人类胚胎干细胞向造血干细胞分化的微环境研究

目的 探讨胎肝基质细胞和骨髓基质细胞在诱导胚胎干细胞向血液血管干细胞分化中的作用,分析基因表达差异.方法 通过将分化4 d的EBs分别接种到以下两组中:(1)胎肝基质细胞层+细胞因子;(2)骨髓基质细胞层+细胞因子:诱导结束后,流式细胞术检测各组中血液血管干细胞标志KDR阳性细胞数以及造血干细胞标志CD34阳性细胞数,计数细胞分化过程中形成的造血干细胞样的集落数,比较诱导分化效果;收集胎肝基质细胞和胚胎骨髓基质细胞,采用cDNA芯片分析基因表达差异.结果 流式细胞术检测发现,两组中KDR+细胞的比例为分别为:(1.06±0.20)%、(8.8±1.49)%;CD34+细胞比例为分别为:(1.25±0.16)%、(9.19±2.10)%;血岛样集落数量分别为0.9±0.36、10.6±0.63;上述结果均以骨髓基质细胞联合细胞因子诱导方法效率最高.基因芯片(hBMSCs/hFLSCs)中总共有240条基因在骨髓基质细胞中高表达,397条基因的在肝脏基质细胞中高表达.对细胞因子、细胞黏附分子以及细胞外基质蛋白的基凶加以分析,结果发现在hBMSCs高表达的相关的21条基因,推测可能与造血分化相关.结论 人类胚胎十细胞向造血干细胞分化过程中,涉及到细胞与细胞之间的相互作用,相关的细胞因子、细胞黏附分子、细胞外基质蛋白等可能起重要的作用.     

两种条件培养基促进鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞

目的:从鼠胚胎干细胞获得具有造血重建功能的造血干细胞.方法:将ES-D3细胞形成4天拟胚体(4dEBs),再用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)和/或胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)诱导4dEBs生成造血干细胞.实验为mBMEC-CM FLSC-CM组、mBMEC-CM组、FLSC-CM组,对照组.检测诱导生成的细胞造血干细胞特异抗原表达、造血相关基因表达、造血集落的形成以及造血重建能力.结果:从诱导ES-D3细胞生成造血干/祖细胞的数量和生成的集落总数看,mBMEC-CM FLSC-CM组诱导效率显著高于其他3组.mBMEC-CM FLSC-CM组诱导生成的细胞能重建照射鼠的造血系统.结论:骨髓内皮细胞条件培养液联合胎肝基质细胞条件培养液可促进鼠胚胎干细胞分化为具有造血重建能力的造血干细胞.     

从人胚胎干细胞获得造血集落形成细胞

人类胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)是未分化的多潜能细胞,能在体外培养基中无限增殖。本文用体外研究证实当与小鼠骨髓基质细胞系S17或卵黄囊内皮细胞系C166共培养时,人ES细胞能分化为造血前体细胞。这种造血分化需要胎牛血清,而不需其他外源的细胞因子。ES细胞来源的造血前体细胞表达细胞表面抗     

骨髓基质细胞对造血调控的研究进展

骨髓基质细胞是造血诱导微环境的重要组成成分,基质细胞通过与造血细胞密切接触以及分泌多种细胞因子调节造血细胞的增殖、分化和发育。本文就BMSCs对造血调控的研究进展作一综述。     

骨髓基质细胞与造血调控研究进展

机体的正常造血依赖造血细胞和支持造血细胞生长发育的骨髓微环境的相互作用。骨髓基质细胞（BMSC）来源于骨髓间充质干细胞,在造血干／祖细胞（HSC／HPC）增殖、分化、成熟、进人血窦,并最终进人血液循环中发挥着重要作用。本文就近年来BMSC在造血调控中的作用及其机制研究进展综述如下。     

