乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞脂代谢相关基因表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)对脂质代谢相关基因的影响及其在肝细胞脂肪变性发生中的作用. 方法 将质粒pIRES2-eGFP-HBX转染入HepG2细胞中,建立表达HBX的HepG2/HBx细胞模型;以转染空载体pIRES2-eGFP (HepG2/pIRES2细胞)及未转染的HepG2细胞作为对照.转染后24、48、72 h,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达;检测细胞内甘油三酯含量;RT-PCR方法检测固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和肝X受体(LXR)αmRNA表达水平;Western blot检测HBX,LXRα及脂肪酸合成酶(FAS)蛋白表达的变化.多组间比较采用成组设计的方差分析,多组间的两两比较采用q检验;各基因表达量之间的关系采用Pearson相关分析.结果 在转染后24、48、72 h,HepG2/HBx细胞和HepG2/pIRES2细胞中有GFP的表达并随时间延长而增多、增强,仅在HepG2/HBx细胞内有HBx表达,并且随时间的延长而逐渐增加,差异有统计学意义(F= 32.21,P＜0.05),提示成功建立HepG2/HBx细胞模型;在转染后24、48、72h,HepG2/HBx细胞内LXRαmRNA相对表达量分别为0.386±0.055、0.505±0.071、0.649±0.058,SREBP-1 mRNA相对表达量分别为0.395±0.055、0.548±0.047、0.795±0.058; LXRα蛋白的相对表达量分别为0.178±0.036、0.263±0.047、0.347±0.058,FAS蛋白相对表达量分别为0.436±0.055、0.608±0.053、0.827±0.046,各相同时间点均较对照组明显增加(P＜0.05或P＜ 0.01),并均随时间的延长而逐渐增多(P＜ 0.05或P＜0.01),且与HBX表达量均呈正相关(rLXPα= 0.994,rSREBP-1= 0.984,r' LXRα=0.989,rFAS=0.991,P＜0.05).HepG2/HBX细胞内TG含量与对照组相比,差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 HBx-LXR α -SREBP- 1/FAS通路可能参与了调节脂质代谢相关基因的转录和表达,可能是引起肝细胞脂肪变发生的重要分子机制之一.     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞影响的蛋白质组学分析

HBV可引起急慢性肝炎、肝硬化，并与原发性肝细胞癌发生、发展关系密切。近年来，尽管HBV编码蛋白，如S蛋白、表面抗原大蛋白等，致肝细胞病变作用得到广泛重视，但HBV对宿主细胞的整体影响尚鲜见报道。本研究采用蛋白质组学相关技术，即差异凝胶电泳（differentialin—gel electrophoresis）和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI—TOF-TOFMS）技术，整体研究HBV对HepG2细胞蛋白表达的影响，鉴定其中的差异蛋白质，为更合理地探讨HBV对细胞功能的影响提供理论依据。     

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFPCl，构建重组体pGFP—HBx。将pEGFPCl、pGFPHBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT—PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx。用阿霉素（2．5μg／m1）分别处理HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。结果HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RTPCR检测显示在HepG2／GFP—HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2／GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2／GFPHBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2／GFP—HBx细胞凋亡率为3．94％，明显低于HepG2（59．03％）、HepG2／GFP细胞（61．38％）（P〈0．01），而与未处理对照组细胞凋亡率（2．12％，2．78％，2．55％）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功建立了稳定表达GFP、GFPHBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞IL-17R信号通路的影响

