大鼠脑缺血区局部炎症反应的实验探查

目的:研究脑缺血区血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)表达和单核/巨噬细胞浸润与脑缺血的病理联系。方法:运用免疫组化染色方法和局部脑缺血/再灌流模型探查40只SD大鼠脑缺血区VCAM-1阳性血管和单核/巨噬细胞的数量变化及其变化发生的时程。结果:大鼠脑缺血区微血管内皮细胞VCAM-1表达发生在脑缺血1h,并在16h的再灌流期间,其表达逐渐增加,显示明显的时间依赖性变化。单核/巨噬细胞在脑缺血区的浸润发生在脑缺血1h/再灌流2h,并随再灌流时间的延长,其数量逐渐增加,在再灌流16h,其数量最多,其浸润也显示明显的时间依赖性变化。脑缺血区血管内皮细胞VCAM-1表达的时相与单核/巨噬细胞浸润的时相基本一致。结论:脑缺血诱导缺血性血管内皮细胞表达VCAM-1和诱导单核/巨噬细胞在脑缺血区浸润。此结果提示VCAM-1和单核/巨噬细胞可能参与缺血性脑损伤的病理过程。     

粘附分子表达和巨噬细胞浸润在缺血皮质和基底节区分布的比较

目的:比较大脑基底节区和皮质区对大脑局部缺血/再灌流损伤反应的敏感性。方法:运用免疫组化和酶组化方法对36只SD大鼠局部脑缺血区血管内皮细胞粘附分子VCAM-1的表达和单核/巨噬细胞的浸润概况进行了比较研究。结果:大脑皮质缺血区血管内皮细胞VCAM-1的表达发生于脑缺血1h,表达高峰发生于脑缺血1h/再灌流16h;而在缺血侧基底节区,其表达高峰则发生在脑缺血1h/再灌流4h。单核/巨噬细胞的浸润,在皮质缺血区发生在脑缺血1h/再灌流8h,再灌流16h达到高峰;在缺血侧基底节区,其浸润发生在脑缺血1h,浸润高峰则在脑缺血1h/再灌流8h。结论:大脑基底节区血管内皮细胞粘附分子的表达和单核/巨噬细胞的浸润均较皮质区显著。提示基底节区对脑缺血的反应比皮质区敏感。     

局灶性脑缺血再灌注大鼠 Nogo-AmRNA的表达

为观察 Nogo-A m RNA在脑缺血再灌注后的动态变化 ,探索其在大脑皮质及纹状体神经元表达的意义及作用 ,应用原位杂交方法在大鼠局灶性大脑中动脉阻塞动物模型上观察脑缺血再灌注时大鼠 Nogo-A m RNA的表达。结果显示 :脑缺血再灌注大鼠缺血侧大脑皮质 Nogo-A m RNA的表达与假手术组比较明显增加 ,在 12 h内达高峰 (P<0 .0 1) ,2 4h时下降 ,48h时又升高 ,出现第二个高峰 ,然后逐渐降低 ,7～ 14 d降至基础水平 ;大脑纹状体脑缺血 1h后再灌流 ,2 h时 Nogo-A m RNA的表达明显增加 ,之后逐渐下降 ,到 2 4h时接近基础水平 ,48h时又升高 ,以后表达水平下降 ,3～ 14 d时 ,接近基础水平。结果提示 ,脑缺血后内源性 Nogo-A m RNA的表达呈动态性变化 ,参与了脑缺血后神经元的再生过程的调节。     

TNF-α调节局部脑缺血区ICAM-1 mRNA的表达

目的：为了证实ＴＮＦ－α对局部脑缺血／再灌流区ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ表达的影响。方法：运用原位杂交技术对６０只雄性ＳＤ大鼠进行了研究。结果：局部脑缺血／再灌流诱导脑微血管和毛细血管以及局部炎症细胞ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ的表达,其表达发生于脑缺血１ｈ／再灌流２ｈ,再灌流８ｈ达到高峰。ＴＮＦ－α明显的加强脑缺血区ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ的表达,其作用在脑缺血１ｈ再灌流２ｈ至８ｈ均较明显。再灌流４ｈ,ＴＮＦ－α     

