荧光定量PCR检测358例乙型肝炎病毒DNA结果分析

目的用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测血清中乙型肝炎病毒的数量以研究其临床价值。方法采用一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的实时检测定量PCR方法来检测358份临床血清标本。结果123份HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性的标本,阳性率为96.7%(120例),平均拷贝数为1.8×108/ml;108份HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性的标本其阳性率为39.8%(43例),平均拷贝数为6.6×105/ml;11份HBsAg,HBcAb阳性的标本,其阳性率为36.4%(4例),平均拷贝数为5.7×105/ml。结论FQ-PCR能够准确定量及有效避免假阳性。FQ-PCR可以真实反应HBV的感染和复制情况,对乙型肝炎的诊断,治疗方案的选择和疗效观察有较大的指导意义。     

荧光定量PCR检测358例乙型肝炎病毒DNA结果分析

目的用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测血清中乙型肝炎病毒的数量以研究其临床价值.方法采用一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的实时检测定量PCR方法来检测358份临床血清标本.结果123份HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性的标本,阳性率为96.7%(120例),平均拷贝数为1.8×108/ml;108份HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性的标本其阳性率为39.8%(43例),平均拷贝数为6.6×105/ml;11份HBsAg,HBcAb阳性的标本,其阳性率为36.4%(4例),平均拷贝数为5.7×105/ml.结论FQ-PCR能够准确定量及有效避免假阳性.FQ-PCR可以真实反应HBV的感染和复制情况,对乙型肝炎的诊断,治疗方案的选择和疗效观察有较大的指导意义.     

荧光探针定量PCR检测HBV-DNA

本文采用荧光探针定量(FQ-PCR)法准确定量检测HBV-M阳性标本中的HBV-DNA数量.结果显示:HBeAg(+)组(32份)的阳性率为100%,HBV-DNA拷贝数范围在105～109/ml之间.HBeAb(+)组(47份)的阳性率为23.4%,HBV-DNA拷贝数范围在103～105.7/ml之间;HBsAb(+)组(37份)的阳性率为2.7%,HBV-DNA拷贝数为105/ml.以上44例HBV-DNA阳性拷贝数范围在103～109/ml之间.HBeAg(+)组血清中HBV-DNA含量(107.09±1显著高于HBeAb(+)组(104.7±1)和HBsAb(+)组(105).结果表明:HBV-DNA的FQ-PCR检测较常规PCR更具有较高的灵敏度和特异性,且定量准确,结果可靠,能避免PCR后处理污染导致的假阳性,可反映HBV真实感染和低复制状态.结合HBV-DNA含量测定判断HBV病毒复制状态,对临床诊断、治疗及判断预后具有重要的指导意义.     

两种乙型肝炎病毒DNA定量检测方法的比较与评价

目的：评价两种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA方法的特点，方法：用美国DIGENE公司生产的Hybrid Capture-II HBV DNA试剂（HC－Ⅱ）和深圳匹基生物工程股份有限公司生产HBV DNA定量荧光PCR检测试剂（PG），定量检测HBsAg阳性的慢性乙肝患者血清中的HBV DNA，结果：HC－Ⅱ试剂的HBV DNA检测阳性率高达98．6％，PG试剂达到94．6％，两者的符合率为93．2％。用系列稀释的患者血清，测定两种定量检测方法的灵敏度，PG试剂略高于HC－Ⅱ试剂，HCⅡ在HBVDNA浓度较高时的关系精度较好，而在HBV DNA低滴度时，两者的定量误差均加大。用两种HBV，DNA定量检测方法监测抗病毒药物治疗慢性乙型肝炎的疗效，所测定的HBV DNA滴度呈相同变化趋势。结论：两种HBV DNA定量检测方法均有较高的灵敏度，在抗病毒药物疗效观察方面有较高的应用价值。     

实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较

目的 评价应用国产试剂的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA中的临床应用。方法 基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR应用Roche公司Light Cycler仪器和国产达安试剂,PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)应用Roche公司COBAS Amplicor全自动内标法系统,用2种方法检测乙型肝炎患者血清中的HBV DNA,评价其灵敏度、精密度及相关性。结果 实时荧光定量PCR方法的灵敏度略低于PCR-ELISA全自动内标法,两者变异系数(CV)均较低,用2种方法检测临床标本,相关系数为0．890。结论 应用国产试剂配合Light Cycler仪器的实时荧光定量PCR具有较高的灵敏度和较好的重复性,并与PCR-ELISA全自动内标法有良好的相关性。     

