Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响

目的:用流式细胞术观察Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ,以及Th1细胞诱导因子IL-12对人外周血中性粒细胞吞噬功能的影响。方法:用不同浓度异硫氰酸荧光素(FITC)在碳酸盐缓冲液(CB,pH9.5)和磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.2)中标记大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌(金葡菌),流式细胞术检测细菌标记率。取新鲜健康成人外周血与标记细菌于37℃孵育5~20 min后,洗涤和溶血,用流式细胞术检测中性粒细胞吞噬百分率。或外周血预先分别与IL-2、IFN-γ及IL-12孵育2 h,再加标记细菌孵育5 min,流式细胞术检测中性粒细胞吞噬率,并与对照组比较计算吞噬增加比率。结果:FITC标记大肠埃希菌在碱性的CB中标记率较高,而金葡菌在中性的PBS标记率较高(P<0.01)。健康人外周血中性粒细胞对大肠埃希菌和金葡菌的吞噬率在5 min时分别为45%和38%,15~20 min达到平台期,分别为86%~88%和83%~89%。外周血预先用IL-2(20u/ml)、IFN-γ(50 u/ml)或IL-12(30 u/ml)作用后,中性粒细胞对大肠埃希菌的吞噬率分别增加19%、19%和26%;对金葡菌的吞噬率分别增加25%、23%和35%。结论:Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及Th1型诱导细胞因子IL-12均能增强人中性粒细胞吞噬功能,Th1型细胞因子和IL-12均具有增强中性粒细胞功能的作用。     

白细胞介素-10对小鼠中性粒细胞吞噬和杀菌活性的影响

目的: 探讨白细胞介素-10(IL-10)对中性粒细胞(PMN)吞噬和杀菌活性的影响,以了解IL-10对非特异性免疫的作用机制。方法: 小鼠麻醉后从眼球取血,与不同浓度IL-10在37℃水浴中作用2 h,然后加FITC标记大肠埃希菌,置37℃水浴中15 min,溶血剂去除红细胞,流式细胞仪检测各IL-10浓度组PMN的吞噬率。小鼠麻醉后局部消毒,摘眼球,无菌方法取血。与不同浓度IL-10在37℃下作用2 h,然后加大肠埃希菌置37℃水浴1 h,同时设PMN杀菌0 min组、无IL-10的PMN杀菌对照组,各组样品作适当稀释后接种琼脂平板,最后观察各组菌落数,与对照组比较,计算IL-10对杀菌力影响。结果: PMN的吞噬功能在IL-10浓度为1 ng/ml组减低(15.87 ±14.25)%,但差异无统计学意义(P > 0.05)。而PMN的杀菌功能在IL-10浓度为0.1 ng/ml组降低(39.59 ±37.36)%,在IL-10浓度为1 ng/ml组则降低(42.28 ±22.24)%,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论: IL-10对PMN的吞噬功能有轻度的抑制作用,对PMN的杀菌功能有明显的抑制作用,对非特异性免疫亦有抑制作用。     

粉被虫草抗紫外线及对巨噬细胞吞噬功能影响的初步研究

目的:研究粉被虫草抗紫外线及对巨噬细胞吞噬功能的影响。方法:采用孔雀绿比色法测定粉被虫草菌丝体水提物在体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。同时采用紫外线辐射的方法测定其对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌抗紫外线辐射的保护效应。结果:粉被虫草菌丝体水提物在较高浓度下能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,但在较低浓度下却能拮抗氢化可的松对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的抑制;对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌抗紫外线辐射具有一定的保护效应。结论:粉被虫草菌丝体水提物能调节巨噬细胞吞噬功能和抗紫外线辐射。     

医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用

目的 研究医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用,为医用臭氧的临床应用提供依据.方法 取实验菌用金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌于无菌牛理盐水中制备菌悬液,麦氏比浊法调整含菌量,以不同浓度医用臭氧在不同时间点分别作用于两种菌悬液.计算两种细菌的杀灭率.结果 不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有较高的杀灭率,浓度越高对细菌的杀灭率越高(F=5278.00,3293.26,5743.73,P<0.05);同一医用臭氧浓度作用下,随着作用时间延长,金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均显著提高,作用时间大于或等于10min时,两种细菌的杀灭率均为100%.结论 一定浓度下医用臭氧作用10min以上可有效杀灭体外中的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌,提示可在允许条件下,通过提高医用臭氧浓度及作用时间,增强杀菌效果.     