人白介素- 4对牛血管内皮细胞保护作用的研究

目的:研究人白介素-4(hIL-4)对经TNF-α活化的牛主动脉内皮细胞(BAEC)的保护作用。方法:用不同浓度的hIL-4与BAEC共孵育2h后,再与4μg/L的TNF-α共孵育6h或18h。应用细胞ELISA方法,检测BAEC表面的E选择素和ICAM-1的表达;用MTT比色法测定hIL-4对BAEC活性的影响。结果:在一定浓度内用hIL-4预处理BAEC后,能明显抑制TNF-α诱导活化BAEC上的E选择素与ICAM-1的表达,并呈现一定的剂量依赖性。用MTT比色法测定BAEC活性的实验表明,各实验组BAEC的活性与对照组无明显差异性。结论:hIL-4能明显抑制TNF-α诱导活化的BAEC表达E选择素与ICAM-1;hIL-4对BAEC的正常功能具有一定的保护作用。     

全脑缺血再灌流后Bcl-2基因家族的表达及氟桂嗪的影响

目的:观察全脑缺血再灌流后Bcl-2基因家族表达变化规律及氟桂嗪的影响.方法:采用免疫组织化学染色法和原位杂交法观察大鼠4血管结扎全脑缺血30min再灌流后, 不同时相点Bcl-2基因家族在大脑皮质和海马等部位的动态变化.结果:全脑缺血再灌流后12h开始在皮质和海马等部位抑制凋亡基因Bcl-2 mRNA转录增加 ,蛋白有轻度表达,Bcl-xl蛋白表达降低;而促进凋亡基因Bcl则表达升高;Bcl-xl、Bcl -2/Bax的比值明显降低.这种变化以缺血再灌注后24～48h最明显,变化最显著的区域是缺血敏感的大脑皮质和海马CA1区.氟桂嗪(ip)10mg/kg和20mg/kg能促进Bcl-2基因转录, 但对Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表达无显著影响;同时氟桂嗪能抑制Bax蛋白的表达,使Bcl-x l、Bcl-2/Bax的比值升高.结论:脑缺血再灌流可以诱导Bcl-2基因家族在脑内表达发生变化,使Bcl-xl、Bcl-2/Ba x的比值明显降低,促进脑细胞凋亡发生.氟桂嗪可通过抑制Bax表达,升高Bcl-xl、Bcl- 2/Bax比率产生抗脑细胞凋亡作用. 　　……     

LDL诱导THP-1细胞炎性因子FOS、TNF-α、IL-1β的顺序表达

目的探讨LDL诱导THP-1细胞内炎性因子FOS、TNF-α、IL-1β表达及3种炎性因子的关系,为早期诊断动脉粥样硬化提供依据。方法采用实时荧光定量PCR检测LDL刺激的THP-1细胞中FOS、TNF-α、IL-1βm RNA的表达,TNF-α抑制剂刺激THP-1细胞中FOS、TNF-α、IL-1βm RNA的表达及TNF-α抑制剂对LDL诱导的THP-1细胞中FOS、TNF-α、IL-1βm RNA表达影响;采用流式细胞仪检测TNF-α抑制剂刺激的THP-1细胞凋亡情况。结果 LDL刺激THP-1细胞FOS m RNA的表达0.5 h达到高峰(P0.05),TNF-αm RNA的表达1 h开始上升并达到最高(P0.05),IL-1βm RNA的表达1 h开始上升(P0.05);TNF-α抑制剂不促进细胞凋亡,100μg/ml时凋亡率最低。TNF-α抑制剂刺激细胞FOS m RNA 2 h表达下降(P0.05),TNF-αm RNA 1 h表达上升(P0.05),2 h表达下降(P0.05),IL-1βm RNA 1 h表达下降(P0.05);LDL诱导细胞1 h后加入TNF-α抑制剂刺激细胞FOS m RNA 1 h表达下降(P0.05),TNF-αm RNA 0.5 h表达下降(P0.05),IL-1βm RNA 0.5 h表达下降(P0.05)。结论 LDL能够促进THP-1细胞内FOS、TNF-α、IL-1β的表达,且它们之间有一定的表达顺序,TNF-α能促进IL-1β的表达。     

