实时荧光定量PCR检测大肠癌患者外周血鸟苷酰环化酶C基因及其临床意义

目的:建立人鸟苷酰环化酶C(GC-C)含量实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测的新方法,观察大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平并探讨其临床意义.方法:在GC-C基因高保守区设计了特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本(30例健康献血员、11例大肠良性病变和37 例大肠癌)中GC-C mRNA准确含量,并以GC-C mRNA和β2微球蛋白 mRNA含量的比值作为评价GC-C表达水平的指标.结果:本法检测GC-C mRNA含量的线性范围为101 ～109 pg/ml,样本批内和批间变异系数(CV)值分别为6.87%～11.12%和8.86%～15.19%.30例健康献血员和11例大肠良性病变样本的PBMC中均未检出GC-C mRNA表达,大肠癌患者外周血GC-C mRNA的检出率为83.8%(31/37).大肠癌患者外周血PBMC GC-C mRNA表达水平为0.88±0.06,与Duke分期、淋巴结转移和肝转移密切相关,与年龄、性别、肿瘤大小等无关.结论:GC-C mRNA RFQ-PCR检测外周血大肠癌细胞具有较好的检测灵敏度、特异性和重复性,GC-C mRNA表达水平可能对指导大肠癌Duke分期、判断淋巴结转移和肝转移、指导术后综合治疗均有一定价值.     

小干扰RNA沉默鸟苷酰环化酶C基因促进胃癌细胞的凋亡

目的:利用RNA干扰技术,研究靶向鸟苷酰环化酶C(Guanylyl cyclaseC,GC-C)的小干扰RNA(siRNA)在体外对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法:利用pSilencerTM4.1-CMV neo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA,将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,流式细胞检测技术及原位末端标记(TUNEL)法检测转染前后细胞的凋亡。结果:流式细胞仪结果分析示转染组平均凋亡率为5.48%±0.10%(48h)和5.63%±0.11%(72h),较对照组0.50%±0.09%明显增加(P<0.05)。TUNEL检测见特有的凋亡征象,对照组则无明显变化。结论:沉默鸟苷酰环化酶C基因可促进胃癌细胞凋亡,可能为临床探索胃癌生物治疗提供新的靶点。     

小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白片段实时荧光定量PCR标准品的构建

目的 构建小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)非编码蛋白(UTR)片段标准品,用于实时荧光定量 PCR检测小鼠脑脊髓炎病毒.方法 RT-PCR 扩增TMEV UTR片段上80~1094 nt之间长度为1 014 bp的片段,将目的 片段连接至pMD18-T载体,转化至DH5a感受态细胞.分别经 PCR鉴定和序列测定验证重组质粒.分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作10倍梯度稀释制得质粒标准品.然后进行实时荧光定量PCR分析,绘制标准曲线.结果 TMEV UTR片段成功克隆至pMD18-T载体中,测序结果 表明重组质粒中插入的UTR序列正确,实时荧光定量PCR分析10倍梯度系列稀释的质粒标准品所得到的标准曲线良好,统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上.结论 成功构建了TMEV UTR 片段实时荧光定量PCR标准品,为今后TMEV实时荧光定量PCR检测打下了基础.     

一种新的T细胞相关分子IBP表达水平定量检测方法的建立

目的 建立一种定量检测IBP表达水平的方法 ,为研究IBP在免疫细胞分化以及在免疫性疾病当中的作用奠定基础.方法 利用反转录PCR和PCR技术获得目的 基因和内参基因片段,构建重组质粒,以重组质粒为标准品,建立实时PCR标准曲线;测定外周血白细胞IBP和β-actin表达水平.以β-actin为内参照,均一化检测结果 .结果 重组质粒的阳性克隆经PCR扩增,0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的 基因片段插入载体内;建立起实时PCR标准曲线.检测20例正常人全血标本,得到比较稳定的检测结果 .结论 成功建立了用实时PCR定量检测IBP mRNA表达水平方法 ,为进一步研究IBP奠定了基础.     

鸟苷酰环化酶C小干扰RNA对胃癌细胞生长的影响

目的：研究靶向鸟苷酰环化酶C（Guanylyl cyclaseC,GC-C）的小干扰RNA（siRNA）对人胃癌SGC-7901细胞体外生长能力的影响。方法：利用pSilencer TM4.1-CMVneo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA。将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光观察转染前后胃癌细胞GC-C基因的表达变化,黏附实验观察转染前后胃癌细胞黏附能力。结果：构建的GC-CsiRNA测序鉴定与设计完全相符。GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,明显抑制GC-C基因的表达。转染后,GC-CmRNA和蛋白表达分别抑制了66.7%和75.8%,细胞黏附能力较对照组减弱（P〈0.05）。结论：靶向GC-C的siRNA可明显下调靶基因GC-C的表达,在体外抑制胃癌SGC-7901细胞的黏附,提示GC-C基因与胃癌的发生、发展有密切的关系。     

