CXCR4靶向shRNA质粒载体的制备和体外鉴定

目的：设计并构建CXCR4靶向shRNA质粒载体,转染黑色素瘤细胞株,验证shRNA对黑色素瘤CXCR4基因的沉默效应。方法：设计合成CXCR4特异性shRNA,将其插入pSilencer质粒载体,并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株,抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达,应用Westernblot法检测CXCR4蛋白变化。结果：成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体及稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆。阳性克隆测序结果表明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞MV3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。结论：脂质体介导shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达,有望为转移性黑色素瘤的靶向基因治疗提供一条新途径。     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

短发卡RNA对人胃癌细胞STAT3基因的沉默作用

目的:探讨STAT3基因小发夹RNA（shRNA）表达质粒对胃癌MKN-45细胞STAT3基因的干扰作用。方法:根据STAT3 mRNA 编码序列，设计RNA干扰靶点，构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒（psiRNA-H1/STAT3），使用脂质体转染人胃癌细胞系（MKN-45细胞）。实验分为对照（A）组，psiRNA-H1转染（B）组和psiRNA-H1/STAT3转染（C）组。通过RT-PCR和Western Blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达的影响。结果:psiRNA-H1/STAT3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确，并经测序证实。将其成功转染MKN-45细胞后，该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。 结论:将成功构建的针对STAT3基因的shRNA表达载体转染MKN-45细胞，能有效抑制该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达，为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。     

survivin shRNA表达质粒对GBC-SD细胞生长的抑制及对化疗敏感性的影响

目的：构建针对survivin基因的shRNA真核表达载体，观察重组质粒pEGFP-survivin对胆囊癌细胞（GBC-SD）化疗敏感性的影响。
方法：设计、合成包含BbsI酶切位点的针对survivin的shRNA，与BbsI酶切后真核表达载体pEGFP-H1连接，将其定向克隆至H1启动子下，构建成重组载体pEGFP-survivin；采用脂质体法将pEGFP-H1和重组质粒导入GBC-SD细胞中；用G418对转染的细胞进行稳定筛选。用RT-PCR测各组细胞中survivin mRNA的表达；以合适浓度的顺铂（DDP）（3.0 μg/mL）作用相同时间后，用MTT法检测GBC-SD,GBC-SD/EGFP,GBC-SD/survivin 3种细胞存活率，TUNEL法观察细胞调亡。
结果：pEGFP-survivin成功构建。GBC-SD/survivin细胞中的survivin表达水平较其余2种细胞明显下降（分别下降74.7%和71.5%）；经DDP作用后，GBC-SD/survivin细胞存活率较其他2组明显降低，3种细胞均可见棕色凋亡细胞核。
结论：成功构建了针对survivin基因的shRNA真核表达载体，并获得稳定表达survivin shRNA的细胞株GBC-SD/survivin。survivin shRNA能明显降低GBC-SD细胞中survivin的表达，提高其对化疗药物的敏感性。

     

shRNA-CXCR4对人胃癌BGC823细胞增殖迁移的影响

目的 构建针对人CXCR4基因的shRNA干扰表达载体,观察CXCR4基因表达对人胃癌细胞株BGC823细胞增殖和迁移能力的影响.方法 根据人CXCR4序列设计并构建CXCR4基因的shRNA真核表达载体,以脂质体转染的方法将CXCR4干扰质粒转染至人胃癌细胞株BGC823,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞,应用流式细胞仪技术检测其细胞周期变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测CXCR4干扰对胃癌细胞增殖的影响,采用Trans-well小室法检测细胞体外迁移能力.结果 经测序证明CXCR4的shRNA基因已成功插入Psilencer4.1质粒中,构建的干扰质粒能够显著抑制CXCR4的表达,CXCR4 mRNA被抑制了(2.7±0.2)倍(P＜0.01).CXCR4基因的表达下调将胃癌细胞阻滞在G1期(由84.2％升至94.1％),MTT法检测CXCR4-shRNA干扰细胞增殖(P＜0.05),且穿过Trans -well小室膜的细胞数显著下降(P＜0.05).结论 干扰CXCR4的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力.     