IL-37抑制缺氧诱导的细胞凋亡的研究

目的:IL-37是白细胞介素-1家族成员,可调节血管生成,抑制肿瘤生长,对I/R损伤、炎症性肠道疾病和类风湿性关节炎等有保护作用。由于炎症反应能导致组织氧供应失衡,使局部组织细胞处在缺氧的微环境,因而,本实验主要针对IL-37是否在缺氧环境中发挥细胞保护作用进行研究。方法:分别给予1%和21%O2培养上皮细胞。通过瞬时转染使细胞过表达IL-37,24 h后提取RNA和蛋白质。利用RT-PCR检测IL-37、TNF-α、IL-1、IL-6和CXCL2 m RNA的表达;利用Western blot检测PARP的总蛋白和剪切蛋白的表达量。利用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:缺氧时,细胞凋亡增加1.63倍,内源性IL-37和促炎因子m RNA水平的表达均显著增加,PARP总蛋白表达增加2.1倍。IL-37可显著抑制缺氧诱导的细胞凋亡,并显著降低IL-6和CXCL2的m RNA水平,但其对可以修复DNA的PARP总蛋白的表达在缺氧时无明显作用,caspase-3剪切的PARP也无显著差异。结论:在缺氧环境中,IL-37作为固有免疫调节因子,可以通过抑制细胞凋亡,炎性因子IL-6和CXCL2的表达抑制局部的过度炎症反应。但TNF-αm RNA的表达和caspase-3剪切底物PARP的剪切蛋白无显著变化,提示IL-37不是通过减少TNF-α的表达、进而减少FADD和caspase-8的募集、再减少活化caspase-3的途径抑制细胞凋亡的。其具体抑制凋亡的机制有待进一步研究。     

大鼠脑缺血再灌流后基质金属蛋白酶-2和9的表达

目的：探讨大鼠局灶性脑缺血再灌流后基质金属蛋白酶(MMP)-2和-9(MMP-9)表达的变化规律与脑水肿的关系。方法：用线栓法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞再灌流模型(MCAO),用免疫组化技术分别观察脑缺血再灌流不同时间点MMP-2和MMP-9的表达。结果：(1)脑缺血再灌流后24h可见MMP-2阳性细胞开始出现,3～7d时阳性细胞数达高峰,显色最深,至14d时仍有表达,略高于假手术组。(2)脑缺血再灌流后6h缺血区内MMP-9阳性细胞开始出现,12h明显增高,至2d达高峰,3d后阳性细胞数开始减少,至14d时恢复到基础水平,各相邻时间点比较差异显著。结论：脑缺血再灌流后,病变区MMP-2和MMP-9表达增加,二者在脑缺血再灌流后脑水肿方面起重要作用。     

E-选择素预处理对大鼠脑缺血-再灌注损伤的影响

目的：研究E-选择素鼻粘膜耐受对大鼠脑缺血-再灌注损伤的作用及其机制。方法:E-选择素或PBS单程诱导耐受或加强诱导耐受48 h后,用改良的Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血模型,缺血2 h再灌注22 h后,流式细胞仪测定血中CD3+CD4+T细胞及CD3+CD8+T细胞含量,TTC染色法测定脑梗死体积,RT-PCR检测脑梗死区E-选择素、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）的表达,黄嘌呤氧化酶法检测脑组织中SOD水平。结果:E-选择素单程诱导耐受组CD3+CD4+T细胞与CD3+CD8+T细胞比值增加（P<0.05）。与其它组相比,E-选择素加强诱导耐受组脑梗死体积减小了40.87%（P<0.05）, CD3+CD8+T细胞所占比例减小、CD3+CD4+T细胞与CD3+CD8+T细胞比值增高（P<0.05）,脑组织中SOD水平升高(P<0.05),E-选择素、ICAM-1表达减少（P<0.05）,LFA-1表达有减少趋势。结论:E-选择素鼻黏膜耐受诱导脑缺血耐受可减轻脑缺血-再灌注损伤,其作用机制与CD8+ T细胞减少,CD4+T细胞与CD8+T细胞比值增加、SOD水平升高及E-选择素、ICAM-1表达减少有关。     

