不同温度保存对骨髓细胞存活率的影响

目的 探讨4℃与-196℃保存骨髓细胞的方法和存活率。方法 取wistar大鼠,无菌条件下制备成骨髓细胞悬液,分别于4℃与-196℃保存,保存96h和60d后,用Trypanblue染色、观察骨髓细胞的回收率。结果 骨髓细胞4℃保存96h,回收率为28;-196℃保存60d,细胞回收率为2318。结论 -196℃保存骨髓细胞其存活率高于4℃保存,它是中长期保存骨髓细胞的一种有效的方法。     

人外周血造血干细胞低温保存方法的实验研究

目的：观察－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法中单用二甲基亚砜（DMSO）与DMSO加羟乙基淀粉（HES)两种浆存保护剂对人外周血造血干细胞体外冻存的效果。方法：对5例经Cs-3000Plus血细胞分离机分离所得的外周血单个核细胞分别加入10％DMSO和5％DMSO加6％HES冻存保护剂。并分别以－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法保存15d，以快速复温法复苏细胞，检测冻存前后细胞活率及有核细胞、CD34^ 细胞、粒单系集落形成单位（CFU－GM）、红系集落形成单位（CFU－E）回收率。结果：在－196℃程控降温冻存方法时，单用DMSO和DMSO加HES两组在细胞活率、有核细胞回收率、CD34^ 细胞回收率、CFU－E回收率方面差别无显著性意义；在－80℃直接冻存方法时，MDSO加HES组有核细胞回收率、CFU－E回收率高于单用DMSO组。结论：－196℃程控降温冻存时10％DMSO和5％DMSO加6％HES两种冻存保护剂均可有效应用于外周血造血干细胞保存；一80℃直接冻存方法适合5％DMSO加6％HES冻存保护剂，也可有效用于外周血造血干细胞保存。     

﹣80°C冰箱长期冻存外周血造血干细胞研究

目的对外周血造血干细胞活性在深低温（-80℃）下保存3年的效果进行评价。方法对30例经MCS＋血细胞分离机采集所得的外周血造血干细胞加入细胞冻存保护剂分别予以-196℃液氮冻存和-80℃冰箱深低温冻存,并检测和比较冻存前后单个核细胞（mononuclear cells,MNC）、CD34＋细胞的计数及细胞回收率,细胞活性。结果 -80℃冰箱冻存组MNC、CD34＋细胞冻存3年与冻存前比较差异均无统计学意义冻存3年后MNC回收率与冻存1年后比较差异无统计学意义。3年后-80℃冰箱冻存组干细胞与-196℃液氮冻存组比较,差异无统计学意义。结论 -80℃冰箱深低温保存法快速、简便、安全、费用低廉,可有效用于外周血造血干细胞长期保存。     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究

目的通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果,以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存,冻存前及冻存3、6及12个月后,应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞(MNC)计数,台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34 细胞计数。结果在-80℃冰箱冻存3个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后,脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性(P<0.05)。冻存12个月后,脐血各项指标较冻存前差异均有显著性,其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性(P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月,6个月后存在部分细胞损害,此时的脐血不适合作干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后,造血干细胞仍保存完好,适宜长期保存。     

不同冻存时间对兔角膜内皮细胞活性的影响

目的 探讨适合角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)超低温冷藏保存的最佳期限.方法 将CEC经-196 ℃液氮冷冻保存.在冷冻后1、6、12、24个月分别复苏,培养.观察CEC的生长情况和细胞存活率及24 h贴壁率.结果 冻存1、6、12个月复苏的CEC细胞存活率均≥80.0%,冻存24个月的CEC细胞存活率(72.0%)较前三个时间段稍有下降但没有差异;冻存1、6、12个月CEC 24 h贴壁率均≥72.5%,此三个时间段比较没有明显差异,冻存24个月CEC 24 h贴壁率(59.2%)与前三个时间段比较有统计学差异(P＜0.05).结论 在供体来源短缺,细胞需要长期保存的情况下,深度冷藏是保存CEC的一种较好的方法.     