靶向PGRMC1基因sh RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定靶向PGRMC1基因的短发夹RNA (shRNA)真核表达载体。方法根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA (shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经MspI和smoi双酶切线性化的质粒载体中。为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染方法将构建好的3个重组载体导入人卵巢癌细胞株SKOV3中,采用免疫组化法和RT-PCR法检测SKOV3细胞系转染前、后PGRMC1基因表达。结果经限制性酶MsqI酶切位点的酶和Smo I双重消化,PGRMC1成功建立到pcDNA3.1(-)的真核表达载体中。通过RT-PCR和Western印迹分析证实重组质粒已经成功传递到SKOV3细胞系。结论靶向PGRMC1基因shRNA真核表达载体的构建成功,为进一步研究PGRMC1基因在SKOV3细胞中的作用奠定了实验基础。     

Tiam1基因在胃癌细胞的表达及其生物学行为研究

目的构建Tiam1基因的真核表达载体,评估其转染人胃癌细胞株MKN45细胞后对胃癌细胞功能的影响。方法实时荧光定量PCR分析Tiam1基因在胃癌细胞中的表达;将外源性重组真核表达载体Tiam1基因(N1/Tiam1)转染到人胃癌细胞株MKN45内,经G418筛选并建立稳定表达Tiam1基因的胃癌MKN45细胞株,为:N1/Tiam1组,转染空质粒细胞(N1)组和未处理细胞(MKN45)组的两个对照组分别为:N1组和MKN45组;通过细胞增殖、划痕和侵袭实验分别观察上调Tiam1基因表达后的胃癌细胞功能。结果与N1组相比,N1/Tiam1组中Tiam1蛋白表达明显上调[(0.36±0.05)vs.(2.67±0.14),P<0.01];与对照组相比较,N1/Tiam1实验组较N1对照组细胞增殖数量明显增加(P=0.000);与转染N1空载体的MKN45细胞对照组相比,转染了N1/Tiam1高表达质粒的MKN45细胞促进胃癌细胞的迁移和侵袭。结论 Tiam1基因真核表达载体的筛选成功,为继续深入的研究Tiam1基因在胃癌中的功能奠定了基础。     

siRNA真核表达载体的构建及其对CXCR4基因的沉默效应

目的：构建趋化因子受体（CXCR4） 特异性siRNA ( small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对CXCR4基因的沉默作用。方法：采用基因克隆技术, 将合成的特异性CXCR4 RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pSUPER, 构建CXCR4 siRNA真核表达载体。以脂质体法将pSUPER空载体和2个(pSUPER/CXCR4 siRNA0和pSUPER/ CXCR4 siRNA1 )重组质粒分别导入具有高转移特性的MDA MB 231乳腺癌细胞系，检测各组乳腺癌细胞内CXCR4 mRNA及蛋白的表达情况。 结果：成功构建CXCR4 siRNA真核表达载体. 转染CXCR4 RNA干扰片段的乳腺癌细胞, 72 h后CXCR4 mRNA及蛋白表达下调,抑制作用明显。 结论：构建的RNA干扰真核表达载体能明显下调CXCR4 mRNA及蛋白的表达,为应用于乳腺癌的治疗研究提供了一定的实验基础。     

Fascin1基因表达对胃癌细胞系MKN45增殖与凋亡的影响

目的：探讨fascin1基因表达对胃癌细胞系MKN45增殖与凋亡的影响及其意义。方法：利用RNA interference(RNAi)技术稳定沉默fascin1基因的表达,Western blotting及RT-PCR检测干扰效率,用MTT比色法和平板克隆形成实验检测转染前后细胞体外增殖能力,用流式细胞术（FCM）及Hochest33258荧光染色法检测细胞凋亡的变化。结果：在稳定转染fascin1干扰质粒后,胃癌细胞系MKN45的fascin1表达明显下降;与未转染组和空白质粒转染组相比,fascin1干扰质粒转染组的增殖能力明显降低,但细胞凋亡变化不明显。结论：fascin1的表达与胃癌细胞系MKN45的增殖有关,而与凋亡无明显相关。     

