分成5小组接受不同剂量的放射性照射,每组6只,照射剂量分别为20Gy,25Gy,35Gy,40Gy,45Gy。照射部位为T4水平,所有兔在照射前以及照射后均做MRI检查。兔出现临床表现后实验组每天肌肉注射NTP3.6NU一次,共4周;对照组每天肌肉注射生理盐水3ml一次,共4周。观察两组治疗前后兔症状变化和脊髓MRI的表现及病理改变。结果:照射后平均16周时,动物受照射脊髓节段MRI出现明显异常信号,而临床症状的出现约在照射后平均18周。在治疗结束后3周,实验组各项指标(瘫痪、尿潴留和针刺反应)与对照组相比均明显改善(P<0.05);MRI图像上实验组治疗后病灶面积比治疗前明显缩小;神经元肿胀明显减轻,髓鞘结构趋于正常。而对照组变化不明显。结论:神经妥乐平对放射性脊髓损伤有一定的治疗作用。     

长期培养人胚神经干细胞对兔脊髓损伤的修复作用

[目的]观察长期培养人胚神经干细胞（hNSCs）的体外生长特性与转染EGFP基因后移植治疗兔脊髓横切损伤模型在体内的生物学活性及对神经结构修复和功能恢复的影响。[方法]体外分离、培养并鉴定hNSCs，用逆转录病毒介导的增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）进行转染；制备兔T9全横断脊髓损伤模型；观察hNSCs移植对脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的影响。[结果]从胎龄10～20周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞，该细胞具有连续克隆传代能力，诱导分化后表达分化细胞的特异抗原。本实验室已成功连续培养10个月（17代），转染EGFP基因后，仍保持未分化状态，能够自我更新形成新的神经球；移植入兔SCI模型后，hNSCs能在体内存活、迁移、分化并增殖。与对照组相比，hNSCs移植组明显促进了脊髓神经的再生、结构的修复和下肢运动功能的恢复。[结论]hNSCs移植促进了脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复，是治疗急性脊髓损伤的一种有效方法。     

转基因治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(SCI)一直是困扰医学界的一大难题。近年来神经干细胞(NSCs)的培养成功为破解这一难题带来了希望。然而,NSCs移植后在中枢神经系统只有很少一部分能存活和分化为神经元[1]。而且分化为神经元的细胞通常不能形成轴突而成为有功能的神经元[2]。自Blaese等1990年首次对腺苷脱胺酶(ADA)缺乏严重联合免疫缺陷症患者成功地进行基因治疗以来,基因治疗已成为当前生物医学中进展最快的学科之一,为解决许多医学难题带来了曙光。近年来这一技术也应用于SCI修复的研究。其结果令人振奋。现就SCI后转基因治疗研究现状作一综述。1载体及受…     

抑肽酶预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤的影响

目的:观察抑肽酶预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤的影响,为临床应用抑肽酶治疗脊髓缺血再灌注损伤提供实验依据.方法:6月龄国产大耳白兔39只,随机分为A组(15只)、B组(15只)和C组(9只).A、B组动物于左肾动脉下用主动脉环扎器环扎腹主动脉,缺血60min后开放,再灌注24h.A组于缺血前10min静脉注射抑肽酶3×107IU/kg,继而用Graseby 3500微量泵持续注入抑肽酶1×107IU/(kg·h)至处死动物时;B组用生理盐水代替A组的抑肽酶,其余同A组;C组只暴露不夹闭腹主动脉,不给药.A、B组缺血前,缺血5、10、20、60min及再灌注后8h、24h,C组相应时间点,测定各组皮层体感诱发电位(CSEP).A、B组缺血前,缺血再灌注后8h、24h,C组相应时间点,处死动物,取L2～L4脊髓行一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)测定,取L3～L4脊髓灰质切片进行组织学检查,观察神经无形态变化.结果:A、B两组缺血5min时CSEP的P1波和N1波潜伏期较缺血前延长、波幅降低(P<0.05),缺血20min时两波潜伏期及波幅消失,缺血冉灌注后8h两波潜伏期及波幅有所恢复,但较缺血前及缺血后5min、10min时明显延长和降低(P<0.01),缺血再灌注后24h两波潜伏期及波幅较前面各时间点延长和降低(P<0.01);缺血再灌注后8h、24h,A组较B组P1波和N1波潜伏期短、波峰高(P<0.05),而C组较A、B组潜伏期短、波峰高(P<0.01).A、B两组NO、总NOS及诱导型NOS(iNOS)在缺血再灌注后8h明显升高,24h时更高(P<0.05),在缺血再灌注后8h、24h时A组的NO、总NOS及iNOS较B组低(P<0.01).各时间点C组P1波和N1波潜伏期及波幅不变,NO、总NOS及iNOS量均不变(P>0.05).A、B组脊髓缺血再灌注后神经元均有损伤,但在再灌注后8h、24h时A组神经元损伤程度均较B组为轻:C组神经元正常.结论:抑肽酶预处理可以改善脊髓缺血再灌注早期的CSEP,减少NO含量,从而减少缺血再灌注损伤.     