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的：建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法：提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果：人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论：建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。     

线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建

目的:构建大鼠线粒体转录因子TFAM(A)、线粒体转录因子TFB1M(B1)、线粒体转录TFB2M(B2)及线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的质粒标准品,为检测内耳细胞线粒体TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的mRNA表达水平做基础。方法:设计特异性引物和探针,提取大鼠内耳组织总mRNA逆转录成c DNA,PCR扩增、纯化目的片段,将纯化产物与p Zero Back/blunt载体重组,提取重组质粒,经测序鉴定后,用实时荧光绝对定量PCR建立标准曲线。结果:测序结果与各目的序列一致,获得良好的标准曲线(R2>0.99)。结论:成功构建了各目的基因的质粒标准品。     

实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达

[摘　要]　目的 构建检测急性髓细胞白血病FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方法,为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计出扩增FLT3基因的引物和特异性荧光探针。提取K562细胞株总RNA,经RT-PCR 扩增,产物纯化后与pUCm-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒FLT3P。 建立荧光定量PCR 检测 FLT3基因技术方法,建立标准曲线并检测15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR 扩增出现强烈的荧光值增长,表明FLT3 cDNA已成功克隆。以109～105copies/μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR 扩增, 所获得的Ct 值与标准品浓度的对数存在良好线性关系, 标准曲线回归系数为0.9998 。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常对照组（p=0.017）, 且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测FLT3 mRNA表达得荧光定量PCR的标准品和技术方法; AML病例 FLT3表达水平显著增高。     

HBV前C区部分序列亚克隆与FQ-PCR标准曲线的制备

目的探讨HBV前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期诊断价值和意义并基于此靶基因制备荧光定量PCR标准曲线。方法设计特异性引物,将pBR322-HBV质粒前C区部分序列PCR产物AT亚克隆至pBS-T载体,提取和纯化质粒DNA,制作标准品并在FQ-PCR仪上得到标准曲线,进而对精确度和重复性进行统计分析。结果获得了预期希望的质粒。荧光定量PCR标准曲线的相关系数为0.995,线性范围5×103 copies/μl~5×109 copies/μl。批内、批间变异系数值均小于5%,精确度高,重复性好。结论HBV前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期检测和诊断有一定价值和意义。且FQ-PCR标准曲线的成功制备,临床早期检测乙肝病毒感染奠定了基础。     

胃癌患者术前外周血鸟苷酸环化酶C mRNA表达与术后复发的关系

目的 探讨胃癌患者术前外周血鸟苷酸环化酶C信使RNA(guanylate cyclase C,GC-C mRNA)表达与术后复发的关系。方法 收集60例胃癌患者术前外周血和同期门诊15例肠上皮化生、21例异型增生患者以及20例健康体检者外周血标本,应用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测GC-C mRNA的表达,并分析其与临床病理参数及胃癌术后复发的关系。结果 健康体检者外周血中未检测到GC-C mRNA表达,肠上皮化生和异型增生患者外周血GC-C mRNA表达阳性率分别为9.5%(2/15)和20.0%(3/21);而胃癌患者术前外周血阳性率为48.3%(29/60),高于健康体检者及肠上皮化生、异型增生患者(P<0.05)。胃癌患者术前外周血GC-C mRNA表达与肿瘤Laurén分型、临床TNM分期、浸润深度、淋巴结转移和分化程度等均有关(P<0.05,P<0.01)。GC-C阳性胃癌患者术后1~4年的累计肿瘤复发率分别为41.4%、79.3%、96.6%和100.0%;GC-C阴性患者术后1~4年的累计肿瘤复发率分别为16.1%、41.9%、67.7%和80.6%,且GC-C阳性患者术后中位复发时间短于GC-C阴性患者。两组患者术后1~4年的累计肿瘤复发率、中位复发时间和总体生存期差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 胃癌患者术前外周血GC-C mRNA阳性者预后更差,且更易出现术后短期复发。     

鸟苷酸环化酶C和尾型同源盒转录因子2蛋白在胃癌及癌前病变组织中的表达

目的 检测鸟苷酸环化酶C(GC-C)和尾型同源盒转录因子2(CDX2)蛋白在胃癌及癌前病变中的表达,并探讨两者与胃癌生物学行为的关系.方法 免疫荧光检测GC-C和CDX2蛋白在23例肠上皮化生、9例异型增生、30例胃癌及相应远癌胃组织中的表达,Western印迹检测两者在30例胃癌及相应远癌胄组织中的表达.结果 GC-c和CDX2蛋白在肠上皮化生(均为9例阳性)、异型增生(均为5例阳性)和胃癌(分别为17例、18例阳性)组织中表达阳性率均显著高于远癌胃组织(均无表达);两者在肠型胃癌中的表达均高于弥漫型(均P＜0.05),与年龄、性别、病灶大小、临床病理分期、分化程度、淋巴结转移等因素无关;GC-C和CDX2蛋白在肠上皮化生和胃癌中两者的表达呈正相关(Spearman秩相关系数r=0.4524、0.3845).结论 GC-C和CDX2蛋白的异常表达与肠型胃癌发生发展有关,检测其变化可能有助于胃癌早期诊断.     

