超声微泡破坏技术不同辐照强度对兔心肌的生物学效应研究

目的研究超声微泡破坏技术不同辐照强度对兔心肌细胞及心肌组织的生物学效应,优化出影响兔心肌的最佳辐照条件。方法用不同强度0.5、0.75、1.0、1.5W/cm~2辐照心肌细胞与微泡的混合物,辐照时间30s,间隔10s,再辐照30s,显微镜下观察心肌细胞形态结构变化。20只日本大耳白兔随机分为4组,分别用上述强度及时间辐照兔心肌组织,行HE染色。结果不同功率辐照后IVS、LVPW运动幅度及EF与FS差异无统计学意义。0.5 W/cm~2和0.75 W/cm~2辐照后心肌细胞形态未见明显改变,1.0W/cm~2及1.5W/cm~2辐照后少量心肌细胞出现轻度及以上损伤表现。0.5W/cm~2辐照后心肌组织无水肿、出血;0.75W/cm~2出现轻微水肿,无出血;1.0W/cm~2及1.5W/cm~2辐照后心肌组织出现少量出血并炎细胞浸润。结论超声辐照强度在1.0W/cm~2以下时不会造成心肌细胞及组织损伤,1.0W/cm~2以上时能使兔心肌产生轻度损伤及一定程度的炎症反应。     

低频超声辐射微泡造影剂对人乳腺癌细胞的生物学效应研究

目的观察微泡造影剂不同浓度、不同声学参数对体外培养人乳腺癌细胞的生物学效应。方法人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,受不同剂量,频率为300kHz的超声波辐照破坏微泡声学造影剂,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率。结果在微泡浓度为5%时,0.25W/cm2×10s与0.5W/cm2×5s组细胞存活率未见明显改变,而0.5W/cm2×10s、0.5W/cm2×20s、0.5W/cm2×40s、1.0W/cm2×10s、2.0W/cm2×10s各组与对照组比较,细胞存活率明显下降。辐照强度为0.5W/cm2、照射时间10s时,随着微泡浓度增加,超声对细胞的杀伤效应越强,与对照组相比,5%微泡浓度组P<0.05,其余各组P<0.01。结论超声破坏微泡声学造影剂对人乳腺癌细胞的杀伤程度与超声辐照时间、声强及微泡浓度有关。     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

超声联合微泡对正常兔角膜组织的生物学效应

目的观察不同声强和辐照时间的超声破坏微泡对兔正常角膜组织的生物学效应。方法采用不同声强(0.5W/cm2、1.0W/cm2、2.0W/cm2)和辐照时间(30s、60s、120s)的超声作用于微泡干预的兔眼角膜,并对角膜进行定量分析和病理组织观察。结果超声声强1.0W/cm2、2.0W/cm2与0.5W/cm2组比较,角膜组织损害严重,内皮细胞密度和六角形细胞比例差异有统计学意义(P<0.05);超声辐照时间120s与30s、60s比较,内皮细胞密度和六角形细胞比例有差异有统计学意义(P<0.05)。结论超声联合微泡能明显增强角膜组织的空化效应,且超声能量越大,角膜组织损害越严重。     

原子力声显微镜评价超声靶向微泡破坏法对大鼠心肌母细胞的影响

目的 探讨运用原子力声显微镜评价超声靶向微泡破坏法对大鼠心肌母细胞(H9C2)影响的可行性.方法 采用不同超声参数对H9C2细胞进行辐照处理.使用原子力声显微镜观察细胞骨架、形态结构的改变;采用台盼蓝染色法及荧光物质转入法检测细胞存活率及细胞膜通透性变化.结果 (1)通过比较辐照后H9C2细胞生存率及发光率变化,适宜参数为:频率1 MHz,声强1.0 W/cm2,占空比20％,辐照时间60 s;(2)原子力声显微镜可以完整显示H9C2细胞的形态结构,以形态像、声学像及三维像的差异区分细胞损伤的程度.结论 原子力声显微镜能够准确评估不同超声辐照参数对H9C2细胞的影响,优化超声靶向微泡破坏法转染参数.     