脑红蛋白与脑红蛋白介导的神经元保护作用

脑红蛋白是新近发现的球蛋白超家族中的一员,主要表达在脊椎动物的大脑和视网膜中.脑红蛋白在生物体中的作用至今尚不明确,但它与氧的亲和性及在中枢神经元的高度表达提示其在神经元缺血缺氧反应中是重要的神经元保护因子.脑红蛋白可以使氧气更容易弥散入线粒体;与钠钾ATP酶结合并调节其活性;清除活性氧和一氧化氮;在缺氧状态下减少细胞间信号转导;诱导一些重要的神经营养因子表达,如内皮型一氧化氮合酶.     

稿约

1《中国脊柱脊髓杂志》是卫生部主管、中国康复医学会和中日友好医院主办的学术期刊;为国家科技部中国科技信息中心的科技论文统计源期刊,《中文核心期刊要目》入编期刊;主要任务是报道国内外脊柱脊髓领域的最新学术进展,为临床医疗、康复及基础研究工作者提供学术交流平台;1991年创刊,2003年改为月刊,2012年内文增至96页,国内外公开发行;读者对象为从事脊柱外科、骨科、神经科、泌尿科、肿瘤科、放射科、康复科及基础研究等相关学科的专业技术人员。     

大鼠脊髓损伤后一氧化氮合酶基因表达的变化

目的　探讨大鼠脊髓损伤后3种类型一氧化氮合酶（NOS）mRNA表达的变化规律。方法　成年SD大鼠36只,随机分为种类6组,每组6只大鼠。建立大鼠脊髓压迫伤模型,以逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法测定伤段脊髓组织神经型（nNOS）、诱导型（iNOS）及内皮型（eNOS）一氧化氮合酶的mRNA表达情况。结果　脊髓压迫伤后nNOSmRNA及NOSRNA表达增强,伤后6h达到高峰0.633±0.012、1.236±0.207;iNOSmRNA表达亦增高,但在伤后24h才达到高峰1.043±0.049。结论　脊髓损伤后NOSmRNA的表达增强,但不同类型的NOSmRNA变化规律不同,增强或抑制不同NOSmRNA的表达可能减轻脊髓继发性损伤。     

Regulatory effect of neuroglobin in the recovery of spinal cord injury

Objective: The present study was aimed to investigate the therapeutic potential of neuroglobin in the recovery of spinal cord injury.

Methods: The male albino Wistar strain rats were used as an experimental model, and adeno associated virus (AAV) was administered in the T12 section of spinal cord ten days prior to the injury. Basso Beattie Bresnahan (BBB) locomotor rating scale was used to determine the recovery of the hind limb during four weeks post-operation. Malondialdehyde (MDA), catalase and superoxide dismutase (SOD) were determined in the spinal cord tissues. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay was carried out to determine the presence of apoptotic cells. Immunofluorescence analysis was carried out to determine the neuroglobin expression. Western blot analysis was carried out to determine the protein expressions of caspase-3, cytochrome c, bax and bcl-2 in the spinal cord tissues.

Results: Experimental results showed that rats were recovered from the spinal cord injury due to increased neuroglobin expression. Lipid peroxidation was reduced, whereas catalase and SOD activity were increased in the spinal cord tissues. Apoptosis and lesions were significantly reduced in the spinal cord tissues. Caspase-3, cytochrome c and bax levels were significantly reduced, whereas bcl-2 expression was reduced in the spinal cord tissues.

Conclusion: Taking all these data together, it is suggested that the increased neuroglobin expression could improve the locomotor function.     