目的:研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)重组腺病毒对HepG2细胞的IL-17R和接头蛋白Act1表达的影响,以及HBV对IL-17诱导NF-B活化的影响.方法:采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测HepG2细胞的IL-17、IL-17R和Act1的mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IL-17R和Act1的蛋白表达;免疫荧光检测NF-B核移位;ELISA检测上清的IL-17含量.结果:各组HepG2细胞培养上清液中均未检测到IL-17且亦未检测HepG2细胞有IL-17的mRNA表达;HBV重组腺病毒组的IL-17R mRNA和蛋白的表达明显低于相应浓度对照组(0.68±0.02vs0.89±0.03,0.33±0.06vs0.81±0.01,0.12±0.01vs0.86±0.05,P<0.05;蛋白:0.84±0.12vs1.01±0.13,0.56±0.09vs1.01±0.08,0.24±0.08vs0.98±0.05),且呈剂量和时间依赖性.但HBV重组腺病毒组与对照组比较,对HepG2细胞接头蛋白Act1的mRNA和蛋白表达水平无明显影响;同时HBV重组腺病毒能抑制IL-17R诱导Hep G2细胞的NF-B活化.但HBV重组腺病毒与对照组比较,对接头蛋白Act1在mRNA和蛋白表达水平上影响无明显变化;同时HBV重组腺病毒能抑制IL-17R诱导Hep G2细胞的NF-B活化.结论:HBV重组腺病毒可降低HepG2细胞的IL-17R mRNA和蛋白的表达,抑制IL-17R诱导Hep G2细胞的NF-B活化,对HepG2细胞的IL-17R信号通路发挥抑制作用.     

乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达的影响

目的研究L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达的影响。方法构建EGFP-野毒株核壳蛋白、L60V、I97L变异核壳蛋白表达载体,酶切和测序鉴定,克隆扩增后转染HepG2细胞,筛选阳性细胞株;荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,Western blotting检测核壳蛋白的表达;RT-PCR检测HLA-A mRNA的表达,流式细胞术观察HLA-A蛋白的表达。结果成功建立了融合表达蛋白表达载体;荧光显微镜显示细胞内融合蛋白表达,Western blotting检测各细胞系蛋白表达的量基本相同;RT-PCR和流式细胞术结果表明,与野毒株相比I97L变异核壳蛋白表达细胞株HLA-A mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05),而L60V变异核壳蛋白表达细胞株则均明显下调(P<0.05)。结论L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达与野毒株核壳蛋白的影响不尽相同,其在功能上与野毒株核壳蛋白存在差异。     

HepG2与HepG2．2．15细胞中P53表达及活性的比较

目的探讨HBV对抑癌基因P53表达及活性的影响。方法选用HepG2及转染了HBV表达质粒的HepG2．2．15细胞，采用Western blotting法检测两种细胞P53的表达状况；磷酸钙法将报告基因质粒PG13-CAT和P21-LUC分别转染细胞，通过检测报告基因的表达观察各细胞中P53的活性。结果HepG2．2．15细胞中P53蛋白表达水平高于HepG2细胞，而且两种报告基因的表达在HepG2．2．15细胞中也较高。结论HBV在肝癌细胞内的复制对P53的表达及功能具有一定的增强作用。     

商陆抗病毒蛋白体外对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响

目的　探讨商陆抗病毒蛋白 (pokeweedantiviralprotein ,PAP)体外抗乙型肝炎病毒 (HBV)的活性。方法　以不同浓度的PAP S作用于培养的HepG2 .2 .15细胞 ,采用ELISA、荧光定量PCR法分别检测细胞上清液中的HBsAg、HBeAg及HBVDNA水平的变化 ,并用MTT比色法检测细胞成活率。结果　随着PAP S浓度的增加 ,对HBsAg、HBVDNA的抑制作用亦逐渐增强 ,不同药物剂量组之间差异十分显著 (P <0 .0 1)。PAP S处理后 96h ,PAP S对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度 (ID50 )分别为 6.9μg/ml和 3 .2 μg/ml ,半数中毒浓度 (CD50 )为 2 9.3 μg/ml,治疗指数 (TI) =ID50 /CD50 分别为 4.3和9.3。MTT试验结果显示 ,药物的细胞毒性也呈剂量依赖型 ,倒置显微镜下观察在 5 0 μg/ml～ 10 0 μg/ml剂量组出现部分细胞脱壁和死亡现象。结论　PAP S在体外有直接的抗HBV作用。。     