人类胚胎干细胞向造血细胞的自发分化

目的 研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据.方法 将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、Bmil、Scl、gata2等的表达、流式细胞术检测6、8、10、12 d造血干细胞标志CD34表达,并通过造血集落培养方法检测这些时间点造血集落形成能力,最后将拟胚体制备石蜡切片,免疫细胞化学检测10、12、15、18 dCD45阳性阳性细胞数.结果 造血干细胞早期基因KDR、Bmil在hESCs中有表达,同时该基因随着拟胚体培养时间的延长,在第4～6天开始上调表达;造血干细胞标志性基因Scl,gata2在6～8 d开始表达,并且维持高表达到12 d.流式细胞术检测不同时间点hEBs中CD34阳性细胞数,发现其随时间的延长有增多的趋势,6、8、10、12 d分别为(1.4±0.4)%、(3.4±1.3)%、(5.5±2.2)%、(5.1%±1.7)%;6、8、10、12 d的拟胚体细胞进行集落培养检测形成的集落数在每105个拟胚体细胞中分别为0、7±2、37±11、89±29,P<0.01;集落细胞表达CD45,瑞士吉姆撒染色,可以检测到分叶核粒细胞;免疫细胞化学法对10、12、15、18 d拟胚体进行切片染色,发现在这4 d中可以明显观察到CD45阳性细胞的出现,并随时间的延长而数量增多,分别为:0、40.5±15.09、178.6±55.89、253.0±52.04,P<0.05.结论 在自发向造血细胞分化的过程中经历了 3个阶段:hESCs向胚层特异性细胞分化(前6～8 d);造血干祖细胞扩增期(第8～12天);成熟血细胞大量出现期(15 d以后).     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

胚胎干细胞来源造血细胞的细胞表型和功能分析

【目的】 分析经卵黄囊(YS)、胎肝(FL)和骨髓来源(BM)的基质细胞条件培养液(SCCM)诱导产生的胚胎干细胞(ES)来源造血细胞的细胞表型与功能差异。【方法】 制备YS-SCCM、 FL-SCCM及BM-SCCM,将3种基质细胞条件培养液分别加入ESE 14.1细胞分化培养体系培养7 d,通过对分化ESE14.1细胞造血发育表面标志FLK-1、Integrin-α4(整联蛋白-α4、Sca-1(干细胞抗原-1)、CD34的检测、体外高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)分析及体内脾集落形成单位(CFU-S)检测,评价3种基质细胞条件培养液对ESE14.1细胞体外造血发育的调控作用。【结果】 经FL-SCCM诱导的EB细胞Flk-1、Integrinα4+ 和Sca-1+ 细胞均高于YS-SCCM和BMSC-CM诱导组,分别为3.03%、2.9%和13.74%;经BMSC-CM诱导产生的CD34+ 细胞比例最高,为1.07% 。经FLSC-CM或BMSC-CM诱导产生的造血细胞其HPP-CFC产率明显高于对照组,分别为7.4个/105细胞(P < 0.01)和5.8个/105细胞(P < 0.05);经FLSC-CM或BMSC-CM诱导产生的造血细胞其CFU-S产率亦明显高于对照组,分别为8.5个/5 × 105细胞和6.75个/5 × 105细胞(P < 0.001)。【结论】 YS-SCCM、 FL-SCCM及BM-SCCM均可诱导ESE14.1向造血细胞分化,FL-SCCM和BM-SCCM造血定向诱导效率较高,所产生的细胞具备造血细胞的正常功能,FL-SCCM诱导产生的造血细胞原始程度高于BM-SCCM诱导产生的造血细胞。     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的：探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法：贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离，扩增培养，待细胞融合，传代培养，检测细胞的生长曲线，表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果：克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上，表达CD13，CD29，CD59，不表达CD11，CD14，CD31、CD34，CD45，CD80，CD86，CD117，HLA－DR；传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论：该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞，并保持分化潜能，克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