五黄膏抑菌作用的实验研究

目的:观察五黄膏的抑菌作用。方法:制备五黄膏制剂,取样进行细菌培养和抑菌实验,以凡士林为对照,观察五黄膏对标准菌株和临床菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌)抑菌作用。结果:五黄膏制剂取样培养无细菌生长,抑菌实验证实其对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌标准菌株均具有明显抑菌作用,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌临床菌株有显著抑菌作用(P<0.01)。结论:五黄膏体外对标准菌株和临床菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌)具有抑菌作用。     

人乳吞噬细胞与三种细菌的相互作用

检测了人乳吞噬细胞对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌的杀菌效果,并结合扫描电镜和透射电镜观察初乳吞噬细胞与三种细菌相互作用的形态变化。结果表明,母乳吞噬细胞具有相当的吞噬能力、且对大肠埃希氏菌和铜绿假胞菌在2小时内的持续杀菌效果明显优于对金黄色葡萄球菌。观察到母乳吞噬细胞胞浆中存在的大量脂肪空泡在吞噬杀菌过程中与吞噬溶酶体融合的现象,提示母乳吞噬细胞在母乳抗感染保护机制中的独特作用和意义。     

流式细胞术检测大鼠肺泡巨噬细胞吞噬荧光标记细菌的方法学探讨

目的建立流式细胞术检测大鼠肺泡巨噬细胞(AM)吞噬AlexaFluor 488(AF488)荧光染料标记细菌的方法。方法用不同浓度的AF488标记金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌,流式细胞术检测AF488对上述细菌的标记率和平均荧光强度;AM与不同浓度比例的AF488标记的细菌于37℃共孵育2、4、6和8 h,洗涤后加台盼蓝淬灭未被吞噬的细菌荧光,流式细胞术检测AM平均荧光强度、吞噬率和吞噬指数;激光共聚焦荧光显微镜下观察AM吞噬细菌的情况及分布。结果 AF488的浓度大于50μg/mL时,金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的标记率均大于92%(P0.05),金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的标记率在荧光染料浓度大于50μg/mL便已迅速达到上限。随着孵育时间的延长,AM的吞噬率从孵育2 h的20.4%升高到8 h的76.5%。随着细菌比例的增加,AM的吞噬率从1∶10的7.7%升高到1∶300的85.1%。结论流式细胞术检测AM吞噬AF488荧光染料标记的细菌是测定AM吞噬活性的有效方法,但染料浓度、孵育时间和细菌比例均会对结果产生影响。     

应用二醋酸酯荧光素与碘化丙啶的流式细胞术分析三种细菌的活性

目的:探讨在流式细胞术中应用二醋酸酯荧光素(FDA)与碘化丙啶(PI)分析金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌活性的性能。方法:选取对数生长期金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌临床分离株各20株,制备1麦氏浊度菌悬液2支(约2 ml/支);1支于85℃水浴30 min灭活,获取死菌菌液;分别应用FDA(0.5μg/m L)、PI(5μg/m L)两种荧光染料对死、活菌菌液进行染色(两种染料的染色时间分别为30 min和15 min);以不染色死菌液作为对照,应用流式细胞术检测经两种染料染色死、活菌菌液及不染色死菌液的平均荧光强度(FMI),对比分析其FMI均值水平。结果:以FDA为染料,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的无染料管、活菌管、死菌管FMI均值水平无差别,结核分枝杆菌活菌管FMI均值水平(129.61±8.69)明显高于死菌管(3.34±0.11)及无染料管(0.33±0.02);以PI为染料,结核分枝杆菌的无染料管、活菌管、死菌管FMI均值水平无差别,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的死菌管FMI均值水平[(48.33±2.13)、(25.92±1.21)]明显高于活菌管[(1.87±0.12)、(2.14±0.07)]和无染料管[(1.14±0.09)、(1.12±0.04)]。结论:FDA能较好指示结核分枝杆菌活性,PI能较好指示金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的活性。     