-80℃冻存外周血干细胞21例分析

目的：探索一种操作简单、干细胞回收率和存活率高、成本低廉的外周血浆存方法。方法：采用终浓度为5％二甲基亚砜（DMSO），3％羟乙基淀粉（HES）和4％人血白蛋白（HSA）的干细胞保护剂直接－80℃冰箱冰存外周血干细胞，并检测不同时相点（1、3、6、9、12个月）外周血干细胞的细胞活性，单个核细胞（MNC）和CFU－GM、CD34^ 细胞的回收率。结果：随着保存时间的延长，观察到12个月时，冻存干细胞的细胞活性、MNC回收率和CD34^ 细胞回收率分别为86．46％、88．58％、87．65％，与冻存1个月相比无统计学差异（P＞0．05），足以保障干细胞移植后造血重建的成功。结论：5％DMSO，3％HES和4％HAS作为干细胞冷冻保护剂直接－80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种简便、实用、安全、可靠、成本低的外周血干细胞冻存方法，具有广泛的临床推广价值。     

-80℃条件下不同细胞浓度外周血干细胞冻存效果的实验观察

目的　观察不同细胞浓度外周血干细胞在 - 80℃条件下的冻存效果。方法　采用一种简便的 - 80℃干细胞冻存方法 ,其干细胞保护剂终浓度为 5 %二甲基亚砜 (DMSO) ,3%羟乙基淀粉 (HES)和 4 %人血白蛋白 (HSA) ,不经程序降温 ,直接 -80℃冰箱冻存外周血干细胞 ,并在不同时相点 (冻存后 1、3、6、9、1 2个月 )对推荐细胞浓度组 (1 .3～ 3.9)× 1 0 7/ml、调整细胞浓度组 (8.0～ 2 9.9)× 1 0 7/ml和高细胞浓度组 (30 .1～ 70 .1 )× 1 0 7/ml的外周血干细胞的细胞活性进行检测 ,观察台盼蓝拒染率和MNC、CFU GM、CD34+ 细胞的回收率。结果　 3组干细胞活性在 1 2个月内无明显下降 ;干细胞冻存后 9个月期间 ,3组冻存细胞的台盼蓝拒染率 ,MNC回收率、CFU GM回收率、CD34+ 细胞回收率都在 80 %以上。冻存 1 2个月中 ,3组在冻存后同一时间相互比较无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,说明该 - 80℃干细胞冻存方法适用于不同浓度的细胞液 ,短期内具有良好的冻存效果。结论　5 %DMSO、3%HES和 4 %HAS作为干细胞冷冻保护剂直接 - 80℃冰箱冻存外周血干细胞的方法能有效地保护不同浓度细胞液的外周血干细胞活性 ,适当地提高细胞保存时的浓度 ,减少回输量 ,可避免因干细胞冻存而引起的副作用     

-80℃冻存外周血造血干细胞的应用研究

目的:探求一种操作简便实用、造血干细胞回收率和存活率高、成本低的外周血造血干细胞的冻存方法。方法:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存,并检测冻存前后外周血干细胞的活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率无明显差异(P>0.05),输注后造血均重建。结论:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法,具有广泛的临床推广价值。     

体外培养细胞的长期冷冻保存

在体外细胞培养过程中,如按常规法传代保种,不仅耗时费力,且能引起细胞性状发生改变,同时又易受微生物或细胞之间的感染。为了避免在细胞培养过程中常会遇到的这些问题,1959年Hauschka等曾应用低温(-78℃)保存法冻存82种肿瘤和正常细胞,初获成效。但细胞经长期冻存后存活率很低,仅2～3％。近年来,由于冷冻技术的发展,普遍采用深低温(-196℃)的液氮冻存法,大大提高了细胞的存活率。据报道,若干细胞系经液氮冻存1～2年后的存活率仍可达     