不同双歧杆菌标准品制备法的比较研究

目的 比较不同的双歧杆菌标准品制备法,筛选适用于实时荧光定量PCR检测的双歧杆菌标准品。方法 以双歧杆菌标准菌株作为实验菌株,分别采用菌株DNA法、PCR产物扩增纯化法、质粒DNA法制备梯度浓度标准品,运用紫外分光光度计和实时荧光定量PCR 技术进行检测,并对数据进行统计学处理。结果 实时荧光定量PCR检测发现,3种不同的双歧杆菌标准品制备法的标准曲线均 r 2 ＞0.990;不同制备法的双歧杆菌标准品DNA浓度和纯度检测比较,质粒DNA制备法所制的双歧杆菌标准品浓度和纯度较另外两种方法高,差异有统计学意义（ P<0.01）。结论 双歧杆菌质粒DNA制备法制备的标准品质量较高,适用于实时荧光定量PCR检测,可以为双歧杆菌分子生物学检测提供参考依据。     

Development of Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction for the Detection of Vibrio vulnificus Based on Hemolysin （vvhA） Coding System

Objective To establish a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR to detect Vibrio vulnificus based on the hemolysin gene （vvhA） coding cytolysin. Methods Primers and probes in the conserved region of the vvhA gene sequence were designed for the TaqMan real-time PCR to detect 100 bp amplicon from V. vulnificus DNA. Recombinant plasmid pMD19-vvhA100 was constructed and used as a positive control during the detection. Minimal amplification cycles （Ct value） and fluorescence intensity enhancement （ARn value） were used as observing indexes to optimize the reaction conditions of TaqMan real-time PCR. The TaqMan assay for the detection of Vbirio vulnificus was evaluated in pure culture, mice tissue which artificially contaminated Vibrio vulnificus and clinical samples. Results The established TaqMan real-time PCR showed positive results only for Vibrio vulnificus DNA and pMD19-vvhA100. The standard curve was plotted and the minimum level of the vvhA target from the recombinant plasmid DNA was 103 copies with a Ct value of 37.94±0.19, as the equivalent of 0.01 ng purified genomic DNA of Vibrio vulnificus. The results detected by TaqMan PCR were positive for the 16 clinical samples and all the specimens of peripheral blood and subcutaneous tissue of mice which were infected with Vibrio vulnificus. Conclusion TaqMan real-time PCR is a rapid, effective, and quantitative tool to detect Vibro vulnificus, and can be used in clinical laboratory diagnosis of septicemia and wound infection caused by Vibrio vulnificus.     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建含幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A（CagA）基因片段的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA。方法从幽门螺杆菌细胞株中扩增出CagA基因片段,经回收、纯化,连接到质粒pGEM-T上,测序、酶切后与质粒pEGFP-C3连接,脂质体法将pEGFP-C3-CagA转染入胃癌细胞株BGC823,用荧光显微镜观察转染的细胞。结果通过测序、酶切证明CagA插入质粒正确,构建出载体pEGFP-C3-CagA,转染后经荧光显微镜观察到胃癌细胞株BGC823中有绿色荧光。结论成功构建表达CagA的真核绿色荧光载体。     

猪endoglin胞外段真核表达载体的构建及其诱导抗小鼠自身endoglin抗体的实验研究

目的分别扩增猪和小鼠endoglin胞外段cDNA,构建真核表达载体作为DNA疫苗,了解猪endoglin DNA疫苗是否能够在小鼠体内诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.方法利用RT-PCR技术,从猪和小鼠胚肝中分别扩增出猪和小鼠的endoglin胞外段,用内切酶消化后分别将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后,体外转染真核细胞COS-1,用RT-PCR和免疫印迹鉴定是否能正确表达.然后大量扩增和提取相应质粒,将这些质粒作为DNA疫苗,肌注免疫小鼠,通过ELISA、免疫印迹和ELISPOT测定抗自身endoglin的抗体和脾脏中分泌特异性抗endoglin抗体的B淋巴细胞.结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实RT-PCR扩增的cDNA及构建的重组真核表达质粒正确,重组的真核表达质粒能在COS-1细胞中正确表达,猪endoglin胞外段真核质粒DNA疫苗免疫小鼠可以诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.结论重组猪endoglin胞外段真核表达载体可作为DNA疫苗用于抗肿瘤血管生成的基因治疗.     

