流式细胞术测定食蟹猴血清中抗间充质干细胞抗药抗体及其应用

目的 建立一种准确、快速且灵敏度高的流式细胞法检测食蟹猴血清中抗间充质干细胞抗药抗体。方法 取间充质干细胞悬液,离心、洗涤后,加入阳性质控样品溶液或待测样品溶液与间充质干细胞孵育后,加入荧光标记的Protein L-PE溶液进行孵育,洗掉未结合的Protein L-PE,流式方法检测PE平均荧光强度。结果 该方法灵敏度为115.54 ng·mL^-1,远高于非临床研究要求的250～500 ng·mL^-1。批内和批间的精密度<20%,其他方法验证考察项结果均符合相关接受标准。结论 该方法灵敏度高,特异性强,样品操作简单,可用于快速检测食蟹猴血清中抗间充质干细胞的抗体,适用于间充质干细胞在食蟹猴体内的免疫原性研究。     

磁性免疫微球在人血清白蛋白纯化中的应用

目的为了快速地从人血清中提纯人血清白蛋白，利用磁性免疫微球作为提取手段，再用间接酶联免疫法测定人血清白蛋白的回收率。方法将经过羧基修饰的聚苯乙烯微球作为载体，用EDC(碳化亚胺)活化微球表面的羧基，再将兔抗人血清白蛋白抗体包被于微球上，这种微球-抗体复合物能特异性地捕获人血清白蛋白，磁分离复合物后，通过将兔抗人血清白蛋白抗体作为捕获抗体，将酶联羊抗人血清白蛋白抗体作为检测抗体，建立起间接酶联免疫法，用于检测人血清中和磁性免疫微球上吸附人血清白蛋白的浓度，得到微球从人血清中提纯人血清白蛋白的回收率。结果第1次提纯的回收率为(86±4)%，重复利用微球2次，回收率分别为(69.0±0.6)%和(40.8±0.8)%，而提纯的人血清白蛋白的纯度为90%。结论以上结果表明，免疫磁性微球提纯人血清白蛋白的实验是有效的，为工业上大规模提纯人血清白蛋白提供了一条新的思路。     

ELISA法测定大鼠血浆中抗体偶联药物浓度及药代动力学研究

目的:建立检测大鼠血浆中抗体偶联药物(ADC006M)[重组抗人表皮生长因子受体2(HER2)结构域Ⅱ人源化单克隆抗体-单甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶联剂]浓度的酶联免疫吸附分析法(ELISA),并用于研究单次静脉注射的药代动力学特征。方法:基于ELISA的检测原理，在96孔板上预先包被抗MMAE抗体，加入待测样品，用HRP标记的抗体B1G7(B1G7-HRP)进行检测，加入TMB底物显色，终止反应后，在酶标仪450 nm/630 nm波长处读取吸收度(A),并参考相关法规进行方法学验证。同时，单次静脉注射给予SD大鼠5 mg·kg^-1ADC006M测定其血浆浓度，对测定结果进行曲线拟合并计算药代动力学参数。结果:确定方法的线性范围为31.25～2 000 ng·mL^-1,定量限为31.25 ng·mL^-1;方法批内、批间准确度RE分别在-14.6%～12.6%和-13.1%～-0.7%,批内、批间精密度RSD均≤12.6%;方法的选择性(基质效应)、特异性、稀释线性与钩状效应以及各项稳定性考察结果均良好。通过对SD大鼠...     

HPLC-MS/MS法测定人血清中奋乃静浓度及其临床应用

目的采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)建立测定人血清中奋乃静浓度的方法。方法色谱条件:色谱柱为Aglient XDB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8μm);流动相为甲醇-水(90∶10,V/V,2 mmol·L^-1甲酸铵);流速为0.7 m L·min^-1;柱温35℃;进样量10μL。采用乙腈蛋白沉淀法前处理血清样本,定量离子对分别为m/z 404.15→m/z 171.15(奋乃静)和m/z 412.15→m/z 179.15(奋乃静-d8)。采用该方法对52例233份精神分裂症患者多次口服奋乃静后稳态药物浓度进行监测。结果奋乃静标准曲线方程为Y=2.014X-0.012 8(R2=0.998 6),线性范围为0.10~10.00 ng·mL^-1。定量下限(0.10 ng·mL^-1),低(0.30 ng·mL^-1),中(3.00 ng·mL^-1),高(7.50 ng·mL^-1) 4个浓度的质控样品的批内和批间精密度RSD<15%,提取回收率分别为101.11%,95.37%,96.52%,101.32%。结论使用HPLC-MS/MS法检测奋乃静的血药浓度具有灵敏度高、可操作性强、结果准确度高等优点,可用于临床上奋乃静的血药浓度监测。     