机采浓缩血小板-80 ℃长期冻存条件下CD62p表达与ADP诱导的再表达

目的 通过对冻存损伤关键因素的了解评估冻存血小板潜在的冻存期限.方法 采用流式细胞技术观察冻存1～6年复苏后血小板CD62p表达和ADP诱导后CD62p再表达能力.结果 在-80℃保存12～48个月,冻存血小板CD62p的表达受得良好抑制,可与22℃保存28 h的液体血小板质量相近;而ADP-CD62p再表达能力充分,36个月时为(70.2±10.3)%,与常温24 h的液体血小板的(70.4±21.5)%相比无显著性差异(P＞0.05);但48个月时下降至(35.2±18.2)%,与冻存36个月比较有非常显著性差异(P＜0.01).作为对照,液体血小板在采集后1 h的CD62p表达率为(2.2±1.5)%,在22℃条件下随保存时间的延长迅速升高,24 h有显著性差异(P＜0.05),48 h和72 h有极显著性差异(P＜0.01);而采集后1 h的ADP-CD62p再表达率为(83.5±14.7)%,其后迅速下降,48 h后有极显著性差异(P＜0.01).结论 新鲜血小板常温条件下待冻期间发生的代谢损伤是影响冻存血小板质量的关键因素,选择≤24 h的新鲜血小板用于-80℃冻存至少可以保存3年.     

自体造血干细胞冷冻保存方法的实验研究

目的 观察程序降温仪冷冻法和HES冷冻法在冷冻保护体系和技术实施上的差别，选择一种可以获得良好回收率，操作过程更为简便和安全的冷冻保存方法。方法 (1)通过血细胞分离机，获得去除了红细胞后的单个核白细胞。(2)使用程序降温仪冷冻法，将细胞冷冻后，放置液氮中保存。(3)使用HES冷冻法，直接置-80℃低温冰箱中保存。(4)采用常规计数法，台盼蓝拒染法，甲基纤维素法，流式细胞仪，检测两种方法冻存自体造血干细胞前后，单个核细胞的总数、细胞存活数，CFU—GM集落形成数、CD34阳性细胞的百分率。(5)在37℃恒温水浴槽中，快速解冻细胞。结果 用两种冻存方法保存的自体造血干细胞，解冻回输给患者后，均未出现过敏症状和特殊的不良反应。检测两种不同冻存方法，在冻存前后单个核细胞的总数、细胞存活率、以及CFU—GM集落形成数和CD34阳性细胞的百分率。经统计学处理，无显著性差异。在操作时间上，程序降温仪冷冻法为4h，HES冷冻法为1．5h。结果表明，采用HES冷冻体系，直接置-80℃低温冰箱短期冻存自体造血干细胞，回收率不受影响，方法简单，操作时间短，临床使用安全可靠。     

低温-18℃冷冻保存人肝癌细胞的实验研究

目的：了解低温－１８℃保存人肝癌细胞Ｂｅｌ７４０２回收率,并观察其复苏后培养的形态。方法：采用不同浓度的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为冻冻保护剂,直接于－１８℃冰箱中冻存人肝癌细胞株Ｂｅｌ７４０２,于冻存后１周、１个月、２个月和３个月分别取样观察分析。结果：冻存３个月后,台盼蓝拒染存活率〉７０％,置瓶培养后第４天细胞均可贴壁生长、形成克隆。结论：用－１８℃普通冰箱冻存肿瘤细胞效果好,方法简单易行。     

人骨髓基质细胞冻存技术的初步研究

目的　探索适合于人骨髓基质细胞 - 196℃冷冻保存条件和方法。方法　以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质细胞培养 ,传代后以不同浓度二甲亚砜 (DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存 ,2个月后复苏接种培养 ,对其存活率、贴壁率和体外成骨能力进行检测。结果　不同DMSO浓度保存细胞复苏后细胞的存活率从高到低依次为 10 %DMSO组、5 %DMSO组、15 %DMSO组、2 0 %DMSO组 ;在条件培养液中 2周形成多层结构 ,并出现细胞结节 ,碱性磷酸酶染色阳性 ;冻存时细胞浓度为每毫升 (5 .0～ 8.0 )× 10 6个细胞组复苏后细胞存活率高于每毫升 (1.0～2 .5 )× 10 6个细胞组。结论　 5 % - 10 %DMSO浓度适合于骨髓基质细胞的长期保存 ,高浓度组骨髓基质细胞的冻存效果优于低浓度组。     

