人牙周膜细胞体外三维立体培养模型的建立

目的：建立人牙周膜细胞（PDLC）体外三维立体培养模型，初步探讨两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性，为进一步研究牙周组织生理病理及牙周组织工程奠定实验基础。方法：组织块法培养人PDLC，传代扩增后，接种于珊瑚和珊瑚转化羟基磷灰石（CHA）两种三维支架上，体外继续培养3d，进行细胞计数和扫描电镜观察。结果：细胞在两种支架材料上均能形成良好贴附并增殖，扫描电镜可见两种支架材料均具有良好的多孔网状结构，细胞在支架材料上生长旺盛，伸展充分。结论：可通过将人PDLC接种到珊瑚或CHA上建立体外三维立体培养模型，珊瑚和CHA均有望成为牙周组织工程的支架材料。     

人牙囊细胞与胶原凝胶复合煅烧骨三维培养的实验研究

目的:建立人牙囊细胞(dentalfolliclecells,DFCs)的体外三维立体培养模型。方法:取第4代DFCs分别 接种于煅烧骨(sinteredbovinebone,SBB)(A组)、胶原凝胶(B组)、胶原复合煅烧骨三维支架上(C组),并以二维 培养的DFCs(D组)作对照,1周、2周取材,扫描电镜观察细胞形态以及与材料的贴附情况,细胞计数观察细胞在 材料上的增殖情况,组织化学方法检测DFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:扫描电镜见A组、B组和C组细胞 均完全伸展,但C组细胞数量明显增多,细胞外基质分泌增加,优于A组、B组和对照组D组,而对照组细胞在二维 培养条件下复层生长呈膜状结构,膜表面部分细胞脱落死亡,细胞外基质分泌较实验组少。A组与C组的ALP活 性无差异(P>0.05),但显著高于对照组B组和对照组(P<0.05)。1周时3组细胞Ⅰ型胶原合成情况无明显差 异,但2周时C组细胞的Ⅰ型胶原平均灰度值明显高于其他2组(P<0.01)。结论:A、B、C组对DFCs的贴附、增 殖,分化均有影响,但C组作支架最优。胶原凝胶与煅烧骨的复合支架更有利于牙囊细胞的增殖贴附和分化。     

犬牙周膜细胞和骨髓基质细胞相互作用的体外实验研究

目的:研究牙周膜细胞(PDLCs)和骨髓基质细胞(BMSCs)共培养是否更利于牙周组织再生。方法 :用组织块法培养PDLCs,用全血贴壁法培养BMSCs,检测它们的成骨、成脂诱导分化能力。用Transwell小室共培养这两种细胞,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测共培养后这两种细胞的增殖能力及部分基因的表达变化。结果:PDLCs和BMSCs具有多向分化潜能。共培养能促进它们各自增殖,上调Ⅰ型胶原(COLI)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、核心结合因子2(RUNX2)的表达。结论:PDLCs和BMSCs共同运用作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

小型猪牙周膜细胞体外培养及与三维支架材料的生物相容性研究

目的建立小型猪牙周膜细胞的体外培养方法,研究其与三维支架材料的生物相容性,为牙齿再生和牙周组织工程研究提供依据.方法无菌条件下,拔除12月龄小型猪上颌尖牙,剥离牙根外牙周组织,用3g/LⅠ型胶原酶和4g/L Dispase 37℃消化1 h,用70μm滤网收集细胞,1000 r/min离心10 min,培养液重新悬浮成单细胞悬液,α-MEM(α-modification of Eagle's medium)培养基培养.每天用倒置显微镜观察细胞生长情况,流式细胞仪检测抗Stro-1抗体的表达情况.取第3代牙周膜细胞接种于HA/TCP上,扫描电镜观察培养3天和5天后细胞在三维支架材料上的生长情况.结果原代培养的小型猪牙周膜细胞生长良好,呈多角形或梭性.流式细胞仪结果显示,分离培养的牙周膜细胞中有7.6%抗Stro-1抗体表达阳性.扫描电镜观察结果表明,牙周膜细胞在HA/TCP三维支架上生长良好.结论小型猪牙周膜细胞可被成功的分离培养,在三维支架材料HA/TCP上表现出良好的生长状态,有望为牙齿再生和牙周组织工程研究提供有用的细胞来源.     