反相高效液相色谱法测定人血浆百草枯浓度及其临床应用

目的建立一种测定人血浆中百草枯浓度的高效液相色谱法,并用于临床百草枯中毒患者的血浆药物浓度测定。方法血浆样品用WCX固相萃取柱预处理,反相高效液相色谱法进样测定。色谱柱:Diamonsil C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:0.1 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲溶液(含80 mmol·L^-1庚烷磺酸钠,磷酸调pH=3.0)-乙腈=80∶20,流速:1.0 mL·min^-1,检测波长:258 nm,柱温:25℃。考察该方法的专属性、标准曲线和定量下限、精密度与回收率和稳定性。结果百草枯血浆浓度在20~5000 ng·mL^-1内线性关系良好(r=0.999 9),定量下限为20 ng·mL^-1,提取回收率为97.66%~99.11%,方法回收率为90.06%~104.50%,日内和日间精密度的RSD值均<4.00%,4℃放置8 h、反复冻融3次和低温冷冻21 d稳定性良好。测定临床血浆样本并计算百草枯中毒严重指数(SIPP),可辅助百草枯中毒患者的临床治疗并预测预后。结论该方法检测速度快,准确度、灵敏度高,可用于临床百草枯中毒患者血浆样品的检测,准确预测治疗的预后效果。     

胃蛋白酶原光激化学发光免疫测定方法的建立

目的建立一种检测人血清胃蛋白酶原浓度的光激化学发光免疫测定方法。方法采用双抗体夹心法建立检测人血清中胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ浓度的方法,评估其分析灵敏度、回收率和批内精密度,并与雅培(化学发光法)进行比较。结果胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ的分析灵敏度分别为0.8ng/mL和0.6ng/mL,回收率分别为100.3%、106.5%,批内变异系数(CV)为0.93%~4.1%、1.2%~4.3%,与化学发光法的相关性较好(r=0.99)。结论该方法测定胃蛋白酶原具有较高灵敏度、精密度和准确性,适用于临床。方法建立后可进一步进行长期稳定性试验。     

高效液相色谱法测定人血浆中伏立康唑的含量

目的建立高效液相色谱法测定人血浆中伏立康唑浓度的方法学。方法色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C₁₈,柱温:40℃,流速:1 mL·min^-1,流动相:甲醇-水=55∶45,检测波长:254 nm,内标:对氯苯乙酰胺。考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、精密度与回收率、稳定性。结果血浆中内源性杂质对样品测定无干扰,血浆中伏立康唑在0.1~10.0μg·mL^-1内线性良好(r=0.999 2),最低检测浓度为0.1μg·mL^-1。血浆中伏立康唑日内、日间RSD均<10%,提取回收率为89%~92%。结论本方法简便、灵敏、准确、高效,适用于人体内伏立康唑的浓度监测。     

反相高效液相色谱法测定2型糖尿病人群血浆中盐酸二甲双胍浓度

目的：建立盐酸二甲双胍血药浓度测定的反相高效液相色谱法,并测定2型糖尿病人群血浆中盐酸二甲双胍药物浓度。方法：建立反相高效液相色谱法测定盐酸二甲双胍血药浓度,以阿替洛尔为内标,并考察方法学的专属性、线性、定量下限、精密度、准确度、回收率和稳定性。12名2型糖尿病患者连续服药3天以上,利用反相高效液相色谱法测定血浆中盐酸二甲双胍的稳态谷浓度和稳态峰浓度。结果：盐酸二甲双胍在血浆中浓度线性范围是0.2~5 μg·mL^-1,标准方程为Y=1.153X+0.036 6 （R²=0.999 9）,定量下限为0.2 μg·mL^-1。准确度（RE）在±5.58%以内,批内、批间精密度（RSD） ≤ 9.96%,提取回收率在65%~76.9%之间。治疗药物监测显示,12名2型糖尿病患者稳态谷浓度平均值为0.87 μg·mL^-1 （0.4~1.39 μg·mL^-1）,稳态峰浓度平均值为2.47 μg·mL^-1（0.7~3.41 μg·mL^-1）。结论：该法专属性强,灵敏度高,适用于2型糖尿病人群二甲双胍治疗药物监测。     