中枢八肽胆囊收缩素对大鼠局部脑缺血/再灌注损伤的影响

目的:探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对局部脑缺血/再灌注损伤的影响及其可能机制。方法:采用线栓法大鼠局部脑缺血再灌注模型,观察侧脑室(icv)注射CCK-8或其受体拮抗剂-丙谷胺对脑缺血1h再灌注24h大鼠脑梗死体积、局部脑血流量(rCBF)、不同脑区一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量的影响。结果:(1)脑缺血前给予不同剂量的CCK-8均可缩小脑梗死体积,但只有CCK-8剂量为1.0μg、2.0μg时这种差别才有显著性(均P＜0.05)。预先给予丙谷胺可完全拮抗CCK-8的作用;单纯给予丙谷胺可加重脑缺血损伤。(2)CCK-8可显著抑制脑缺血/再灌注损伤引起的梗死区、半暗区NO水平的升高;抑制梗死区MDA含量的增加(P＜0.05);再灌注24h时,CCK-8组rCBF显著高于正常值(P＜0.05)。结论:中枢内、外源性CCK-8均具有减轻局部脑缺血/再灌注损伤的作用,其机制可能和抑制脑缺血或再灌注时的自由基损伤及增加rCBF有关。     

短暂性前脑缺血后大鼠海马各区NMDA受体亚单位NR2A和NR2B mRNA的表达变化

应用原位杂交组织化学和图像处理与分析的方法 ,观察短暂性前脑缺血 (15 m in)再灌注 (0 .5 h～ 7d)大鼠海马各区NR2 A和 NR2 B m RNA的表达变化 ,探讨二者在缺血性脑损伤中的作用。结果发现 ,缺血后 ,NR2 A和 NR2 B m RNA在海马各区呈现出一种相对一致的表达。在海马 CA1 区 ,NR2 A和 NR2 B m RNA的表达分别在缺血再灌 6h和 12 h降至低谷 (P<0 .0 5 ) ,然后表达开始回升 ,在缺血再灌 48h都升至高峰 (P<0 .0 5 ) ,之后表达再次下降 ,直至缺血后 7d(P<0 .0 5 ) ;在海马 CA3区 ,二者的表达变化规律与 CA1 区相似 ,不同的是表达变化的幅度明显减小。在齿状回 ,缺血后 0 .5 h～ 72 h,NR2 A和 NR2 B m RNA的表达未见显著性变化 ,72 h后表达开始下降 ,直至缺血后 7d(P<0 .0 5 )。以上结果提示 ,短暂性前脑缺血后 ,NR2 A和 NR2 B m R-NA在大鼠海马各区表达变化的模式不同 ,这种不同可能与海马的选择性易损现象和迟发性细胞死亡有关     

免疫球蛋白IgG对TNF-α诱导的内皮细胞损伤的作用及其机制

目的探讨免疫球蛋白IgG对TNF-α诱导的内皮细胞黏附分子、细胞因子的表达及其作用机制。方法不同剂量的免疫球蛋白IgG预处理内皮细胞30 min,再加入TNF-α孵育2 h,或不同剂量的IgG与TNF-α预孵育30 min后加入内皮细胞孵育2 h,RT-PCR及实时定量PCR检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-Selectin及细胞因子IL-6、GM-CSF、IFN-β的mRNA表达;进一步应用Western blot检测黏附分子的蛋白表达及免疫球蛋白IgG自身抗体的表达情况。结果 IgG预处理内皮细胞再加入TNF-α或IgG与TNF-α预孵育后加入内皮细胞,IgG均可剂量依赖性地抑制了TNF-α诱导的黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-Selectin)及细胞因子(IL-6、GM-CSF、IFN-β)的表达,IgG含有anti-IFN-γ,anti-TNF-α,anti-MCP-1的自身抗体。结论 IgG对TNF-α诱导的内皮细胞损伤有治疗作用,其机制与抑制内皮细胞分泌的黏附分子,细胞因子的表达及IgG存在抗细胞因子的自身抗体有关。     