不育症精液细菌感染分布特点及其对精液常规质量参数的影响

目的 通过对男性不育症患者精液细菌培养,精液常规分析,了解男性不育症患者精液细菌感染率、菌种分布、细菌的耐药率以及细菌感染对精液常规各主要参数的影响。 方法 对来浙江中医药大学附属宁波中医院男科门诊就诊的325例不育症患者的精液进行细菌培养、鉴定及药敏分析,并采用北京伟力计算机辅助精子分析系统对精液进行常规分析,以了解精液细菌感染分布以及对精液常规各主要质量参数的影响。 结果 325例男性不育症精液分离出127株细菌,感染率为39.1%,其中G+球菌占59.9%,以葡萄球菌为主。G-杆菌占22.0%,以大肠埃希菌为主。药敏分析发现,葡萄球菌对头孢菌素类、大环内酯类耐药率较高;大肠埃希菌对氨苄西林和复方新诺明耐药率较高。精液细菌各感染组与正常男性对照组对精子浓度、存活率、前向运动比率以及液化时间这四个质量参数进行比较,淋病奈瑟菌组的精子浓度较其他感染组显著降低(P<0.01);金黄色葡萄球菌组和大肠埃希菌组的精子存活率较其他感染组显著降低(P<0.01);金黄色葡萄球菌组、大肠埃希菌组和淋病奈瑟菌组的精子前向运动比率与其他感染组比较差异有统计学意义(P<0.01);大肠埃希菌组的液化时间较其他感染组延长(P<0.05)。 结论 男性不育症精液细菌培养以G+球菌分离率较高,超过大肠埃希菌的分离率;各主要感染组中凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及淋病奈瑟菌对精液常规各主要参数的影响各有特点,需加以关注。      

血液和骨髓标本中常见细菌及耐药性分析

目的:分析血液和骨髓标本中常见细菌分布及耐药性,为临床用药提供依据.方法:采用K-B纸片法对883株细菌进行药敏试验.结果:主要细菌有凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRScn)分别为15.6%和72.9%;产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌发生率为25.3%,10.9%.结论:细菌的耐药性变迁是治疗感染,特别是菌血症和重症感染的关键问题.     

流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌的方法学探讨

目的：建立流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）的方法。方法：用不同浓度荧光素（FITC）标记Mtb,流式细胞术检测FITC对Mtb的标记率。健康人外周全血与FITC标记Mtb（FITC-Mtb）于37℃共孵育10~120 min,溶解红细胞,洗涤后加台盼蓝淬灭未吞噬的FITC-Mtb的荧光,流式细胞术检测FITC阳性单核细胞的数值,计算单核细胞对Mtb的吞噬率。FITC-Mtb与佛波醇酯（PMA）激活分化的THP-1细胞以10∶1的比例共孵育1~6 h,或以1∶1~100∶1的比例孵育1 h和2 h,用同样的方法检测吞噬率。结果：FITC（50μg/ml）与Mtb作用2 h的标记率达92%。人单核细胞对FITC-Mtb的吞噬率从10 min的34.68%增加至120 min的79.90%。THP-1细胞对FITC-Mtb的吞噬率从1 h的30%增加至6 h的81%。FITC-Mtb与THP-1细胞以100∶1比例孵育1 h,吞噬率达平台（81%）;以50∶1的比例孵育2 h,吞噬率达平台（82%）。未加台盼蓝淬灭时,单核细胞在10 min和120 min对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比,分别增加29%和6%;而未加台盼蓝淬灭时,THP-1细胞在1 h和6 h对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比分别增加1%和7%。结论：流式细胞术检测人单核巨噬细胞吞噬FITC标记Mtb是测定单核巨噬细胞对Mtb吞噬活性的简便、快速和重复性好的方法。     