用胚胎干细胞诱导的造血干/祖细胞重建小鼠造血功能研究

目的 胚胎干细胞体外诱导分化出现CD34^ 造血干/祖细胞，然后将其注射入致死量照射小鼠体内，以研究其重建造血功能。方法 胚胎干细胞自由分化形成胚胎体后，加入造血刺激因子混合液以诱导产生CD34^ 造血干／祖细胞，将这些造血干／祖细胞注射入经致死剂量照射的小鼠，观察小鼠存活率的改变，并取存活2个月的小鼠骨髓和脾脏，PCR检测嵌合体形成。结果 体外分化第13日CD34^ 造血干／祖细胞比例可高达17．36％，将这些细胞注射入致死量照射小鼠后，可提高存活率达86．67％，存活小鼠的骨髓和脾脏均检测到供体来源的细胞。结论 胚胎干细胞体外分化获得CD34^ 造血干/祖细胞，且后者具有其相应的正常生物学功能。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

人骨髓造血基质细胞对HL－60白血病细胞株促分化作用的研究

以骨髓造血基质细胞体外培养体系为基础开展对ＨＬ－６０白血病细胞促分化作用的研究，Ｍｋ探讨正常人骨髓造血基质细胞对异常实质细胞的调控作用。结果表明，正常人骨髓这血基质细胞对人急性早幼粒细胞白血病ＨＬ－６０细胞具有逆转作用，表现在促分化和抑制增殖两方面。其机理主要以直接接触而发挥调控作用，分泌因子作用较小。     

胎儿骨髓来源的Flk1+CD34-细胞的血液血管干细胞特性

目的研究骨髓基质中是否具有血液血管干细胞的特征。方法分离并培养人胎儿骨髓基质细胞(hfMSCs),FACS检测细胞的免疫表型。将此细胞接种在基底膜胶中,由血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导,免疫组化和透射电镜检测血管和造血的分化形成。结果此细胞群体的典型特征是CD34阴性的成纤维样细胞99%表达Flk1(即血管内皮细胞生长因子受体2),并能形成血管样结构,而在管样结构形成的过程中诱导出CD34阳性的圆形细胞。结论Flk1 CD34-的hfMSC能向血管内皮细胞和造血细胞分化,提示其具有血液血管干细胞的特征表型。     

造血基质干细胞的研究——Ⅳ.骨髓造血重建的细胞来源

通过对原位及异位移植股骨骨髓造血重建过程的研究,我们发现了移植物的骨内膜或骨皮质及骨小梁内细胞在诱导造血恢复上起着重要作用;骨皮质內含有造血微环境中的全部因素。本文观察了移植的骨皮质内造血重建的动态变化过程。即首先是基质细胞增殖、分化,包括骨小梁及血窦的形成,然后出现造血细胞增生。初步认为,作为诱导造血重建的环境因素的主要成分基质细胞来源于骨皮质。推断在正常机体中,骨髓内分化的基质细胞执行着支持实质细胞正常功能的作用,处于未分化的Go期的母细胞,则作为后备力量储存在骨皮质或骨小梁内(骨内膜细胞为中间阶段)。在整体调节下,二者保持着动态平衡状态。     

基质细胞对小鼠骨髓单个核细胞体外扩增的促进作用

目的 阐明基质细胞在造血细胞体外扩增中的作用。方法 采用骨髓基质细胞培养、骨髓单个核细胞（BMMNC）体外液体培养和各种造血相细胞集落培养技术,进行基质细胞支持条件下骨髓单个核细胞体外扩增的研究,并与单纯细胞因子支持下的细胞扩增进行比较。结果 在照射后细胞层存在的条件下,同时含有细胞因子组合的培养体系,对细胞总数和集落形成细胞数的扩增作用明显高于其它各组。结论 基质细胞对细胞因子作用下的造血细胞体外扩增有明显的促进作用。     