Gene expression of inducible nitric oxide synthase in injured spinal cord tissue

ＮＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ ,ＺｈｕｊｉａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ,ＴｈｅＦｉｒｓｔＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ,Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ 5 10 2 82 ,Ｃｈｉｎａ (ＬｉｕＣＬ ,ＪｉｎＡＭ ,ＺｈｏｕＣＳａｎｄＣｈｅｎＢ)ＴｈｉｓｗｏｒｋｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ (Ｎｏ :3980 0 16 6 )ｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ (ＮＯ) ,ａｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅ ,ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ…     

周围神经不同移植方式修复治疗损伤脊髓的实验研究

目的：探讨自体肋间神经不同移植术式对治疗损伤脊髓疗效的影响。方法：采用SD大鼠，经T8、T9平面切除4mm长的半侧脊髓制成脊髓半切伤模型，用6～8条纤细的肋间神经节段按近端白质-远端灰质和近端白质-远端白质两种桥接术式填充缺损处，对照组用明胶海绵填充脊髓半切残腔。饲养4～6周，观察其后肢活动功能、斜板试验及运动功能，光镜下观察植入区的组纵结构。结果：两种术式受试鼠的后肢功能部分恢复，镜下见移植组织存活、充填于缺损处，部分与脊髓组织融合。组织、功能的恢复均明显优于对照组，但两种术式间无明显差别。结论：自体肋间神经的植入对损伤脊髓有一定的疗效，但不同的桥接术式之间无明显差别。     

胶质细胞源性神经营养因子体内转基因对皮质脊髓束再生的影响

目的通过非病毒载体阳离子脂质体介导,探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因体内转染对成年大鼠脊髓损伤后皮质脊髓束再生的影响.方法采用NystrOm法制备大鼠胸髓后路压迫损伤模型,压迫重量为50 g,时间为5 min,造成大鼠胸段脊髓急性重度损伤.用微量注射器将阳离子脂质体DC-Chol 6μl和重组质粒pEGFP-GDNF cDNA 2μg混合后注入大鼠损伤脊髓.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和荧光显微镜检测GDNF体内转基因后在局部的表达,通过辣根过氧化物酶(HRP)顺行追踪技术和神经微丝(NF)免疫组织化学活性的变化来评价GDNF基因体内转染对大鼠皮质脊髓束再生的影响.结果 GDNF基因体内转染1周后显示在基因注射局部有转录和蛋白水平表达.脊髓损伤后4周在损伤区可见较多的皮质脊髓束再生,损伤区NF阳性轴突数(524.33±80.55)/低倍视野较对照组(309.84±56.65)/低倍视野明显增多(P＜0.01).结论阳离子脂质体介导GDNF体内转基因能促进近端皮质脊髓束再生和神经骨架蛋白的修复.     

脊髓诱发电位的实验研究

为探索脊髓诱发电位（Spinalcordevokednotentials，SCEP）在术中监测的安全范围，将刺激和记录线电极分别置于24只大耳白兔T7～T8、L4～L5间隙硬障外，记录正常电位后对脊髓施加纵向牵张力，至实验要求的波幅。波幅下降至正常的80％组脊髓组织结构轻微改变，脊髓功能正常；下降至50％组及＜50％组则出现不可逆损害。结果表明，SCEP波形稳定，其波幅下降至80％是脊髓损伤的危险信号，下降至50％或50％以下将产生不可逆的脊髓损伤。     

大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及相关基因表达的实验研究

目的观察大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡现象,检测脊髓损伤后凋亡相关基因的表达。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位(CSEP)监测P1N1波幅下降至术前波幅70%后,分别于术后30min、6h、1、4、7、14、21d处死大鼠,取材(n=4)。应用流式细胞仪、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记(TUNEL)技术观察脊髓细胞凋亡情况,用免疫组化检测p53、bax和bcl2的表达。结果流式细胞仪及TUNEL法检测显示,损伤组术后6h凋亡细胞开始增多,术后7d细胞凋亡率达高峰,随后开始回落,持续21d,与空白对照组及椎板切除组比较,差异有显著性意义(P<005,001)。TUNEL法染色显示,白质中出现大量胶质细胞凋亡。免疫组化染色显示损伤组术后6h开始,p53、bax和bcl2阳性表达开始增多,p53阳性细胞数术后4d达高峰,bax和bcl2术后7d达高峰,损伤组各时相点的阳性表达与空白对照组与椎板切除组比较差异有显著性意义(P<005,001)。结论牵张性脊髓损伤后存在细胞凋亡现象,从形态上看包括神经元和胶质细胞凋亡,细胞凋亡是牵张性脊髓损伤继发损害中细胞死亡的一种重要形式,也是继发损伤期的重要病理变化。凋亡相关基因p53、bax大量表达,可能在脊髓细胞凋亡过程中起重要作用。