非冻存低温下维持悬浮培养细胞

目的建立非冻存低温条件下维持悬浮培养细胞的细胞保存技术。方法常规培养悬浮生长的人白血病细胞Jurkat,分别正常培养、室温和4℃冰箱条件下保存,间隔10天进行细胞形态观察和细胞存活率分析,然后室温和4℃冰箱保存的细胞再加入新鲜培养剂转入正常培养。结果两种非冻存低温条件下细胞存活率降低,与正常培养组有显著性统计学差异（P〈0.01）,并且在细胞形态上具有相应的改变,10天后存活率分别为81%和79%,没有差异（P〉0.05）,20天后室温条件下细胞仍然保持81%存活率,与前10天没有差异（P〉0.05）,并在转入正常培养条件下恢复生长繁殖。结论非冻存低温条件下可以短期维持悬浮培养细胞,该方法丰富了细胞培养技术。     

-80℃简易冻存外周造血干细胞临床应用观察

目的:探索一种简便易行、安全有效、成本低的干细胞的冻存方法。方法:6份外周造血干细胞以1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存,检测冻存前后外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性、MNC和CD34+细胞的数量及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论:1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法。     

普通冰箱4℃短期保存小鼠骨髓单个核细胞的研究

目的:建立小鼠骨髓单个核细胞短期保存简便有效的方法。方法:采用密度梯度离心法获得小鼠骨髓单个核细胞,DMEM培养液为小鼠骨髓单个核细胞冷藏营养液,直接置骨髓单个核细胞于4℃冰箱中保存,分别在当天至60 h选择性观察细胞形态,测其细胞回收率、活力及细胞周期。结果:小鼠骨髓单个核细胞置4℃冰箱保存2 d,活细胞率达80%以上;细胞回收率达70%以上;细胞周期与对照组相比无明显差别。结论:4℃冰箱能在2 d内保存小鼠骨髓单个核细胞,是一种简便易行的短期保存方法。     

普通冰箱4 ℃短期保存小鼠骨髓单个核细胞的研究

目的：建立小鼠骨髓单个核细胞短期保存简便有效的方法。方法：采用密度梯度离心法获得小鼠骨髓单个核细胞,DMEM培养液为小鼠骨髓单个核细胞冷藏营养液,直接置骨髓单个核细胞于4 ℃冰箱中保存,分别在当天至60 h选择性观察细胞形态,测其细胞回收率、活力及细胞周期。结果：小鼠骨髓单个核细胞置4 ℃冰箱保存2 d,活细胞率达80%以上;细胞回收率达70%以上;细胞周期与对照组相比无明显差别。结论：4 ℃冰箱能在2 d内保存小鼠骨髓单个核细胞,是一种简便易行的短期保存方法。     

贴壁培养细胞直接用培养瓶置-80℃冻存

目的：探讨贴壁培养细胞直接用培养瓶置4℃、-20℃,最后置-80℃低温冰箱冻存的可行性.方法：采用培养瓶常规培养贴壁细胞L929,去上清后,加冻存液覆盖细胞.-80℃低温冰箱冻存,然后,每2个月复苏1次,计数活细胞,观察细胞传代效果.结果：L929细胞置-80℃低温冰箱冻存1年,复苏良好,随着冻存时间延长,存活细胞逐渐减少,复苏耗时延长.结论：贴壁培养细胞直接用培养瓶置-80℃低温冰箱冻存1年,复苏良好.     

二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法低温冻存脐血来源不成熟树突状细胞的实验研究

目的：联合使用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）和羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch,HES）作为冷冻保护剂并使用非程控降温冷冻技术,研究脐血来源的不成熟树突状细胞低温冻存前后所表现的生物特性,为不成熟树突状细胞的临床应用提供保存方法.方法：GM-CSF（granulocyte-macrophage clonoy-stimulatingfactor）和IL-4（interleukin-4）体外诱导单个核细胞产生不成熟树突状细胞,5%DMSO＋6%HES作为保护剂,-80℃冰箱降温,-196℃保存,37～40℃水浴复温,检测方法：台盼蓝拒染回收率,观察细胞形态,鉴定免疫表型,进行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏T淋巴细胞增殖情况.结果：冻存不成熟树突状细胞的台盼蓝拒染回收率为88.6%,其细胞形态,免疫表型及刺激未致敏T淋巴细胞的能力与新鲜DC相比无显著性差异.结论：冻存不成熟树突状细胞具有DC的显著特征,其细胞免疫表型和细胞功能实验上仍然保持了不成熟特征,联合使用二甲基亚砜和羟乙基淀粉作为冷冻保护剂对不成熟树突状细胞有良好的保护作用.