乳酸盐与丙酮酸盐腹膜透析液对外周血中性粒细胞凋亡的影响

目的 :比较研究乳酸盐与丙酮酸盐腹膜透析 (腹透 )液对外周血中性粒细胞 (PMN)凋亡以及吞噬和杀菌能力的影响。方法 :含有不同浓度 (1.5 % ,4.2 5 % )葡萄糖的乳酸盐或丙酮酸盐腹透液 ,与外周血 PMN孵育不同时间 (10 ,30 m in)后 ,利用流式细胞术及荧光素标记的 Annexin- 检测细胞凋亡情况 ;通过菌落计数方法观察 PMN对金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )吞噬和杀菌功能的改变 ,分别以细胞外和细胞内活菌下降的百分数表示。 结果 :PMN与 1.5 %乳酸盐腹透液 (p H6 .7)孵育 10min,收集细胞 ,培养 72 h后细胞凋亡率与正常对照组比较无差异 ,而孵育时间延长至 30 min后 ,培养的 PMN在 72 h凋亡率[(6 6 .90± 2 .35 ) % ]明显增加 ,与 4.2 5 %乳酸盐腹透液 (p H7.2 ) 10 m in组结果相似 [(6 5 .36± 2 .6 0 ) % ];1.5 %葡萄糖乳酸盐腹透孵育 30 m in及 4.2 5 %葡萄糖乳酸盐腹透液孵育 10 m in组 ,PMN的吞噬及杀菌功能均较对照组显著降低。无论是含1.5 %还是 4.2 5 %葡萄糖的丙酮酸盐腹透液 ,PMN凋亡率均与对照组无显著差异 ;对 PMN吞噬和杀金葡菌功能也无显著影响。 结论 :丙酮酸盐腹透液对外周血 PMN凋亡以及吞噬和杀菌功能的影响均较小 ,具有较好的临床应用前景     

大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7 异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用。方法：复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔。4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行 gG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定。应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记。比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合
理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果。结果：HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的最佳纯化方法为35%、100%二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25　600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,最佳FITC与蛋白量比值为1∶10,最佳标记反应条件为20℃、2 h。由最佳条件制得的荧光抗体与E.coliO157∶H7反应明显 ,强荧光连续照射15 min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡
萄球菌反应。结论：本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coli O157：H7 FITC标记多克隆抗体,为E.coli O157：H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤。
     

异硫氰酸荧光素标记的蚓激酶纳米粒的分离

目的 :分离除去蚓激酶白蛋白纳米粒溶液中未成粒的BSA ,利于FITC标记在纳米粒上 ;分离除去未与蚓激酶纳米粒结合的FITC ,降低FITC对检测荧光纳米粒的影响。方法 :采用SephadexG - 1 0 0和SephadexG - 5 0凝胶柱分离纯化。结果 :流速为 3ml/min时 ,SephadexG - 1 0 0柱 (2 1 .5cm ,φ1 .9cm)能够分离除去 (2 9.3± 3.6 ) %未形成纳米粒的BSA ;流速为 0 .2 5ml/min时 ,SephadexG - 5 0凝胶柱 (1 0cm ,φ2cm)可以完全分离除去未与纳米粒结合的FITC。结论 :通过分离 ,FITC有效地标记在纳米粒上 ;降低了背景荧光 ,使荧光纳米粒在荧光显微镜下清晰显现。     