用组织工程的方法建立人牙髓细胞体外三维立体培养模型

目的：建立人牙髓成纤维细胞体外三维立体培养模型,为研究牙髓生理病理奠定基础。方法：组织块法培养人牙髓细胞,扩增后,接种于聚乙醇酸（PGA）三维支架上,继续培养,通过倒置显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞的生长情况。结果：细胞接种24h后开始贴附于PGA纤维上,然后开始伸展并增殖,PGA纤维上的细胞不断增长。扫描电镜可见细胞在PGA纤维上生长良好,呈长梭形。透射电镜观察表明PGA上的细胞超微结构正常。结论：将牙髓细胞接种于PGA无纺网上,可以有效地建立牙髓细胞三维立体培养模型。     

PLA-PEG复合支架材料体外细胞相容性的实验研究

目的:探索新型PLA-PEG(polylactic acid-polyethylene glycol block copolymers)复合支架材料体外细胞相容性。方法:支架材料分为实验组A(PEG/PLA为16∶0)、实验组B(PEG/PLA为13∶0)、对照组C,单纯聚乳酸(polylacticacid,PLA)。贴壁法培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),诱导生成成骨细胞,接种于支架材料上。通过观察种子细胞在支架材料上的吸附迁移、生长增殖情况,验证各组细胞材料复合体的成骨活性,比较分析不同支架材料之间的差异。结果:兔成骨细胞在新型PLA-PEG三维支架材料表面分布较为均匀,生物学行为活跃。实验组A与B的细胞粘附及增殖能力均强于对照组(P<0.05)。结论:三种支架均具有较好的细胞相容性,但实验组A与B的细胞相容性更好,更适宜作为支架材料与成骨细胞共同培养,以获得具有成骨能力的三维立体结构组织工程骨。     

人牙周韧带细胞在聚羟基乙酸支架上体外三维培养的实验研究

目的：应用聚羟基乙酸(polyrglycolic acid，PGA)作为人牙周韧带细胞(periodontal ligament cell，PDLC)的三维体外培养支架，观察细胞的形态学特征和生物学性状。方法：将人牙周韧带细胞与PGA三维支架进行体外复合培养，用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞形态结构及其与支架的粘附性和组织相容性，并用Ⅰ型胶原抗体检测细胞的Ⅰ型胶原分泌情况。结果：光镜和扫描电镜显示，人PDLC在PGA三维支架上粘附良好，分泌基质旺盛。免疫组化染色显示细胞支架复合物中Ⅰ型胶原表达阳性。结论：人PDLC在PGA三维支架上能够维持其形态学特征及生物学性状。聚羟基乙酸具有良好的粘附性和生物相容性，适宜进一步作为构建组织工程化牙周韧带的支架材料。     

人牙源性间充质细胞与胶原类材料复合培养的体外实验研究

目的：评价胶原类材料作为牙齿组织工程研究的支架材料的可行性。方法：将生长因子诱导后的人牙源性间充质细胞与胶原类材料复合后进行体外三维培养，观察细胞生长和增殖情况。结果：细胞在胶原凝胶中生长良好，并保持了分化表型。细胞在胶原膜表面伸展充分，生长良好，增殖活跃，细胞表面可见多数分泌颗粒。结论：胶原类材料适宜牙源性间充质细胞的生长。然而，它们坚韧性不高，而且无法为矿化组织细胞的生长提供充足的矿物离子环境。因此，胶原类材料可作为牙齿组织工程研究的一类较好的辅助性支架材料。     

人牙周膜细胞与BIO-OSS胶原体外三维复合体的构建

牙周炎治疗成功的关键在于促使被炎症破坏的牙周支持组织再生。传统的治疗方法只能部修复破坏的组织，而利用组织工程技术有望解决这一难题。     

种植体牙周膜组织工程支架材料的研究现状

支架材料是利用组织工程学技术构建种植体牙周膜的关键所在.本文综述了可能应用于种植体牙周膜构建的各类支架材料的研究现状,包括天然材料和人工材料.     