超高效液相色谱-质谱联用法检测人全血中氯喹、羟氯喹、阿比多尔及其临床应用

目的: 建立并验证一种人全血中氯喹、羟氯喹、阿比多尔的检测方法,并将其用于临床检测。方法: 全血样本经氯化铵裂解和乙腈蛋白沉淀后,采用液相-串联质谱联用仪测定。色谱柱为BEH C₁₈,以含0.5%甲酸乙腈溶液-0.5%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速为0.4 mL·min^-1,电喷雾正离子模式,多反应监测。结果: 氯喹、羟氯喹、阿比多尔在8~1 600 ng·mL^-1线性关系良好;批内和批间精密度(RSD)均在12.71%以内,批内和批间准确度(RE)均在-7.12%~13.51%;提取回收率均在76.50%~92.49%;内标归一化的基质因子变异系数(RSD)均小于15%;在多种储存条件下,处理前后的样品稳定性良好。结论: 该方法专属性强,准确度高,重复性好,可用于3种药物治疗药物监测及中毒检测。     

血小板胞内摄取莪术二酮的实验研究

目的:通过对血小板胞内摄取莪术二酮的研究,为进一步阐明莪术中抗血小板活性成分的作用途径提供实验依据。方法:建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法检测血小板中莪术二酮的浓度并对其方法学进行验证;体外实验采用人洗涤血小板与不同浓度莪术二酮共培养,LC-MS/MS筛选血小板胞内摄取莪术二酮的最佳条件。体内实验通过采集莪术二酮溶液灌胃小鼠的血样和莪术油注射液滴注的临床患者血样,分步离心法提取血小板,LC-MS/MS检测血清与血小板胞内莪术二酮浓度。结果:莪术二酮质量浓度在1～200 ng·mL^-1范围内呈现良好线性(r=0.997 5);定量限为0.4 ng·mL^-1;方法的批内精密度与批间精密度均<5.0%,准确度均<8.8%;提取回收率在93.1%～110.2%。体外实验结果显示在血小板计数相同的条件下,莪术二酮(1、0.5、0.25 mmol·L^-1)均能在血小板裂解液中检测到;体内实验结果显示灌胃小鼠和给药患者的血小板裂解液、血清中均检测有莪术二酮;实验证明莪术二酮在体内外均可被血小板结合和摄取。结论...     

注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究

目的通过对注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法进行研究,建立该药物的生物学活性检测方法。方法参考重组人干扰素生物学活性测定法,以人羊膜细胞(WISH)病变抑制法开展注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法研究。结果该方法的专属性好,精密度试验中生物学活性相对标准偏差(RSD)为10.6%,准确性试验平均回收率98.2%,RSD为9.0%,符合生物制品质量检验方法要求。结论本研究制定的实验方法准确、可靠,适用于注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测。     

牛奶过敏患者血清特异性抗体检测方法构建

目的:建立双抗原夹心酶联免疫法检测疑似牛奶过敏患者血清特异性抗体。方法:将4种牛奶过敏原P1组分、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白按质量比3:1:4:2混合作为包被抗原制备酶标反应板;同时4种成分分别标记辣根过氧化物酶制备酶标记抗原,经棋盘滴定确定酶标抗体浓度并最终建立双抗原夹心酶联免疫法检测牛奶特异性抗体。以阴性对照在450nm波长处吸光度(A450)的2.1倍为临界点判定阴、阳性结果,并以德国MEDIWISS酶免疫印记检测试剂检测结果为参比标准计算灵敏度与特异度。结果:本文建立的双抗原夹心酶联免疫法批间精密度为5.8%～13.6%,批内精密度为3.7%～11.3%。与参比方法比对,灵敏度为91.7%,特异度为94%,准确度为93.3%。结论:本文建立的双抗原夹心酶联免疫法可检测血清牛奶特异性抗体,用于牛奶过敏患者的体外诊断。     