包膜蛋白和核心蛋白共突变体对乙型肝炎病毒在 HepG2细胞中表达的抑制作用

目的探讨包膜蛋白和核心蛋白共突变体对乙型肝炎病毒(HBV)在HepG2细胞中表达的抑制作用。方法构建包膜蛋白和核心蛋白共突变的HBV载体pHBV-mSIS／△C。瞬时转染HepG2细胞,以adwR9转染HepG2细胞为对照;用ELISA方法检测上清液中和细胞内HBV S抗原;重组载体与adwR9共转染HepG2细胞,以pcDNA3与adwR9共转染为对照组。用荧光定量PCR检测胞内和上清液中病毒量。结果突变载体转染细胞胞内和上清液中S蛋白表达量及分泌量与adwR9无明显差别;突变载体与adwR9共转染组上清液和胞内病毒量较pcDNA3与adwR9共转染组低。结论包膜蛋白和核心蛋白共突变对HBV S蛋白的表达量和分泌量没有影响,但干扰病毒复制和包装,具有抗HBV作用。     

靶向乙型肝炎病毒X区的siRNAs对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的观察siRNA对HBV基因表达和复制的抑制情况。方法针对HBVX区设计并化学合成4条siRNAs,观察在不同浓度下对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用。结果 siRNA在30nmoL/L浓度时,4种siRNA对HepG2.2.15细胞HbsAg和HBeAg无明显的抑制作用(P0.05);在60nmoL/L和90nmoL/L浓度下,siR-NA-1和siRNA-4有明显的抑制作用(P0.05),他们对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为41%和43%;siRNA能降低HepG2.2.15细胞HBVDNA的拷贝数。结论化学合成的siRNAs可以有效地抑制HBV基因的表达和复制。     

Antibody to El peptide of hepatitis C virus genotype 4 inhibits virus binding and entry to HepG2 cells in vitro

AIM: To analyze the neutralizing activity of antibodies against E1 region of hepatitis C virus (HCV). Specific polyclonal antibody was raised via immunization of New Zealand rabbits with a synthetic peptide that had been derived from the E1 region of HCV and was shown to be highly conserved among HCV published genotypes. METHODS: Hyper-immune HCV E1 antibodies were incubated over night at 4℃with serum samples positive for HCV RNA, with viral loads ranging from 615 to 3.2 million IU/ mL. Treated sera were incubated with HepG2 cells for 90 min. Blocking of viral binding and entry into cells by anti E1 antibody were tested by means of RTPCR and flow cytometry. RESULTS: Direct immunostaining using FITC conjugated E1 antibody followed by Flow cytometric analysis showed reduced mean fluorescence intensity in samples pre-incubated with E1 antibody compared with untreated samples. Furthermore, 13 out of 18 positive sera (72%) showed complete inhibition of infectivity as detected by RT-PCR. CONCLUSION: In house produced E1 antibody, blocks binding and entry of HCV virion infection to target cells suggesting the involvement of this epitope in virus binding and entry. Isolation of these antibodies that block virus attachment to human cells are useful as therapeutic reagents.     

Antibody to E1 peptide of hepatitis C virus genotype 4 inhibits virus binding and entry to HepG2 cells in vitro

AIM: To analyze the neutralizing activity of antibodies against E1 region of hepatitis C virus (HCV). Specific polyclonal antibody was raised via immunization of New Zealand rabbits with a synthetic peptide that had been derived from the E1 region of HCV and was shown to be highly conserved among HCV published genotypes. METHODS: Hyper-immune HCV E1 antibodies were incubated over night at 4 degree Celsius with serum samples positive for HCV RNA, with viral loads ranging from 615 to 3.2 million IU/ mL. Treated sera were incubated with HepG2 cells for 90 min. Blocking of viral binding and entry into cells by anti E1 antibody were tested by means of RT-PCR and flow cytometry. RESULTS: Direct immunostaining using FITC conjugated E1 antibody followed by Flow cytometric analysis showed reduced mean fluorescence intensity in samples pre-incubated with E1 antibody compared with untreated samples. Furthermore, 13 out of 18 positive sera (72%) showed complete inhibition of infectivity as detected by RT-PCR. CONCLUSION: In house produced E1 antibody, blocks binding and entry of HCV virion infection to target cells suggesting the involvement of this epitope in virus binding and entry. Isolation of these antibodies that block virus attachment to human cells are useful as therapeutic reagents.     