超声破坏微泡对心肌细胞膜通透性影响的研究

目的探讨超声破坏微泡造影剂对心肌细胞膜通透性的影响。方法将15只昆明小白鼠随机分为3组,一组采用尾静脉输入白蛋白微泡造影剂,胸壁用频率为1MHz,强度为1.5W/cm2的超声进行辐照1min;一组单纯采用同等超声辐照相同时间;一组作为对照。作用后即刻取心肌组织用硝酸镧(La)示踪法做透射电镜观察心肌细胞膜通透性的变化。结果采用超声破坏微泡后可见部分镧颗粒分布于心肌细胞胞浆内,部分分布于线粒体外、细胞核外;单纯超声作用组心肌细胞胞浆中可有少量的镧颗粒分布,而大部分镧颗粒分布于细胞膜外;而对照组镧颗粒分布于心肌细胞膜外。结论超声破坏微泡可提高心肌细胞膜通透性,可能是超声微泡造影剂增强组织中基因转染的机制之一。     

超声辐照微泡促进犬骨髓间充质干细胞归巢到心肌缺血部位的实验研究

目的 观察超声辐照微泡对犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)归巢到心肌缺血部位的作用.方法 6只健康杂种犬开胸建立心梗模型,随机分成实验组和对照组.1周后,实验组:经胸用频率为1 MHz,声强为1.0W/cm2的脉冲超声辐照,辐照10 min,同时静脉注射2 ml微泡造影剂.辐照完毕后经导管在冠脉口注射5 ml(浓度为1.35×106个/ml)用DAPI标记的MSCs.对照组不经超声辐照微泡单纯注射MSCs.5 d后处死动物,取心肌梗死边缘区组织,进行病理组织HE染色和激光共聚焦观察MSCs归巢到心肌缺血区情况.结果 病理组织HE染色观察到实验组心肌毛细血管外有红细胞漏出,而对照组未见红细胞漏出;激光共聚焦观察到实验组心肌组织内分布的MSCs明显比对照组多.结论 超声辐照微泡可促进MSCs归巢到心肌缺血部位,而对心肌组织无明显损伤.     

经多功能心腔内超声导管超声辐照破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应

目的观察经多功能心腔内超声(ICE)导管超声辐照破坏微泡对动物心肌产生的生物学效应,探索基因治疗缺血性心脏病的新方法。方法 15只犬随机分为US+MB组、US组、对照组3组,每组5只。以介入法将多功能ICE导管送入犬心室。对US+MB在ICE监控下向左心室游离壁注射0.5ml微泡,并以1 W/cm2的声能对注射部位辐照1min;对US组以相同条件行左心室壁辐照,但不注射微泡;对照组在插入导管后不进行任何处理。术后3天处死动物,观察心肌组织大体改变,并行HE染色观察细微结构变化。结果ICE能对注射针的进针深度、微泡注射及辐照过程进行实时监控。观察期内所有动物均正常存活。US+MB组心肌辐照部位出现充血、心肌细胞间隙增宽、少量炎性细胞浸润等改变,US组心肌组织仅出现轻微充血;对照组动物心肌无异常变化。结论经ICE导管超声辐照破坏微泡能在靶区域产生相应生物学效应,内置ICE可对心肌内微泡注射、超声辐照过程进行实时监控。此款新型多功能导管可能为基因治疗缺血性心脏病提供新的、更加安全有效的途径。     