人牙周膜成纤维细胞原代培养的研究

目的：研究如何提高人中膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：以牙槽窝刮取组织块法替代传统的牙根刮取法，以组织块自然贴壁法替代传统的干燥贴壁法。结果：48h后细胞游出率为40％，而成功传代率为20％，结论：通过对取材和培养方法的改良，可以显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。     

再植牙复合牙周膜细胞的实验研究

目的:研究体外培养的牙周膜细胞与牙根共同再植入人造牙槽窝内,其组织形成的能力与促进牙周再生的潜能。方法:拔除2只杂种狗的第三、第四前磨牙,得到牙周膜细胞并进行体外培养。拔牙后1个月,将体外培养的牙周膜细胞与自体牙根共同再植入右侧下颌无牙区的人造牙槽窝内,左侧下颌作为对照。再植2个月后,处死动物,标本制成石蜡切片,HE染色,光镜下进行组织学观察。结果:实验组标本中,在与近根尖部分牙根相对的一些区域可以看到垂直于骨表面的纤维束包埋于牙槽窝壁中。结论:即使被植入人造牙槽窝中,体外培养的牙周膜细胞仍保留了在体内形成类牙周膜组织的能力。     

诱导成体人牙周韧带干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的从成体人牙周组织中分离培养牙周韧带干细胞，研究其分化为软骨细胞的可行性。方法选取10～15岁的年轻患者因正畸拔除的健康牙齿，刮取根中1／3的牙周膜，采用组织块培养法得到牙周韧带细胞，待细胞达一定量后用有限元稀释法进行单细胞克隆，筛选牙周韧带干细胞（PDLSC），体外采用离心管聚集体诱导法进行软骨化诱导培养，光镜下观察诱导细胞形态学的改变，甲苯胺蓝染色、免疫组化、RT-PCR等方法检测胶原和糖蛋白的体外表达情况。结果体外离心管聚集体诱导培养3周后，实验组呈白色半透明状，甲苯胺蓝染色显示在外周区域有大量软骨基质成分沉积，组织学显示有较为明显的软骨陷窝。免疫组化及RT-PCR检测到Ⅱ型胶原表达，Ⅱ型胶原染色呈强阳性。对照组细胞团块逐渐收缩、崩解，组织学检测无软骨陷窝结构，Ⅱ型胶原免疫组化结果阴性。结论从成体人牙周组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能，也为牙周组织工程的应用奠定了实验基础。     

牙周膜细胞松质骨基质支架复合移植促进牙周组织再生的研究

目的观察牙周膜细胞（PDLCs）接种松质骨基质（CBM）支架复合移植对牙周组织再生修复的影响和意义。方法将体外培养的狗自体PDLCs接种到CBM三维支架上,体外进行细胞计数和扫描电镜观察,并植人狗人工牙周组织缺损处,表面覆盖聚四氟乙烯膜（e-PTFE）,以单纯翻瓣组和只覆盖e-PTFE组作为对照。术后8周对动物组织标本进行组织学观察和测量,分析比较各组牙周组织的再生情况。结果PDLCs在CBM支架材料上形成良好的贴附并增殖,扫描电镜可见CBM具有良好的多孔网状结构,细胞在CBM上生长旺盛,伸展充分。自体PDLCs／CBM／e-PTFE膜复合植入组较单纯翻瓣组和e—PTFE组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质生成,且未见上皮长入。结论PDLCs接种松质骨基质支架复合移植能更有效地促进牙周组织再生和重建,CBM有望用作牙周组织工程的支架材料。     

米诺环素对体外培养的人牙周韧带细胞生物活性的影响

目的 研究米诺环素对体外培养的人牙周韧带细胞(HPDLCs)增殖及生物合成的影响。方法 将不同浓度的米诺环素(1、5、20、100、500、2500 mg/L)加入体外培养的HPDLCs,共孵育2d后,在倒置显微镜下观察其对细胞形态的影响,并分别检测其对细胞的增殖活性、蛋白合成及DNA合成的影响。结果 在5-100mg/L的浓度范围内,米诺环素可显著促进HPDLCs的增殖及生物合成(P<0.01)。但高浓度(2500 mg/L)的米诺环素则严重抑制细胞的生物学活性。结论 一定浓度的米诺环素能提高HPDLCs的生物学活性,但过高浓度的米诺环素具有细胞毒性,不利于牙周组织的修复和再生。     

氯霉素对人牙周膜细胞增殖及超微结构的影响

目的：比较0．25％氯霉素和生理盐水对人牙周膜细胞增殖和超微结构的影响,以提高脱位牙再植的疗效。方法：采用组织块法体外培养人牙周膜细胞,取第5代培养细胞,分别加入氯霉素、生理盐水和DMEM培养液作用1h,在作用后0、12、24、48h进行细胞计数．观察对牙周膜细胞增殖的影响。采用透射电镜观察人牙周膜细胞超微结构的变化。数据采用SAS9．1软件包进行方差分析。结果：在0、12、48h时间点．氧霉素组和生理盐水组的细胞数显著低于DMEM培养液对照组（P〈0．0001）;在24h时间点,生理盐水组的细胞数显著低于对照组（P〈0．05）。各时间点氯霉素和生理盐水两组细胞计数无显著差异（P〉0．05）。电镜观察,氯霉素可导致人牙周膜细胞线粒体空泡化．内质网减少。结论：氯霉素对人牙周膜细胞增殖的影响与生理盐水没有区别,但对人牙周膜细胞的超微结构有损伤作用。     