Myocardin表达载体的构建

目的 构建表达载体pEGFP-Myoc1,为转染人脐血间充质干细胞,实现其成平滑肌分化提供条件.方法 通过聚合酶链反应(PCR)以pAdApt.myoc1 为模板制备Myocardin目的 基因,通过pEGFP-N1载体线性化以及连接、转化等方法构建真核表达载体pEGFP-Myoc1,并通过酶切和测序对其序列进行鉴定.结果 正确构建了真核重组表达质粒pEGFP-Myoc1,基因测序结果表明,与Gene Bank公布的已知序列完全一致.结论 成功构建的真核重组表达载体pEGFP-Myoc1,为后续实验提供了基础.     

鸟苷酸环化酶C在重症急性胰腺炎大鼠相关性肠损伤中的变化

目的 探讨鸟苷酸环化酶C（GC-C）在重症急性胰腺炎（SAP）相关性肠损伤中的变化规律及作用。方法（1）36只成年雄性SD大鼠用随机数字表法分为假手术组（n=18,SO组,开腹后仅翻动胰腺数次后关腹）和重症急性胰腺炎组[n=18,SAP组,开腹后经胰胆管逆行微量泵入5%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g）制备SAP模型]。各组根据用药时间再次随机分为12 h组,24 h组和48 h 组（n=6）。于建模后12、24、48 h分批处死大鼠收集结肠组织进行免疫蛋白印迹、免疫组织化学和RT-PCR实验明确GC-C在SAP相关性肠损伤中的变化规律,选取GC-C表达最低的时间点作为肠损伤最严重的大概时间点,即作为干预时间点进行后续实验;（2）18只成年雄性SD大鼠用随机数字表法分为SO组（n=6,处理方法同前）、SAP组（n=6,处理方法同前）和Linaclotide组 [n=6,诱导SAP后立即用GC-C激动剂利那洛肽（Linaclotide）水溶液（10 μg/kg/d）灌胃1次]。根据第一部分实验结果,选取12h节点进行检测。以HE染色评估胰腺与结肠病理改变;ELISA法测定血清中淀粉酶（AMY）、二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（DLac）和TNF-α浓度;通过RT-PCR、免疫蛋白印迹法、免疫组织化学染色法和透射电镜检测结肠组织中GC-C和紧密连接蛋白Claudin-1的表达。结果 GC-C在SAP组大鼠结肠中表达显著降低,于SAP建模后12 h表达最低（P<0.05）,但随着时间推移GC-C表达逐渐升高。而结肠中Claudin-1表现出相似的趋势。与SO组相比,SAP组和Linaclotide组结肠表现为不同程度的粘膜不连续、间质水肿及炎性细胞浸润,病理学评分均升高（P<0.05）;血清淀粉酶、二胺氧化酶、D-乳酸和TNF-α均显著升高（P< 0.05）;结肠中GC-C和Claudin-1表达下降。与SAP组相比,Linaclotide组结肠组织病理评分降低,血清中上述各因子水平降低,而结肠组织中GC-C和Claudin-1表达水平升高。结论 GC-C在SAP相关性肠损伤中呈现出先降低后升高的表达趋势,于诱导SAP后12 h表达最低;通过激活GC-C可以提高GC-C和Claudin-1的表达水平并缓解肠道损伤,表明GC-C或许通过调节紧密 连接蛋白的表达来维持肠屏障功能的完整性。     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。     

波形蛋白真核表达质粒载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的构建重组人波形蛋白中间丝真核表达质粒载体pcDNA3.1-VIM并检测波形蛋白在肝癌HepG2细胞中的稳定表达。方法通过RT-PCR技术从人胎盘组织总RNA中扩增波形蛋白基因,经限制性核酸内切酶BamHⅠ-EcoRⅠ消化,然后插入pcDNA3.1(+)载体,脂质体介导重组质粒和空质粒分别转染HepG2细胞,G418筛选稳定表达细胞株,采用免疫细胞化学技术检测目的基因的表达。结果经DNA序列分析和限制性核酸内切酶消化,证实重组载体pcDNA3.1-VIM已正确克隆,建立的稳定细胞株高表达波形蛋白。结论成功地构建了重组质粒pcDNA3.1-VIM载体和建立了稳定表达波形蛋白的人肝细胞癌细胞株,为进一步研究波形蛋白与癌细胞生物学行为之间的相互关系奠定了基础。