实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较

目的评价应用国产试剂的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA中的临床应用。方法基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR应用Roche公司LightCycler仪器和国产达安试剂,PCR酶联免疫吸附试验(ELISA)应用Roche公司COBASAmplicor全自动内标法系统,用2种方法检测乙型肝炎患者血清中的HBVDNA,评价其灵敏度、精密度及相关性。结果实时荧光定量PCR方法的灵敏度略低于PCR ELISA全自动内标法,两者变异系数(CV)均较低,用2种方法检测临床标本,相关系数为0.890。结论应用国产试剂配合LightCycler仪器的实时荧光定量PCR具有较高的灵敏度和较好的重复性,并与PCR ELISA全自动内标法有良好的相关性。     

凝胶图像处理系统定量检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立一种聚合酶链反应（PCR）-凝胶图像处理系统定量分析核酸扩增产物的方法。方法 1、用PCR荧光定量分析仪实时监测PCR扩增曲线,并选择合适的扩增循环次数;2、将梯度标准乙型肝炎病毒（HBV）阳性血清（10^1-10^6拷贝/ul)分别进行40,35及32次循环次数的扩增,经琼脂糖电泳进行凝胶分析;3、选择凝胶分析软件中能客观反映核酸实际含量的最适参数,制定标准曲线,结果 40及35次循环时,在10^1-10^4拷贝/ul线性良好,而在10^4,10^5及10^6拷贝ul3个梯度时直线上升缓慢,趋于平坦,32次循环时,10拷贝/ul未能检出,10^2-10^6拷贝/ul的5个梯度的模板（对数值）与产物（体积）有良好的线性关系（r=0.97)。结论 32次循环线性范围较广,为最适循环次数;在UVIband的吸光度定量分析指标中,以体积或体积百分比作为定量指标较好。     

凝胶图像处理系统定量检测乙型肝炎病毒DNA

目的建立一种聚合酶链反应(PCR)-凝胶图像处理系统定量分析核酸扩增产物的方法。方法1.用PCR荧光定量分析仪实时监测PCR扩增曲线,并选择合适的扩增循环次数;2.将梯度标准乙型肝炎病毒(HBV)阳性血清(101～106拷贝/μl)分别进行40,35及32次循环次数的扩增,经琼脂糖电泳进行凝胶分析;3.选择凝胶分析软件中能客观反映核酸实际含量的最适参数,制定标准曲线。结果40及35次循环时,在101～104拷贝/μl线性良好,而在104,105及106拷贝/μl3个梯度时直线上升缓慢,趋于平坦。32次循环时,10拷贝/μl未能检出,102～106拷贝/μl的5个梯度的模板(对数值)与产物(体积)有良好的线性关系(r=0.97)。结论32次循环线性范围较广,为最适循环次数;在UVIband的吸光度定量分析指标中,以体积或体积百分比作为定量指标较好。     

乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法,并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物,并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件;将T载体与HBVRT区扩增后纯化的产物进行连接反应,然后转染大肠杆菌（DH5a）,经蓝、白斑筛选后挑取阳性菌落,提取质粒,制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1：10的缓冲液倍比稀释,制作标准曲线,线性方程为：Y=-3．344X＋37（r2=0．9999）;通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA,表明其最低检测限为5×10^2 IU／mL;拷贝数介于5×10^2～5×10^8 IU／mI。之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法;该方法可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药;联合该法与血清标志物检测,可更准确评价HBV感染者病情。     

双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征

目的建立快速诊断唐氏综合征的荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）方法及其应用于产前诊断唐氏综合征的可能性。方法合成21号染色体单拷贝基因DSCR1特异的引物和TaqMan探针以及1对非21号常染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和TaqMan探针,其中检测DSCR1基因的探针标记6-羧基荧光素（FAM）,检测GAPDH基因的探针标记六氯（HEX）荧光素;提取患者和正常人外周血及胎儿羊水脱落细胞标本的DNA为模板,在同-PCR扩增管中同时进行2种基因的双色荧光定量聚合酶链反应（the double chromatography fluorescence quantitative polymerase chain reaction,DC—FQ—PCR）,分别定量测定DSCR1基因和GAPDH基因的含量,并计算每个标本2种基因剂量的比值;采用该基因检测技术检测23例唐氏综合征患者、20名正常人和100例羊水,与染色体检查诊断结果对比,判断该技术在唐氏综合征基因诊断和产前诊断中的应用价值。结果在30μLFQ—PCR反应体系中,加入最少约0．05ng基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;实验表明23例染色体检测为唐氏综合征患者的GAPDH与DSCRl的差值为0．65±0．17,以2^-△CT方法计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1．77～1．39。而20例染色体检测为正常人的GAPDH与DSCR1的差值为0．06±0．18,计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1．18～0．92;2组问的差异有统计学意义。在100例羊水细胞的检测中,以DSCR1与GAPDH拷贝数的比值大于1．35为唐氏综合征的判定标准,发现2例为患儿,其余98例为正常,与染色体检查结果一致。结论双色荧光定量PCR检测唐氏综合征是一个可行的、快速的、准确的、高通量的、费用较为低廉的检测方法,该法在唐氏综合症的基因诊断和产前基因诊断具有广阔的应用前景。     