体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞表型特征的研究

目的 对体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞的表型特征进行研究探讨。方法 组织块 法培养人牙周膜细胞,放射免疫法检测条件培养基中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣＮ）的分泌活性,免疫 组化法检测非分泌型的ＡＬＰ和ＯＣＮ的表达,原位杂交方法检测二者的ｍＲＮＡ水平的表达。结果 人牙 周膜细胞具有成骨细胞的部分表型,碱性磷酸酶在蛋白水平包括分泌和非分泌型及基因转录水平都有一 定的表达,随培养时间的变化不大;而不具有成熟的成骨细胞的表型特征——骨钙素的表达,其无论是在 基因和蛋白水平都没有表达二这一结果为进一步研究人牙周膜细胞在机械力作用下参与骨改建打下基础。     

不同培养条件下牙周韧带细胞矿化能力的比较研究

目的：探讨牙周韧带细胞体外常规状态及矿化诱导下钙化特性的差异。方法：用组织块培养法进行人牙周韧带细胞的原代培养，取第4代细胞用于实验，在体外长期培养，条件培养组加入矿化诱导液，常规培养组不加任何矿化诱导因素，倒置显微镜下观察矿化情况，茜素红与Von-Kossa染色显示钙盐沉积。结果：牙周韧带细胞在体外长期培养过程中，两组均表现为融合期、复层期、结节期、矿化期，形成肉眼可见的白色结节，茜素红与Von-Kossa染色均显示结节内有钙盐沉积。但常规培养组矿化所需的时间要比条件培养组长1周左右。结论：牙周韧带细胞在体外长期培养过程中，无论有无矿化诱导因素存在，均具有向矿化组织形成细胞分化的趋势，但矿化诱导因素的存在可以促进矿化结节的早期形成。     

Establishing a technique for isolation and characterization of human periodontal ligament derived mesenchymal stem cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are extensively used in tissue regenerative procedures. One source of MSCs is the periodontal ligament (PDL) of teeth. Isolation of MSCs from extracted teeth is reasonably simple, being less invasive and presenting fewer ethical concerns than does the harvesting of MSC’s from other sites. The objectives of this study were to isolate and characterize the PDL stem cells (PDLSC) from healthy adults’ extracted teeth and then to characterize them by comparing them with bone-marrow derived MSCs (BMMSC).MethodsThe PDL tissue was scraped from the roots of freshly extracted teeth to enzymatically digest using collagenase. The cells were sub-cultured. Flow-cytometric analysis for the MSC surface-markers CD105, CD73, CD166, CD90, CD34, CD45 and HLA-DR was performed. To confirm the phenotype, total RNA was extracted to synthesize cDNA and which was then subjected to RT-PCR. The gene-expression for Oct4A, Sox2, NANOG and GAPDH was determined by gel-electrophoresis. To assess their multilineage potential, cells were cultured with osteogenic, chondrogenic and adipogenic medium and then stained by Alizarin-red, Alcian-blue and Oil-Red-O respectively. MSCs from the bone-marrow were processed similarly to serve as controls.ResultsThe cells isolated from extracted teeth expanded successfully. On flow-cytometric analysis, the cells were positive for CD73, CD90, CD105, CD166 and negative for CD34, CD45 and HLA-DR. The PDLSCs expressed Oct4A, Sox2, and NANOG mRNA with GAPDH expression. Cells cultured in the osteogenic, chondrogenic and adipogenic media stained positive for Alizarin-red, Alcian-blue and Oil- Red-O respectively. The surface marker expression and the trilineage differentiation characteristics were comparable to those of the BMMSCs.ConclusionsThe periodontal ligament tissue of extracted teeth is a potential source of therapeutically useful MSCs. Harvesting them is not invasive and are a promising source of MSC as the PDLSCs showed characteristics similar to those of the highly regarded MSC’s derived from bone-marrow.