瑞舒伐他汀对大鼠脑缺血再灌注ICAM-1和VCAM-1表达的抑制作用

目的观察大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管间黏附分子-1(VCAM-1)的表达及瑞舒伐他汀干预对其影响。方法 SD大鼠随机分为3组:假手术组(sham组)、模型组(model组)和治疗组(test组)。治疗组在模型制作前用5 mg/(kg·d)瑞舒伐他汀连续灌胃10 d,1次/d。制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型,缺血2 h再灌注24 h后,应用免疫组化法、RT-PCR法和Western blot法检测脑组织中ICAM-1和VCAM-1的表达。结果脑缺血再灌注损伤后,脑组织中ICAM-1和VCAM-1的表达明显增加,与假手术组相比有统计学意义(P0.05);瑞舒伐他汀干预后,能够显著降低脑组织中ICAM-1和VCAM-1的表达,与模型组相比有统计学意义(P0.05)。结论瑞舒伐他汀可抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中ICAM-1和VCAM-1的表达。     

替格瑞洛对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 探究不同浓度的替格瑞洛对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞在蛋白及RNA水平表达细胞间黏附分子-1的影响。方法 离体培养人脐静脉内皮细胞,平均接种于6孔培养板,待细胞生长至融合状态时取三孔加入ox-LDL（50 μg/ml）,再分别加入不同浓度的替格瑞洛（0、20、40 μmol/L）。刺激干预24 h后采用Western Blot法测定ICAM-1的蛋白表达水平。重复实验,采用Real-time PCR法测定ICAM-1的RNA表达水平。结果 ①oxLDL能明显上调ICAM-1的表达;②Western Blot蛋白定量结果显示,oxLDL诱导组ICAM-1的蛋白表达明显高于对应的非诱导组（P＜0.05）;未予替格瑞洛干预组ICAM-1的蛋白表达高于替格瑞洛低浓度组（P＜0.05）;替格瑞洛低浓度组ICAM-1的蛋白表达高于替格瑞洛高浓度组（P＜0.05）;③Real-time PCR结果与Western Blot蛋白定量结果一致。结论 oxLDL能在RNA水平提高ICAM-1表达,替格瑞洛能在RNA水平抑制ICAM-1的表达,并与浓度正相关。     

雌激素对全脑缺血再灌小鼠海马CA_1区P-CREB和BDNF表达的影响

本文观察了雌激素对全脑缺血再灌的影响并探讨了其作用机制。切除小鼠双侧卵巢同时于颈部皮下植入雌激素(E2)缓释片(OVXE2组)或安慰剂缓释片(OVXPLC组)。术后18d,手术暴露双侧颈总动脉并夹闭25min后再通,制作全脑缺血再灌模型,分别于灌流后1h,12h,3d,7d取材进行PCREB和BDNF免疫组化染色和常规Nissl染色,研究E2对雌性小鼠全脑缺血/再灌流损伤后海马CA1区PCREB和BDNF表达的影响。结果表明:缺血再灌后7d,OVXPLC组海马CA1区神经元排列稀疏,细胞层次减少,细胞数低于OVXE2组(P<0.01);在缺血再灌后3d,OVXPLC组海马CA1区PCREB阳性细胞数低于OVXE2组(P<0.01),而BDNF的表达无统计学差异(P>0.05);在缺血再灌后7d,OVXPLC组PCREB和BDNF的表达均低于OVXE2组(P<0.01)。以上实验结果提示,E2在缺血再灌的中后期可能通过上调海马CA1区PCREB进而促进BDNF的表达,发挥神经元保护作用。     