反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正交和反义真核表达载体，研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性的影响。方法 采用RT－PCR方法从人胃癌细胞株MKN－45中扩增出人hTR部分cDNA序列，将该片段分别正向的反向插入PEF6V5－His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正，反义真核表达载体，随后采用脂质体转染法将该正，反义载体转染入人胃癌细胞株MKN－45，用TRAP法观察后端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与献报导完全一致，且插入载体的方向完全正确。与正常对照，转染正义载体，空载体比较，转染反义载体端粒酶活性显下降。结论 本实验已成功克隆和人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体，而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性。     

shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞CXCR7表达的影响

目的 探讨CXCR7的shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞HT-29 CXCR7表达的影响.方法 设计CXCR7的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的plVTHM载体连接,构建3种重组穿梭质粒plVTHM shRNA1,plVTHM shRNA2和plVTHM shR-NA3,并转化于DH5α感受态细胞,Amp筛选阳性克隆,抽取质粒行酶切鉴定并测序.分别将3种重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人结肠癌细胞HT-29,实时定量PCR和Western blot分别检测CXCR7 mRNA和蛋白的沉默效果.结果 酶切鉴定及测序结果 证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为6×107 TU/mL,4×107 TU/mL和5×107 TU/mL.感染HT-29后,CXCR7 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P＜0.05);其中以LV-CXCR7 shRNA-2和LV-CXCR7 shRNA-3作用显著,mRNA表达分别下调72%和67%,蛋白表达下调68%和55%(P＜0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P＞0.05)结论 成功构建了3种CXCR7 shRNA慢病毒表达,可有效下调HT-29细胞CXCR7mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础.     

携带DNMT3b—shRNA干扰序列真核表达载体的构建及筛选

目的：构建携带针对靶基因DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b,DNMT3b）mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰质粒。方法：以基因DNMT3bmRNA为靶序列设计三条shRNA序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3bshRNA2、pGensil-1-DNMT3b—shRNA3;经酶切鉴定和测序分析后,将重组质粒分别转染T24细胞中,应用RT—PCR和Western—blot检测各组质粒对DNMT3bmRNA和蛋白的表达抑制情况,并筛选最有效的干扰序列。结果：各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确。RT—PCR结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3bmRNA的抑制率分别为20．44％、79．91％和54．48％;Western blot结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17．27％、77．74％和56．79％。结论：成功构建了质粒pGensil-1-DNMT3bshRNA（1,2,3）,并筛选出pGensil-1-DN—MT3bshRNA2为沉默效应最强的质粒。     

人微管蛋白辅助因子A基因shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对微管蛋白辅助因子A(TBCA)基因的shRNA载体并进行鉴定。方法:针对人TBCA基因mRNA序列,设计合成编码shRNA的两条寡核苷酸链,经退火形成发卡寡核苷酸模板片段,经双酶切克隆至pSilencer2.0-U6-neo和pGCsi-U6-neo-GFP载体,进行酶切测序鉴定,脂质体转染后进行western blot测定。结果:酶切测序证实成功构建干扰质粒,脂质体转染786-0细胞系后24小时可见绿色荧光蛋白。Western blot证实TBCA表达量降低。结论:成功构建了针对TBCA基因shRNA表达载体,为下一步进行RNAi的相关研究奠定了基础。     

沉默RANK真核表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的构建沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK,筛选沉默RANK的最佳干扰序列。方法针对小鼠RANK基因设计并合成3对干扰序列,将其连接到真核表达载体pSuper上,酶切及测序鉴定正确后命名为pSuper-shRANK,后将其用脂质体瞬时转染小鼠骨髓巨噬细胞,用荧光显微镜观察转染情况,用Real-timePCR和Westernblot分析干扰效率。结果酶切分析与测序结果表明重组载体pSuper-shRANK构建成功,脂质体共转染后,Real-timePCR和Western blot分析结果显示shRANK-3干扰效果最好,干扰效率达88.7%,筛选出shRANK-3为最佳干扰序列。结论成功构建了沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK;筛选出了沉默小鼠RANK的最佳干扰序列,为研究抑制该基因在破骨细胞分化及活化作用机制中奠定了基础。