霍乱弧菌毒素协同调节茵毛基因tcpA的克隆及序列分析

目的以新疆分离0139霍乱弧菌XJ93006株的DNA为模板，自行设计引物克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因(包括侧序列)并构建重组载体。方法以0139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006基因组DNA作为模板；根据0l群ElTor型霍乱弧菌N16961全基因组序列设计tcpA PCR引物，高保真酶扩增tcpA片段：限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒，T4DNA连接酶连接酶切产物，重组质粒转化大肠什菌TB1工程菌，蓝白斑菌落试验筛选阳性克隆；提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物信息数据库对该序列进行序列分析，比较.结果DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB193-tcpA的EcoRI和Sal I位点之间切出一个1037bp的DNA片段，测序结果与01群ETTor型霍乱弧菌N16961、O139霍乱弧菌标准株M045的tcpA同源性均达到99.9％以上。结论成功构建0139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因的重组质粒pNEB193-tcpA；序列分析表明霍乱弧菌毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因住01群ETTor型霍乱弧菌和0139霍乱弧菌中是一类高度保守的原核基因，可作为霍乱弧菌疫苗的候选基因。另外为研究0139霍乱弧菌的来源奠定基础。     

野生型产气荚膜梭菌β毒素基因的克隆与分析

用多联PCR方法对从猪舍污水中分离的细菌进行鉴定，获得1株B型和1株C型产气荚膜梭菌，用PCR方法扩增了β毒素基因并进行了测序，获得了包括RBS、信号肽基因和全长成熟肽基因以及部分3′末端序列的β毒素基因；测序后与GenBank中B、C型菌β毒素基因进行比较。野生B、C型菌与二者的同源性分别达到99％以上，氨基酸同源性也在99％以上。     

霍乱弧菌O139 mshA基因的克隆、表达及免疫反应性鉴定

目的克隆霍乱弧菌O139临床菌株的甘露糖敏感血凝素(Mannose-Sensitive Hemagglutinin,MSHA)基因,构建原核表达系统,鉴定重组表达产物的免疫反应性。方法高保真PCR扩增mshA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统pET-28a(+)-mshA-E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的重组蛋白(rMSHA)表达、Ni-NTA亲和层析法收集蛋白;Western blot鉴定其免疫反应性。结果所克隆的mshA基因与GenBank报道的(AE004128)序列完全一致。构建的mshA基因原核表达系统pET-28a(+)-mshA-E.coliBL21(DE3)表达量占细菌总蛋白的20%以上。表达的蛋白(约20kD)可与His单克隆抗体发生特异性免疫结合。结论成功构建了霍乱弧菌O139mshA基因的高效原核表达系统,表达的rMSHA蛋白有良好的免疫反应性,为进一步研制MSHA及其抗体检测试剂盒奠定了基础。     

伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因的克隆及与上皮细胞的粘附作用研究

目的克隆伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因,在大肠埃希菌中表达;了解伤寒沙门菌stg与人上皮细胞的相互作用。方法根据大肠埃希菌保守基因序列设计引物,克隆stg成熟肽编码序列,连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中并观察与上皮细胞的粘附特性。结果成功克隆stg基因全长核苷酸序列,构建了pET32a/stg原核表达重组质粒。pET32a/stg重组质粒转化大肠埃希菌能较多出现在上皮细胞表面。结论成功克隆并表达了伤寒沙门菌菌毛操纵子stg基因,stg基因能促进沙门菌对上皮细胞的粘附,为进一步了解伤寒沙门菌菌毛操纵子stg的特性与功能奠定了基础。     

多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因

目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证。结果建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果。菌体检测的最低检出限度ctxA基因：102 CFU/mL,ace基因和zot基因：10CFU/mL。构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5%;对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株（57.2%）携带ctxA毒素基因、31株（44.3%）携带ace毒素基因、46株（65.7%）携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100%。结论本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因的克隆及序列分析