脂多糖调控PI3K/Akt通路增强中性粒细胞吞噬功能

目的: 探讨脂多糖对中性粒细胞细菌吞噬功能的影响及可能机制。方法: 取健康人静脉血中性粒细胞,重悬分为对照组、脂多糖10 min、20 min、30 min组,按1 ∶50加入大肠埃希菌GFP(25922GFP),孵育30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测中性粒细胞的吞噬功能;另取中性粒细胞重悬分为对照组、脂多糖组、LY294002(PI3K抑制剂)组、LY294002+脂多糖组,一部分细胞行丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)荧光染料染色,流式细胞术观察与分析细胞中F actin,荧光显微镜观察中性粒细形态;另一部分细胞按1 ∶50加入25922GFP,孵育30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测中性粒细胞的吞噬功能。免疫印迹法检测各组细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和磷酸化磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)的表达。结果： 与对照组比较,脂多糖10 min、20 min、30 min组中性粒细胞25922GFP荧光表达逐渐增强,p-PI3K和p-Akt表达逐渐增加;脂多糖组荧光强度和p-PI3K和Akt表达明显高于对照组(P均＜0.05)。与对照组比较,脂多糖组F-actin表达增加,细胞形态改变,LY294002组和LY294002+脂多糖组细胞形态无明显改变,LY294002+脂多糖组F-actin表达明显低于脂多糖组(P＜0.05);对照组、LY294002组和LY294002+脂多糖组p-Akt表达明显低于脂多糖组。结论： 经脂多糖刺激后中性粒细胞吞噬功能增强,其机制可能与脂多糖促进PI3K/Akt通路磷酸化有关。     

多壁碳纳米管抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能

目的 观察多壁碳纳米管（MWCNT）对巨噬细胞吞噬功能的影响.方法 采用常规细胞培养技术培养RAW264.7巨噬细胞;用流式细胞术定量检测RAW264.7巨噬细胞吞噬异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌（FITC-tagged E.coli k-12）的情况.结果 MWCNT剂量依赖性地抑制RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌,随着MWCNT浓度的增加,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量（用平均荧光强度表示）降低.此外,MWCNT抑制RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌亦呈时间依赖性：用MWCNT（75 μg/ml）孵育RAW264.7细胞12h后,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量与对照组相比降低了约70.4％ （P ＜0.01）,同时参与吞噬活动的RAW264.7细胞的百分比也从对照组的98.6％降低到了92.4％ （P＜0.05）.即使用低剂量的MWCNT（25 μg/ml）孵育RAW264.7细胞较长时间（24h）后,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量与对照组相比仍降低了约77.1％ （P ＜0.01）,同时参与吞噬活动的RAW264.7细胞的百分比也从71.2％降低到了43.4％ （P ＜0.01）.用脂多糖（LPS,10μg/ml）激活RAW264.7细胞后,其吞噬能力明显增强,而MWCNT仍可剂量依赖性地抑制LPS激活的RAW264.7细胞的吞噬能力,与LPS组相比,MWCNT（75 μg/ml）和LPS共孵育组吞噬大肠杆菌的量降低了70.9％ （P ＜0.01）.结论 MWCNT可明显抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能.     

胞内磷酸化蛋白酪氨酸激酶的流式细胞术检测

目的: 建立流式细胞术检测细胞内磷酸化蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的方法。方法: 用佛波醇酯(PMA)及植物血凝素(PHA)刺激Jurkat细胞,用两种不同的固定和透膜方法处理细胞,加磷酸化PTKs特异性单抗P-Tyr-100及FITC标记的二抗,建立胞内磷酸化PTKs的流式细胞检测技术;同时,用免疫印迹方法检测磷酸化PTKs以资对照。用双色荧光技术,对结核杆菌抗原(Mtb-Ag)活化的外周血单个核细胞(PBMC)中的γδT细胞进行胞内PTKs分析。结果: PHA及PMA刺激能够使Jurkat细胞中磷酸化PTKs明显增加,流式细胞术与免疫印迹方法检测的结果一致。通过双色荧光技术检测发现,Mtb-Ag刺激PBMC,可以优先诱导γδT细胞胞内PTKs的活化。结论: 利用流式细胞术可在单细胞水平分析细胞内PTKs的磷酸化状态。