双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征

目的建立快速诊断唐氏综合征的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法及其应用于产前诊断唐氏综合征的可能性。方法合成21号染色体单拷贝基因DSCR1特异的引物和TaqMan探针以及1对非21号常染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和TaqMan探针,其中检测DSCR1基因的探针标记6-羧基荧光素(FAM),检测GAPDH基因的探针标记六氯(HEX)荧光素;提取患者和正常人外周血及胎儿羊水脱落细胞标本的DNA为模板,在同一PCR扩增管中同时进行2种基因的双色荧光定量聚合酶链反应(the double chromatogra-phy fluorescence quantitative polymerase chain reaction,DC-FQ-PCR),分别定量测定DSCR1基因和GAPDH基因的含量,并计算每个标本2种基因剂量的比值;采用该基因检测技术检测23例唐氏综合征患者、20名正常人和100例羊水,与染色体检查诊断结果对比,判断该技术在唐氏综合征基因诊断和产前诊断中的应用价值。结果在30μL FQ-PCR反应体系中,加入最少约0.05 ng基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;实验表明23例染色体检测为唐...     

实时荧光定量PCR法检测鼻咽癌患者血浆游离EB病毒DNA的临床应用

目的 了解本地区鼻咽癌（NPC）患者血浆游离EB病毒DNA（EBV—DNA）的检出状况,探讨其诊断价值和临床意义。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术对110例鼻咽癌患者和91例其他恶性肿瘤患者（对照组）进行血浆EBV～DNA检测。结果 NPC患者EBV-DNA阳性率为56．4％（62／110）,对照组阳性率为8．8％（8／91）,经Х^2检验,Х^2=32．36,P〈0．01。男性NPC患者外周血浆EBV-DNA的阳性率为64.4％（47／73）,女性患者阳性率为40．5％（15／37）,经Х^2检验,二者差异有统计学意义（Х^2=5．67,P〈0.05）。62例血浆EBV-DNA阳性的NPC患者的拷贝数与8例血浆EBV—DNA阳性的其他恶性肿瘤患者的拷贝数比较,差异无统计学意义（经Wilcoxon非参数秩和检验,uc=1．57,P〉0．05）。结论 FQ-PCR检测血浆EBV-DNA对NPC辅助诊断有很高的临床实用价值,男性NPC患者对EBV的免疫力低于女性,更易受侵,其原因与机制有待进一步研究。     

实时荧光聚合酶链反应技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术检测慢性乙型肝炎(CHB)患者在使用拉米夫定过程中,乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的发生情况,并研究影响变异发生的相关因素,为临床预测和判断HBV YMDD变异提供一定的依据。方法选择50例CHB患者作为拉米夫定治疗组,30例CHB患者作为对照组。采用实时荧光PCR方法分别检测两组在用药期间HBV YMDD变异的发生情况,同时采用荧光定量PCR方法检测治疗组在用药前后HBV DNA水平。结果治疗组在用药52周时的变异率24.0%,明显高于对照组52周时的变异率3.3%(P<0.05);治疗组在用药52周时的变异率24.0%,明显高于用药26周时的变异率4.0%(P<0.05);治疗前HBV DNA水平较高组(28例)患者在用药52周时的变异率(35.7%)明显高于HBV DNA水平较低组(22例)患者的变异率(9.1%)(P<0.05);治疗组中未变异的38例患者在用药52周时的HBV DNA阴转率(65.8%)明显高于变异的12例患者的HBV DNA阴转率(16.7%)(P<0.05)。结论拉米夫定可导致HBV YMDD变异的产生,并且该变异的发生率随着拉米夫定的用药时间的延长而增加;HBV YMDD变异的发生同血清HBV DNA水平相关。     