胶体金免疫层析法快速检测中药材中除草剂扑草净残留

目的:基于自制的扑草净抗原和单克隆抗体,建立了一种适用于快速检测中药材、饮片中三嗪类除草剂扑草净残留的免疫层析方法。方法:确定了抗体偶联量为7μg,稀释液配制条件为含1%OVA,0.1%Tween-80的0.1 mol·L^-1 PBS优化条件,并采用T线划线浓度为0.05 mg·mL^-1,C线划线浓度为0.5 mg·mL^-1的湿法试纸条,提升胶体金免疫层析试纸条的灵敏度,降低不同用药部位中药的基质效应,并进行大批量中药材检测。结果:试纸条检测灵敏度可达到1 ng·mL^-1,实际样品检出限可达到0.1 mg·kg^-1,所建立的方法适用于陈皮、蒲公英、三七、金银花等中药材中40种不同部位扑草净残留检测。对10批西洋参、5批山药、12批三七、5批黄芪、3批沙参、4批牛膝、14批菊花、9批生姜、6批菟丝子进行了实际样品快速检测,均未检出扑草净残留。结论:本方法检测方法快速准确,前处理简便,操作简单,推广性强,可作为现场快速筛查扑草净残留的有效手段,以保证中药材的质量和安全性。同时,该研...     

检测抗水痘-带状疱疹病毒抗体的糖蛋白ELISA的建立和初步验证

目的 建立抗水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)抗体的VZV糖蛋白(glycoprotein,gp) ELISA(VZVgp ELISA),提高抗VZV抗体的检测灵敏度.方法 将收获的VZV进行超声破碎和亲和层析,得到纯化的VZVgp.以VZVgp作为包被抗原,用筛选的高滴度抗VZV抗体阳性血清摸索ELISA的相关条件来建立VZVgp ELISA,并验证该法的特异性、精密度和灵敏度.同时将建立的VZVgp ELISA与同类进口试剂盒进行比较.结果 成功建立了检测抗VZV抗体的VZVgp ELISA,该法特异性强、精密度好(变异系数＜10％)、灵敏度高,与国外同类试剂盒检测结果间的差异无统计学意义(x2=1.310,P=0.252).结论 建立的VZVgp ELISA特异、灵敏,可用于人群血清抗VZV抗体的筛查和VZV感染的流行病学调查.     

双抗原夹心酶联免疫法检测抗白细胞介素-3的抗体

目的 :建立一种多用途、快速简便和易行的检测抗白细胞介素 3(IL 3)抗体的酶联免疫检测方法。方法 :以高纯度的基因工程人白细胞介素 3(rhIL 3)包被酶标板 ,以辣根过氧化物酶标记rhIL 3,建立了检测抗rhIL 3抗体的一步法双抗原夹心法。结果 :特异性 :与相似的蛋白分子 (其它细胞因子抗体 )无交叉反应 ,实验动物和人的正常血清反应呈阴性。灵敏度 :最低检出限为抗IL 3的单抗 5ng/ml。精密性 :组间和组内变异系数均 <1 2 %。应用于rhIL 3长期毒性实验取得良好的检测效果。结论 :此法特异性强、灵敏度高、方法稳定、操作简便 ,与其它细胞因子的单抗无交叉反应 ,能在同一条件下检测不同种属动物血清中的IL 3抗体 ,用于IL 3长期毒性实验等明显优于间接酶联免疫法。     

泰它西普免疫原性分析方法建立及验证

目的:建立桥式酶联免疫吸附法测定食蟹猴血清中抗药抗体(anti-drug antibody, ADA)和竞争酶联免疫吸附法测定中和抗体(neutralizing antibody, NAb),并进行方法学验证。方法:桥式酶联免疫吸附法在96孔板预包被泰它西普(代号：RC18),与待测样品中的抗RC18抗体结合形成复合物,依次加入生物素化的RC18(Biotin-RC18)、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP)和四甲基联苯胺底物(TMB)显色,终止反应后在酶标仪450 nm/630 nm波长处读取吸收度。竞争酶联免疫吸附法在96孔板预包被B细胞激活因子或增殖诱导配体蛋白,加入与Biotin-RC18预混合的样品,形成B细胞激活因子或增殖诱导配体-抗RC18抗体-Biotin-RC18三者的复合物,依次加入SA-HRP和TMB显色,终止反应后在酶标仪上读取吸收度。结果:桥式酶联免疫吸附法线性范围的精密度≤12.32%,灵敏度为50 ng·mL^-1,筛选临界阈值为0.937,确证临界阈值为23.62%。竞争酶联免疫吸附法方法线性范围的精密度≤20%,灵敏度为31...     