目的克隆并鉴定乙型肝炎病毒表面抗原基因,为下一步构建该重组腺病毒载体以及进一步研究腺病毒载体的包装及在乙型肝炎病毒基因治疗中的作用。方法参照人 HBV adr 亚型序列,设计和合成 S 基因特异引物。应用 PCR 技术,从含有 HBsAg 的 HBV DNA 中扩增目的 DNA,通过 TA 连接将其克隆人 pGEM-T easy 载体,经限制性内切酶 BglⅡ/SalⅠ鉴定后,进一步测序鉴定。结果从乙肝表面抗原阳性(HBsAg )血清中成功提取 HBV DNA,并以此 DNA 为模板,成功扩增出 S 基因,测序结果与 GenBank 中注册的相应序列比对,核苷酸序列的同源性高达92％～99％,预测氨基酸序列同源性亦达82％。结论从 HBsAg 阳性血清中成功克隆出 S 基因序列,为进一步构建重组腺病毒及后续实验奠定了基础。     

霍乱弧菌基因表达分析中内参基因的选择

目的确定不同实验条件下基因表达分析中的稳定内参基因。方法以霍乱弧菌O1群El Tor菌株为研究对象,利用qRT-PCR方法比较不同pH值(pH 8.0、pH 5.5)以及不同温度(37℃、30℃)等多种生理、外界环境模拟培养条件下,thyA、recA、rpoA、gyrB、16SrRNA以及VCA0862 6个候选内参基因的表达水平,利用geNorm软件评价其稳定性。结果不同培养条件下,6个候选内参基因表达水平存在差异。不同pH值条件下最佳基因是recA;不同温度条件下最佳基因是gyrB;不同pH值及温度综合评价时,最佳基因是recA。结论本研究评价和提出了细菌基因表达分析中内参基因筛选的重要性,不同实验条件下最稳定内参基因是不同的,针对不同条件下的基因转录定量分析,应分别对内参基因稳定性进行评价并选择最稳定基因。     

我国O139群霍乱弧菌CTX遗传单元基因分布特征

到目前为止 ,已发生的 7次霍乱世界大流行 ,都是由O1群霍乱弧菌引起的。 1992年在印度、孟加拉等国引起暴发流行的O139群霍乱弧菌 ,是一种新出现的由非O1群霍乱弧菌引起的霍乱流行的病原体 ,能产生与O1群霍乱弧菌相同的霍乱毒素 (CT) ,其所引起的霍乱在临床和流行病学上也与O1群所致的霍乱基本相同。近年来研究表明 ,与O1群霍乱弧菌相比 ,O139群霍乱弧菌具有独特的表型及分子特征。在霍乱弧菌中 ,CT是最主要的毒力因素 ,其结构基因位于染色体上大小为 7～ 9.7kb的CTX遗传单元上[1] ,它的核心区域 (4 .5kb)至少有 5个基因 ,依次排列是c…     

副溶血弧菌tlh基因的克隆及序列分析

目的　构建副溶血弧菌不耐热性溶血毒素 (thermolabilehemolysin ,TLH)tlh基因重组质粒。方法　根据已知GenBank中的tlh基因序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从副溶血弧菌基因组DNA中扩增编码TLH的基因片段 ,克隆至pET32a+ 质粒 ,转化大肠杆菌DH5感受态细胞 ,经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序。结果　tlh基因体外扩增产物大小约1 30 0bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。 结论　在国内首次克隆了副溶血弧菌tlh基因 ,为研究TLH的功能和探讨TLH作为作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析，为H．pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法应用PCR方法获得国内分离H．pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H．pylori的ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1．71kb的ureB基因片段，特异PCR可扩增出ureB基因片段，证实H．pylori ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离H．pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp( Genbank收录号：AY295085)，编码由569个氨基酸残基组成的肽链，ureB基因序列与GenBank公布的H．pylori相应基因同源性高达96．08％～98．30％，氨基酸序列同源性在98．77％．99．82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因，其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97．67％。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)热休克蛋白A亚单位的编码基因(hspA)克隆和序列分析，为H.pyiori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H.pylori的hspA基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到0．35kb的hspA基因片段，特异PCR可扩增出hspA基因片段，证实H.pylori hspA基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离HpMEL-HP27的hspA基因全长357bp(Genbank收录号：AY295084)，编码由118个氨基酸残基组成的肽链，hspA基因序列与GenBank公布的H.pylorl相应基因同源性高达95．20％～97．48％，氨基酸序列同源性在95．76％～97．46％之间。结论 克隆了H．pylori菌株MEL-HP27的hspA基因，其核酸序列与国际参考株NCTC11637同源性为97．48％。     