正交设计法优化低频超声联合微泡抑制小鼠前列腺癌细胞血管内皮生长因子表达的实验研究

目的采用正交实验设计法,探究低频超声联合微泡抑制小鼠前列腺癌细胞(RM-1)血管内皮生长因子(VEGF)表达的最优参数组合。方法选定超声功率、超声频率、辐照时间、微泡/细胞悬液体积比为正交优化的4个因素,每个因素设定4个水平,分别为超声频率:20 k Hz、80 k Hz、500 k Hz及800 k Hz;超声功率:100 m W/cm2、180 m W/cm2、270 m W/cm2及360 m W/cm2;辐照时间:30 s、60 s、90 s及120 s;微泡/细胞悬液体积比:10%、20%、30%、40%,按照四因素四水平设计正交实验表,得到16个实验组,各组按相应条件采用连续波辐照后细胞继续培养24 h,定量RT-PCR检测各组VEGF m RNA表达量从而获取最优组合条件。将小鼠RM-1细胞均分4组:对照组不进行任何处理;单独超声组采用正交实验设计法所得最优组合条件辐照细胞,但不加入微泡;单独微泡组仅加入最优百分体积的微泡;低频超声联合微泡组采用正交实验设计法所得最优组合条件辐照并加入最优百分体积微泡。各组处理后,即刻台盼蓝染色观察细胞的损伤情况;培养24 h后,采用Western blot印迹法检测小鼠RM-1细胞中VEGF表达量。结果抑制小鼠RM-1细胞VEGF m RNA表达的影响因素由大到小依次为:超声频率、超声功率、微泡/细胞悬液体积比、辐照时间;各因素不同水平的影响程度由大到小依次为:1超声频率:800 k Hz、500 k Hz、80 k Hz、20 k Hz;2超声功率:360 m W/cm2、180 m W/cm2、270 m W/cm2、100 m W/cm2;3辐照时间:30 s、90 s、120 s、60 s;4微泡/细胞悬液体积比:20%、10%、40%、30%。正交实验设计法所得最优组合条件为:超声频率800 k Hz、超声功率360 m W/cm2、超声辐照时间30 s及微泡/细胞悬液体积比20%。低频超声联合微泡组损伤细胞多于其他各组,单独超声组可见少量损伤细胞,对照组和单独微泡组损伤细胞极少。低频超声联合微泡组VEGF表达量少于其他各组,单独超声组表达量也少于对照组和单独微泡组,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论低频超声联合微泡造影剂抑制小鼠RM-1细胞VEGF m RNA表达的最优组合条件为:超声频率800 k Hz,超声功率360 m W/cm2,超声辐照时间30 s,微泡/细胞悬液体积比20%。在此实验条件下可以显著抑制VEGF的最终表达量。     

低频超声辐照联合微泡对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的观察低频超声辐照联合微泡对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法联合不同浓度的SonoVue(0、0.5×106、1.0×106、1.5×106、2.0×106/mL),使用42.6kHz超声分别辐照大鼠主动脉平滑肌细胞10s、20s、30s,空白对照组不作任何处理。台盼蓝染色分析辐照后即刻细胞存活率,流氏细胞仪观察辐照后24h细胞凋亡率。结果细胞的死亡和凋亡与微泡浓度及辐照时间相关。当超声波在微泡浓度达到或超过0.5×106/mL,联合辐照30s,以及微泡浓度达到2.0×106/mL,联合辐照10s、20s时,细胞大量死亡。在超声辐照10s时,辐照后24h细胞凋亡率随微泡浓度的增加而增加,但在微泡浓度低于1.0×106/mL时,细胞即刻存活率并无显著减少。在超声辐照20s时,细胞即刻存活率随微泡浓度的增加而减少,辐照后24h细胞凋亡率在微泡浓度为0.5×106/mL、1.0×106/mL、1.5×106/mL时差异无统计学意义。结论在一定空化强度范围内,低频超声辐照后24h细胞凋亡率随强度增加而增加,但超过一定程度,则无法增加细胞凋亡率,只会导致细胞死亡。低频超声辐照联合微泡的空化作用可在短时间内诱导体外培养的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。     

不同超声强度及微泡对基因和组织作用的实验研究

目的探讨不同强度超声破坏微泡对绿色荧光蛋白质粒(green fluorcscent protein，GFP)和小鼠骨骼肌组织的作用。方法分别用0．5w／cm^2、1．0w／cm^2、2．5w／cm^2的超声作用于基因及基因和微泡的混合物2min，琼脂糖凝胶电泳观察质粒基因的电泳图谱变化。并将昆明小白鼠16只分为4组，尾静脉输入白蛋白微泡，同时分别用(0．5w／cm^2、1．0W／cm^2、2．0W／cm^2、2．5w／cm^2的超声作用于小鼠骨骼肌2min．取局部组织HE染色观察超声破坏微泡后组织显微结构的变化。结果不同能量的超声和微泡作用后GFP质粒的电泳图谱结果无变化。0．5w／cm^2超声破坏微泡后无血管充血及红细胞渗出；1．0W／cm^2超声破坏微泡后可引起约30％血管充血，极少量红细胞渗出；2．0W／cm^2超声破坏微泡后可引起约60％血管充血，红细胞渗出较明显；2．5W／cm^2的超声破坏微泡后可使部分骨骼肌变性。结论用1．0W／cm^2和2．0W／cm^2超声作用2min后引起血管充血，红细胞渗出；2．5W／cm^2超声作用2min破坏微泡后可损伤组织。1．0～2．0W／cm^2超声强度破坏微泡后对GFP质粒无明显的损害。     