高尔基蛋白73(GP73)ELISA定量检测方法的建立及临床应用

目的 建立双抗体夹心ELISA定量检测人血清高尔基蛋白73(GP73)的方法,并用于检测血清GP73含量.方法 利用杂交瘤法制备纯化的抗GP73单克隆抗体(mAb)进行辣根过氧化物酶(HRP)标记后,通过棋盘滴定法确定包被抗体和酶标抗体及其最适工作浓度;以重组人的GP73抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收率实验评价ELISA方法.应用该ELISA法对正常人、肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中的GP73水平进行定量检测.结果 当抗GP73 mAb 3D5A10和7H3F5分别为捕获抗体和酶标抗体、工作浓度分别为40 μg/ml和1∶ 4000时,双抗体夹心ELISA法最优.该方法的平均批内和批间变异系数分别为4.6％和7.6％,灵敏度达3.76 ng/ml,平均回收率为(102.2±5)％.用本方法重复测定肝癌(33例)、肝硬化(28例)、乙型肝炎(44例)及正常人(44例)血清样本中GP73浓度(中位数)分别为25.9、27.6、16.7、9.9μg/L;除肝癌与肝硬化组间差异无统计学意义外,其余各组间均有统计学差异(P＜0.05).结论 成功建立了双抗体夹心ELISA定量检测GP73的方法.检测血清GP73可作为诊断肝脏疾病的重要辅助手段之一.     

心肌肌钙蛋白Ⅰ自身抗体间接酶联免疫吸附分析法的建立

目的建立以重组心肌肌钙蛋白I-C(cTnI-C)融合蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附分析法(ELISA),检测人血循环中的抗cTnI自身抗体,为判断心肌损伤的预后提供依据。方法采用自行构建表达的cTnI-C融合蛋白作为包被抗原,以棋盘法优化实验条件,建立检测人血清cTnI自身抗体的间接ELISA方法。采用建立的间接ELISA法在121例急性心肌梗死(AMI)中筛查抗cTnI自身抗体,并用蛋白印迹法(WB)进行确证。结果 121例AMI血清抗cTnI抗体的阳性率为10.74%,ELISA试验的灵敏度100%,特异性95.37%,Kappa值为0.815。结论以cTnI-C融合蛋白作为包被蛋白建立的间接ELISA法具有良好的敏感度、特异性,可用于人血清抗cTnI自身抗体的筛查。     

水痘-带状疱疹病毒膜抗原荧光抗体试验的建立与评价

目的  建立用于检测血清中水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV)特异性抗体的膜抗原荧光抗体（fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA）试验并对其进行验证和评价。方法  用VZV感染细胞作为抗原制备抗原载玻片,以异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG为二抗建立FAMA试验。对试验的灵敏度、特异性和重复性进行验证。用FAMA试验和市售ELISA试剂盒对200份血浆样品中的抗VZV抗体进行检测。采用Spearman秩相关检验对两种方法的检测结果进行比较。结果 FAMA试验的灵敏度为0.04 IU/ml,与常见的人疱疹病毒（单纯疱疹病毒1和2型、人巨细胞病毒）没有交叉反应且重复性良好。经FAMA试验检测,200份血浆样品的抗体阳性率为93.5%,抗体几何平均效价为1:18.1,检测结果与市售ELISA试剂盒的符合率为90.0%。两种方法的检测结果具有相关性,Spearman秩相关系数为0.49,P<0.000 1。结论  建立的方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性,可用于血清中抗VZV抗体的检测。     

重组人血管内皮抑制素的双抗体夹心ELISA特异性定量检测

建立了特异性检测重组人血管内皮抑制素(1)的双抗体夹心ELISA法,可区别内源性endostatin和1.1在7.8～1 000ng/ml浓度范围内线性良好,批内、批间RSD为3.9%～5.3%和4.4%～7.1%,平均回收率为97.70.