脑缺血再灌流对大鼠海马FOS蛋白的诱导及电针对其的影响

目的　探讨脑缺血再灌流后电针对大鼠海马FOS蛋白表达的影响。方法　采用夹闭大鼠双侧颈总动脉造成的脑缺血再灌流损伤模型 ,电针“百会”、“风池”、“大钟”及“足三里”穴 ,频率 2～ 2 0Hz,强度以肌肉轻微抖动为准 ,持续 30min ,4h后观察海马FOS蛋白的表达。结果　电针能明显加强脑缺血再灌流后海马各区FOS蛋白的表达。结论　缺血再灌流可诱导海马FOS蛋白的显著表达 ;电针信息对缺血后海马神经元的功能可能会有影响。     

前脑缺血再灌流后大鼠海马 NMDA受体亚单位NR1蛋白的表达变化

目的　观察大鼠前脑缺血再灌流后海马各区域NMDA受体亚单位NR1表达的变化和差异 ,探讨NR1在缺血性脑损伤中的作用。　方法　免疫组织化学和图像处理技术。　结果　 1 在前脑缺血再灌流后早期 ,海马各区域NR1的表达水平显著下降 (P <0 0 5 )。CA1区 ,下降趋势持续存在且不可逆 ,直至再灌流后第 7d ,NR1在该区域的染色强度降至对照组的 17% (P <0 0 5 )。CA3区及齿状回 ,NR1的表达下降是可逆的 ,再灌流后 72h ,齿状回的表达恢复正常 ,再灌后第 7d ,CA3区的表达也恢复到对照组的 96 % ,两组间染色强度无显著差异。 2 在迟发性神经元坏死出现前的缺血再灌流的早期 ,NR1在CA1区、CA3区及齿状回表达下降的幅度不一致 ,再灌后 6h以前 ,CA1区的下降幅度明显小于CA3区及齿状回 (P <0 0 5 ) ,再灌后 12h ,CA1区的下降幅度仍低于CA3区 (P <0 0 5 )。结论　短暂性前脑缺血后 ,NR1在海马CA1区、CA3区及齿状回表达下降的幅度和可逆性存在显著差异 ,这种差异可能是造成CA1区缺血敏感性的重要原因。     

促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及细胞黏附分子-1表达的影响

目的:观察促红细胞生成素(EPO)预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织的病理变化和细胞黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响,探讨其保护作用.方法: 96只SD大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组、EPO组,分设4个时间点的亚组,每亚组6只.采用Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞2 h模型,再灌注6、24、48、96 h后行神经功能评分,H-E染色观察病理学变化,免疫组织化学方法测定各组ICAM-1阳性反应细胞.结果:24 h开始EPO组神经功能评分改善,神经细胞存活数量增多,损伤程度减轻,而且减少了各时间点脑组织中ICAM-1阳性细胞表达.结论: EPO处理可抑制缺血侧皮层的神经细胞变性坏死,其保护机制可能与脑缺血再灌注后炎症因子ICAM-1表达减少有关.     

蜂胶水提物对血管内皮细胞黏附分子表达的影响

目的:采用TNF-α诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUCECs)活化,观察蜂胶水提物(WEP)对血管内皮细胞黏附分子表达的影响,从而探讨蜂胶抗动脉粥样硬化的作用及其机制。方法:用50μg/L TNF-α诱导体外培养HUVECs损伤,用50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L WEP分别进行干预6 h、12 h、24 h,利用流式细胞仪检测HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1表达。结果:与对照组比较,模型组ICAM-1和VCAM-1荧光强度明显升高(P0.01)。与模型组比较,100 mg/L WEP组和200 mg/L WEP组ICAM-1和VCAM-1荧光强度明显降低(P0.01)。不同浓度WEP组ICAM-1和VCAM-1荧光强度随WEP浓度的增加下调。析因分析结果显示,用200 mg/L WEP和氟伐他汀钠(FS)联合预处理组与单一药物预处理组比较,ICAM-1和VCAM-1活性明显降低(P0.01)。结论:WEP能够减少ICAM-1和VCAM-1的表达,且在一定的范围内,有随WEP浓度升高和作用时间延长效应增强的趋势。WEP与FS联合用药,对抑制ICAM-1和VCAM-1表达有协同作用。