中华按蚊水通道蛋白(AsAQP)cDNA克隆与序列分析

目的克隆中华按蚊水通道蛋白(AsAQP)基因的cDNA全长序列,分析其基因序列特征,为研究AsAQP的生物学功能提供分子基础。方法根据已报道的昆虫水通道蛋白(AQP)氨基酸序列的保守区域,采用兼并引物从中华按蚊cDNA中获取AsAQP基因片段,在此基础上利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆该基因cDNA全长序列,并用生物信息学方法对获取的序列进行分析。结果利用兼并引物从中华按蚊成蚊cDNA中分离到AsAQP基因片段,利用RACE技术克隆到该基因的全长cDNA。序列分析表明,该基因cDNA全长762 bp,编码253个氨基酸,蛋白分子量约为63.2 kD。生物信息学分析表明,AsAQP具有典型的6个跨膜区结构和2个天冬酰胺酸脯氨酸丙氨酸(NPA)结构,该结构是主要内在蛋白(MIP)家族典型的结构特征。AsAQP与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)AQP及埃及伊蚊(Aedes aegypti)AQP蛋白的同源性分别为76%和78%。氨基酸序列聚类分析表明,AsAQP与其他蚊种的水通道蛋白遗传距离较近。结论利用兼并引物结合RACR技术首次获得了编码AsAQP基因的cDNA全长序列,该基因属于MIP蛋白家族成员,具有典型的功能域,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

三株霍乱弧菌16s rDNA指纹图谱分析

目的探讨我国新疆分离O139群霍乱弧菌的基因组特征。方法自行设计引物，利用PCR掺人法用地高辛标记的16srDNA基因探针，分别对二株VCO139霍乱弧菌(新疆分离株XJ93006、国际标准株M045)及一株El Tor菌株(新疆分离株89079)的基因组DNA的Bgl I、Pvu I酶切产物进行southem杂交。结果杂交结果显示此三株霍乱的杂交图谱均不同。结论我国新疆的O139霍乱既不同于本地的El Tor霍乱，也与国际标准株存在差异。     

Cloning and expression of Vibrio cholerae virulence gene, accessory cholera enterotoxin (ace)

The cholera enterotoxin (CT) has been considered a major virulence factor of Vibrio cholerae. The accessory cholera enterotoxin (ace) gene is the third gene of V. cholerae virulence cassette. The gene coding for the Ace toxin was amplified from V. cholerae isolates producing a single band of 314 bp. The presence of ace gene was confirmed by hybridization as well as by sequencing. The gene was successfully expressed in Escherichia coli (LMG194) using expression, pBAD/Thio-TOPO vector. Optimal conditions for expression included choice of host strain, temperature used for culturing, and concentration of antibiotic and arabinose inducer. The Ace protein was obtained from the cell supernatant as a fusion protein with a molecular mass 34 kDa which was detected using an anti V5-HRP epitope tagged antibody.     

阴道毛滴虫病毒RDRP基因的克隆与分析

目的对阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因的克隆,以便探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板,根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TVV-T1序列设计一对引物,经RT-PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物,将其克隆到pMD-18T载体后测序,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析。结果目的基因片段长度为2271bp,与阴道毛滴虫病毒T1株(U08999)的同源性最高为85.2%。结论国内首次成功克隆出阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因序列。     

Cloning and DNA sequence analysis of the cDNA for the precursor of porcine follicle stimulating hormone (FSH) beta subunit

A cDNA library of porcine anterior pituitary was constructed in an expression vector lambda gt11. The cDNAs encoding the porcine follicle stimulating hormone (pFSH) beta subunit were obtained using anti-human FSH beta antiserum or synthetic oligonucleotide. The nucleotide sequence of the pFSH beta subunit cDNA clone (929 base) has been determined. The cDNA contained a part of the signal sequence (six amino acids) and the whole amino acid sequence of the mature molecule (109 amino acids). The predicted protein sequence was different from that of the amino acid sequence analysis in ten residues and had an extended carboxyl terminus. Northern analysis showed that the length of the pFSH greater than subunit mRNA was about 1.8 kb.