超声破坏微泡联合粒细胞集落刺激因子促进大鼠心肌血管新生的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)促进大鼠心肌血管新生的有效性.方法 40只健康成年Wistar大鼠随机分为4组.A组在超声微泡治疗前一天行G-CSF皮下注射预处理;B组仅行超声微泡治疗;C组仅行G-CSF皮下注射;D组为对照.于治疗后2周取材,HE染色光镜观察心肌结构变化,免疫组化法检测心肌组织中VEGF及CD34表达,评定心肌血管新生疗效.结果 A组心肌中有大量VEGF和CD34表达,新生血管较多;B组心肌中有部分VEGF和CD34表达,新生血管相对较少;C组及D组仅有极少量VEGF和CD34表达,未见明显新生血管.结论 超声微泡可刺激心肌内源性VEGF分泌,促进心肌血管新生,G-CSF能明显增强其血管新生作用.     

Targeted delivery of bone mesenchymal stem cells by ultrasound destruction of microbubbles promotes kidney recovery in acute kidney injury

The aim of the present study was to explore whether ultrasound microbubble destruction augments site-targeted engraftment of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) to kidney tissue and promotes recovery of the kidney in acute kidney injury (AKI) in rats. AKI was induced by the subcutaneous injection of mercuric chloride (HgCl₂). Forty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into the following groups after the establishment of rat models of AKI (n = 10): (1) Model group alone (control group); (2) 1.0 W/cm² ultrasound (US) + microbubble (MB) (US/MB group); (3) MSCs group; and (4) 1.0 W/cm² US+MB + MSCs group (US/MB + MSCs group). The number of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) labelled MSCs was evaluated by fluorescence microscopy and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting and histological examination were performed 7 days after MSCs transplantation. It was observed via fluorescence microscopy that the number of DAPI-labelled MSCs in the kidney for the US/MB + MSCs group was significantly more than the MSCs group (p < 0.05). The results from RT-PCR revealed that the US/MB and US/MB + MSCs groups markedly increased the level of inter-cellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) messenger ribonucleic acid (mRNA) compared with the control group and the MSCs group (p < 0.05). Western blot analysis showed that the expression of hepatocyte growth factor (HGF) and epidermal growth factor (EGF) in the US/MB + MSCs group were markedly increased compared with the all other groups (p < 0.01). The extent of tubular necrosis and dilation was significantly milder in the US/MB + MSCs group (acoustic exposure conditions: 5s at 1 MHz and 1.0 W/cm² with a 5s pause, totalling 60 s) than the all other groups (p < 0.05). Microbubble destruction by 1.0 W/cm² ultrasound can promote both the homing of BM-MSCs to kidney tissue and the recovery of the kidney in AKI in rats.     

超声辐射微泡配合内皮祖细胞移植治疗糖尿病大鼠阴茎勃起功能障碍

目的探讨超声微泡配合内皮祖细胞(EPCs)移植至海绵体组织治疗大鼠糖尿病阴茎勃起功能障碍的可行性。方法体外培养、分离EPCs。将54只成功建立糖尿病勃起功能障碍模型的SD大鼠随机分为空白对照组、EPCs治疗组、1.0W/cm2超声+微泡+EPCs组(US+MB+EPCs治疗组)。EPCs移植7天后,以脱水吗啡(APO)诱导实验检测大鼠阴茎勃起次数和勃起率,组织学观察阴茎海绵体,计数毛细血管数目,计算血管密度,免疫组化检测EPCs移植大鼠阴茎海绵体的情况,Western blot检测VEGF蛋白的表达。结果 US+MB+EPCs治疗组勃起次数和勃起率、毛细血管密度、EPCs染色强度的阳性指数均高于其他两组(P均<0.05),且VEGF蛋白表达水平最高(P<0.05)。结论超声微泡联合EPCs移植可提高EPCs的转染率和靶向性,改善糖尿病大鼠的阴茎勃起功能。     

Bioeffects of Ultrasound-Stimulated Microbubbles on Endothelial Cells: Gene Expression Changes Associated with Radiation Enhancement In Vitro