荧光定量聚合酶链反应检测在肺结核诊断中的应用价值

目的分析荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(TbDNA)在诊断肺结核中的应用价值。方法选择2018年1月-2020年1月湖南省儿童医院收治的21例肺结核患儿作为肺结核组,另外选择同时期21例排除肺结核感染的肺部疾病患儿作为非肺结核组。全部患儿均行痰涂片抗酸染色镜检、纤维支气管镜(纤支镜)痰涂片抗酸染色镜检和BALF中TbDNA荧光定量PCR检测。比较3种检测方法对肺结核诊断的特异度、敏感度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果痰涂片抗酸染色镜检、纤支镜痰涂片抗酸染色镜检和荧光定量PCR的敏感度分别为19.05%、14.29%、76.19%,特异度分别为100.00%、100.00%、95.24%,PPV分别为100.00%、100.00%、94.12%,NPV分别为55.26%、53.85%、80.00%。荧光定量PCR检测BALF中TbDNA的敏感度明显高于痰涂片抗酸染色镜检和纤支镜痰涂片抗酸染色镜检(76.19%比19.05%、14.29%),差异有统计学意义(P<0.05);3种检测方法的特异度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA,具有快速、敏感度高、特异度高的特点,利于早期诊断肺结核,尤其是对于痰涂片检测呈阴性及无典型影像学特征的患儿,可以明显提高确诊率,其结果能够作为诊断肺结核的主要指标。     

实时荧光定量 PCR 检测 HBV DNA 的线性范围与最低检出限的验证

目的：试用实时荧光定量 PCR 定量检测乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）,求出其线性范围与最低检出限,从而对本实验室检测 HBV DNA 的主要性能进行验证。方法参照相关的文件,通过系列稀释高浓度标本得到超过厂家申明线性范围的系列浓度标本,进行线性范围的验证;通过系列稀释低浓度标本得到超过厂家申明最低检出限的系列浓度标本,进行最低检出限的验证。结果 HBV DNA 检测的线性范围为8．58＆#215;102～8．41＆#215;107 IU/mL,最低检出限为4．07＆#215;102 IU/mL。结论实时荧光定量 PCR 检测 HBV DNA 的线性范围与最低检出限达到预期要求,检测方法和验证方案简便、可行。     

利用实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌

目的 建立针对粪便标本中伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中伤寒沙门菌的检出率。 方法 根据伤寒沙门菌特异基因STY1633设计特异性引物,优化反应条件,建立实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)反应体系。利用92株常见的非伤寒病原菌及44株伤寒沙门菌的染色体DNA评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者粪便标本及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。 结果 利用本方法检测的伤寒沙门菌纯菌及伤寒患者标本均扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检测中,qPCR法的最低检测限为500 fg/反应,相当于97个拷贝/反应。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前检测下限达104 cfu/g,增菌后可达50 cfu/g。 结论 基于STY1633基因的实时荧光定量PCR方法在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度,为伤寒沙门菌的快速诊断及某些不明原因发热及腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段,对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持。     

细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）加反相杂交技术在细菌ＤＮＡ检测中的应用。方法以１６ＳｒＲＮＡ基因为靶序列，设计引物及寡核苷酸探针，采用ＰＣＲ法加反相杂交检测标准菌株及临床标本的细菌ＤＮＡ。结果对２４株不同标准菌株进行ＰＣＲ扩增，均出现３７１ｂｐ长度的ＤＮＡ片段，敏感性试验可检测出１０－１２ｇ的细菌ＤＮＡ，与人类基因组ＤＮＡ、真菌及病毒无交叉反应；２２例血培养阳性标本及４例脑脊液培养阳性标本均扩增出３７１ｂｐ长度ＤＮＡ条带，反相杂交法区分革兰阳性／阴性细菌与培养结果相符。结论１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ加反相杂交技术检测细菌ＤＮＡ，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为细菌感染的临床诊断提供了科学的依据     

荧光偏振检测血清中HBV 多聚酶基因突变

目的建立简便、多重HBV 多聚酶基因序列中拉米呋啶耐药性相关的基因突变的检测方法.方法采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测.对HBV多聚酶基因进行PCR扩增,然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交,使探针的3′可以在DNA聚合酶的作用下,依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的ddNTP,然后检测该3′端带有荧光素的探针,根据检测到的荧光素种类和偏振光的强度判定待测点是何种核苷酸.结果该方法可以检测出HBV 多聚酶基因序列中特定位置的核苷酸类型,能检测1×101个拷贝的模板量.对30例经过6个月以上拉米呋啶治疗的患者血清进行检测,检测出其中有3例是甲硫氨酸(M)密码子ATG中的A→G变异;2例是ATG中的G→C变异;1例是ATG中的G→T.结论该技术可以对血清中HBV 多聚酶基因序列中点突变以及其他基因突变进行检测.