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液支持卵黄囊造血干/祖细胞的体外生长

目的;观察小鼠骨髓内皮细胞条件培养液（mBMEC-CM)对卵黄囊造血干／祖细胞体外生长的支持作用。方法：取妊娠第8．5天的卵黄囊,经消化后获得卵黄囊细胞,取卵黄囊非贴壁细胞加入含10％mBMEC-CM和10％FBS的DMEM中培养24h后,收集细胞做半固体培养。结果：mBMEC-CM在液体培养体系中能扩增卵黄囊造血干／祖细胞使粒－巨噬系集落形成单位（granulocyte-macrophage colony forming unit,CFU-GM)和高增殖潜能集落形成细胞（high proliferative potential-colony forming cell,HPP-CFC)的产率增加,经24h液体培养后的CFU－GM和HPP－CFC的数目分别为培养0h对照组的119．5％和130．8％（P＜0．05）;mBMEC-CM联合flt3配基（flt3 ligand,FL)和血小板生成率（,TPO)后,其扩增CFU－GM和HPP－CFC的能力明显增加,mBMEC-CM联合FL和TPO经24h液体培养后的CFU－GM和HPP－CFC的数目分别为培养0h对照组的132．0％和176．9％（P＜0．01）。结论：mBMEC-CM对卵黄囊造血干／祖细胞的维持和扩增有促进作用,mBMEC-CM联合FL和TPO对卵黄囊造血干/祖细胞的扩增作用明显增强。     

人脐血CD34+细胞体外Dexter基质细胞培养后细胞表面分子变化的动态观察

目的动态观察人脐血CD34 细胞Dexter基质细胞培养后细胞表面分子的变化情况.方法应用MACS磁珠分离系统分离脐带血CD34 细胞,按照Dexter法行脐血基质细胞培养,观察不同时间基质细胞的生长状态及细胞表面分子的变化情况.结果脐血基质细胞在生长情况、细胞形态与骨髓基质细胞有不同之处,但其细胞表面分子的表达特点却与骨髓基质细胞有类似之处.结论脐血CD34 细胞在生长因子的辅助下能促进基质细胞集落的形成,有望成为新的基质细胞来源.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为雪旺样细胞的方法

目的 :建立人骨髓间充质干细胞体外向雪旺样细胞定向诱导分化的方法。方法 :取健康人骨髓血标本 ,利用percoll(密度为 1.0 73 g·ml-1)分离骨髓单个核细胞 ,在DMEM LG + 10 % (体积分数 )FBS中培养 ,通过流式细胞术对培养细胞进行表型测定 ,对第 2、3、5、8代间充质干细胞进行定向诱导分化 ,用单抗S 10 0、神经胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillargacidicprotein ,GFAP) ,通过免疫组化方法对诱导的细胞进行鉴定。 结果 :经 percoll分离的间充质干细胞可传 16代 ,细胞数增加了大约 6× 10 7倍。流式细胞术结果显示 :percoll分离出来的未经培养的细胞 ,其CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 3 2 .4 7%± 3 .4 9% ,而培养后贴壁细胞中CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 94 .3 8%± 1.5 0 %。诱导后免疫组化染色结果显示 :由 β ME +bFGF预诱导、β ME +bFGF诱导的S 10 0阳性细胞最多 ,可达 90 %± 4 % ,GFAP阳性细胞为 2 1%± 5 %。结论 :人骨髓中间充质干细胞能定向诱导分化成雪旺样细胞。     

多种细胞因子对人骨髓基质细胞生长的影响

目的:探讨多种细胞因子对骨髓基质细胞生长的影响。方法:分离人骨髓单个核细胞,经培养获得骨髓基质细胞(BMSC),分别用不同的细胞因子组合作用于BMSC,MTT法测细胞增殖。采用Mini MACs系统阳性分离纯化脐血CD34+细胞,用BMSC结合不同的细胞因子组合培养14天后计数CFU-Mix集落数。结果r:hGM-CSF结合FL、SCFI﹑L-6对BMSC生长的增殖作用最明显;BMSC联合SCFI、L-3、FL、G-CSF、EPO对促进CD34+细胞体外集落形成的作用最明显。结论:细胞因子作用下的BMSC扩增有可能应用于造血损伤修复。