Ultrasound can be used to target endothelial cells in cancer therapy where the destruction of vasculature leads to tumor cell death. Here, we demonstrate ultrasound bioeffects in which the levels of genes in endothelial cells can be significantly altered by ultrasound-stimulated microbubble exposure. These were compared with established effects of radiation on endothelial cells at a gene level. Human-endothelial cells were exposed to ultrasound and microbubbles, radiation or combinations of ultrasound, microbubbles and radiation. Gene expression analyses revealed an up-regulation of genes known to be involved in apoptosis and ceramide-induced apoptotic pathways, including SMPD2, UGT8, COX6B1, Caspase 9 and MAP2K1 with ultrasound-stimulated microbubble exposure but not SMPD1. This was supported by immunohistochemistry and morphologic changes examined with cell microscopy, which showed changes in SMPD1 gene product in cells with microbubble exposure. This supports the hypothesis that ultrasound-stimulated microbubbles can induce significant bioeffect-related changes in gene expression and can affect ceramide signaling pathways in endothelial cells, leading to apoptosis.     

超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及介导VEGF基因转染大鼠心肌的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及其介导VEGF基因转染大鼠心肌的有效性。方法 18只健康雄性Wistar大鼠，取3只采用超声波在鼠胸壁破坏微泡造影剂，观察对心肌组织显微结构的影响。将另15只急性心肌梗死3天后的雄性Wistar大鼠分为3组，每组5只。第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式，将pcDzVEGFm基因转染大鼠心肌至造影剂不再显影(约6min)；第二组尾静脉输入同等剂量携pcD。VEGF。基因的造影剂；第三组为对照。2周后，取缺血心肌组织行VEGF免疫组织化学染色，观察心肌组织血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况。结果超声波破坏微泡造影剂能使心肌组织充血，产生大量空泡，并有部分心肌细胞坏死。采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染，能明显增强大鼠心肌组织VEGF蛋白的表达。结论 超声微泡造影剂能明显增强对组织的空化效应，其介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。     

超声微泡转染前列腺癌细胞的参数筛选

目的观察不同辐照参数下超声微泡对前列腺癌细胞生长及基因转染效率的影响。方法采用噻唑兰比色法检测单纯超声、单纯微泡、超声辐照微泡对前列腺癌细胞生存率的影响。荧光显微镜观察超声微泡介导的质粒为EGFP基因与HSV l-TK基因共表达载体。观察它对前列腺癌细胞PC-3转染后荧光表达情况,Westernblot检测EGFP蛋白的表达情况。结果 MTT显示超声强度为1.0W/cm2,频率为1MHz,辐照时间30s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;采用不同浓度的微泡对前列腺癌细胞PC-3作用24h后,各实验组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);当采用最适的超声辐照时间辐照微泡浓度为10、20、40、80μL时,超声+微泡(80μL)组细胞存活率低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而10、20、40μL组中细胞生长良好;转染EGFP后48h,在荧光显微镜观察对照组未见荧光表达,其他各组中均有荧光表达,并随着微泡剂量的增加,荧光表达量增多;Western blot检测显示各处理组中均有EGFP蛋白的表达,超声+微泡(20μL)+TK(1μg)组、超声+微泡(40μL)+TK(1μg)组的EGFP蛋白表达明显高于其他各组。结论在最适辐照参数下,超声微泡造影剂能够有效地促进TK基因的转染。     

新型白蛋白微泡经超声介导破裂促进EGFP基因在Cos-7细胞的表达

目的：根据超声介导白蛋白微泡破裂空化效应可以增加真核细胞膜对大分子(如DNA)通透性的原理，探讨一种新的转基因方法，以便安全有效和定向地转移目的基因。方法：实验中选择绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因，以自制的白蛋白微泡为载体，用超声介导微泡破裂的方法在体外进行Cos—7细胞的基因转化，同时以脂质体为对照，激光共聚焦显微镜和流式细胞计数仪分别定性和定量观察细胞转化效率。锥虫蓝染色观察细胞的活性。结果：体外试验发现0．8MHz、1．0W／cm^2、10％占空比(dutycycle)、60s超声介导10％白蛋白微泡破裂可以有效稳定地转化EGFP基因在Cos—7细胞表达，且对细胞无毒副作用。结论：自制白蛋白微泡是一种安全、有效的新型基因载体，在一定超声条件控制下，能增强基因的转导与表达，有良好的靶向性，提示该技术有应用于临床基因治疗的广阔前景。