乙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2.2.15细胞中的亚细胞定位及转移

目的观察HepG2．2．15细胞内HBV核心蛋白的亚细胞定位及转移，了解核心蛋白的入核机制。方法2％二甲亚砜或（和）1μmol／LBay414109处理HepG2．2．15细胞4d；荧光共聚焦显微镜观察HBsAg和HBcAg在细胞内的定位；Westernblot检测胞质和胞核中的HBcAg水平；选择性PCR检测胞核内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）水平。结果二甲亚砜处理提高了胞质和胞核内的HBcAg表达及核内的cccDNA水平；Bay414109处理后胞质中HBcAg水平下降但胞核中HBcAg水平上升，cccDNA水平下降；联合应用二甲亚砜和Bay41—4109处理后HBsAg在胞质内呈条索状分布，胞质中HBcAg水平下降，但胞核内HBcAg明显上升，cccDNA水平下降。结论HepG2．2．15细胞中存在HBV核心颗粒入核障碍，游离核心蛋白易于通过核孔，二甲亚砜可促进核心蛋白进入细胞核，并有助于cccDNA的形成。     

HBV复制子pHY106-BHBV转染HepG2细胞基因表达差异

目的:研究乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱的差异,分析参与胆固醇代谢的差异表达基因.方法:应用包含20 000条人类全长基因的寡聚核苷酸芯片ImaGene3.0检测乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱差异,并选择其中参与胆固醇代谢的表达下调基因7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶,用RT-PCR方法进行验证分析.结果:基因芯片筛选出差异表达的基因,其中包括转录因子、细胞周期素、细胞因子相关蛋白、糖脂类物质代谢相关酶及细胞信号转导相关因子等,RT-PCR验证参与胆固醇代谢的几种表达差异的基因,其中7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶表达明显下调,与基因芯片分析结果一致.结论:乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系存在基因表达差异,乙型肝炎病毒感染可能通过抑制参与胆固醇代谢的7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶从而进一步影响机体胆固醇代谢.     

合并乙型肝炎病毒感染对丙型肝炎病毒核心抗原检测的影响

目的 探讨合并HBV感染对慢性HCV感染者血清丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)检出情况的影响. 方法 收集2005年12月-2009年10月慢性丙型肝炎患者和HBV/HCV合并感染者资料,检测血清HCVcAg和HCV RNA,对后者血清进行HBV DNA、HBeAg检测,分析HCVcAg检出率与HBeAg、HBV DNA定量检测的关系.用独立两组多分类的X2检验方法进行统计学分析. 结果 共收集88例慢性丙型肝炎患者和62例HBV/HCV合并感染者资料,血清HCVcAg的检出率分别为72.7％(64/88)和38.7％ (24/62),两者比较,x2= 17.358,P＜0.01,差异有统计学意义.HCV RNA检出率分别为81.8％ (72/88)和53.2％ (33/62),两者比较,x2=20.110,P＜0.01,差异有统计学意义.62例HBV/HCV合并感染者血清中,HBeAg阳性和HBeAg阴性感染者HCVcAg检出率分别为28.6％ (12/42)和60.0％ (12/20),两者比较,x2=5.641,P=0.011,差异有统计学意义.HCV RNA阳性率分别为42.9％ (18/42)和80.0％ (16/20),两者比较,X2=7.547,P＜ 0.01,差异有统计学意义.HBV DNA阳性和阴性时HCVcAg检出率分别为39.1％ (18/46)和37.5％ (6/16),两者比较,P＞0.05,差异无统计学意义.与单纯HCV感染者血清HCVcAg检出率72.7％ (64/88)比较,HBeAg阴性合并感染者为60.0％ (12/20),x2=1.266,P=0.261,差异无统计学意义;HBV DNA阴性合并感染者为37.5％ (6/16),x2=7.635,P＜0.01,差异有统计学意义.结论 HBV/HCV合并感染时HCVcAg检出率较低,可能是由于HBeAg抑制HCV的复制,从而减少HCVcAg的表达所致.