神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP-43基因表达的影响

目的:研究海马源性神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后生长相关蛋白43(GAP-43)及脑源性神经营养因子(BDNF)基因表达的影响,探讨神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的机制.方法:NSCs提取自新生胎鼠的海马区,经过培养及鉴定.实验分为3组:NSCs移植组、DMEM填充组、正常对照组.大鼠SCI后第7d移植NSCs,应用RTPCR法观察NSCs移植后,大鼠脊髓损伤区GAP-43和BDNF基因表达的变化.结果:NSCs移植组较单纯损伤组明显增强了GAP-43mRNA与BDNFmRNA的表达.结论:NSCs移植后改变脊髓损伤区的微环境,上调BDNFmRNA,促进GAP-43mRNA的表达,是修复脊髓损伤的机制之一.     

骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP-43基因表达的影响

[目的]研究骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后生长相关蛋白43(GAP-43)及脑源性神经营养因子(BDNF)基因表达的影响,探讨骨髓基质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的机制.[方法]大鼠SCI后第7 d移植MSCs,应用RT-PCR法观察MSCs移植后,大鼠脊髓损伤区GAP-43和BDNF基因表达的变化.[结果]MSCs移植组较单纯损伤组明显增强了GAP-43 mRNA、BDNFmRNA的表达.[结论]MSCs移植后改变脊髓损伤区的微环境,上调BDNFmRNA,促进GAP-43 mRNA的表达,是修复脊髓损伤的机制之一.     

神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后胶质细胞源性神经营养因子与生长相关蛋白43基因表达的影响

目的研究海马源性神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)后胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)及生长相关蛋白43(growth associatedprotein43,GAP-43)基因表达的影响,探讨NSCs移植修复大鼠脊髓损伤的机制。方法新生一日龄Wistar大鼠6只,提取海马区NSCs,进行培养及鉴定。Wistar成年大鼠以改良Allen打击装置制成SCI模型。将Wistar大鼠60只分为3组:A组NSCs移植(n=24)、B组单纯损伤DMEM填充(n=24)、C组正常对照组(n=12)。于术后第1、3及7天应用RT-PCR法观察,各组大鼠脊髓区GDNF和GAP-43基因表达的变化。结果移植术后第1天,A组GDNF mRNA的表达量较B组平均增加23.3%;第3天,较B组平均增加26.8%;第7天,较B组平均增加32.7%。移植术后第1天,A组GAP-43mRNA的表达量较B组平均增加19.5%;第3天,较B组平均增加21.6%;第7天,较B组平均增加23.1%。A组较B组明显增强了GDNFmRNA和GAP-43mRNA的表达,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。C组各时间点GDNF及GAP-43mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论NSCs移植后改变脊髓损伤区局部的微环境,上调GDNFmRNA,促进GAP-43mRNA的表达,是修复脊髓损伤的机制之一。     

神经干细胞移植促进脊髓损伤后脑源性神经营养因子的表达

目的：探讨神经干细胞（NSCs）移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响及其意义。方法：NSCs提取自新生Wistar大鼠的海马区，经培养、鉴定。制作大鼠脊髓损伤（SCI）模型，于伤后第7天移植NSCs。实验分为3组：NSCs移植组（A组），DMEM填充组（B组），正常对照组（C组）。应用RT—PCR法和免疫组化法观察细胞移植后BDNF基因表达的变化。结果：RT—PCR结果分析，移植术后第1、3、5天，A组BDNF mRNA的表达量明显高于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。组化结果分析，移植术后第7、14、28天BDNF的表达量A组明显高于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：NSCs在移植后可上调脑源性神经营养因子BDNF基因的表达，是其修复脊髓损伤的机制之一。     

神经干细胞移植对脊髓损伤后PLP基因表达的影响

目的：研究神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后髓鞘蛋白前脂蛋白(PLP)基因表达的影响，探讨神经干细胞移植促进大鼠SCI后髓鞘再生的机制。方法：NSCs由5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷标记法(Brdu)标记。实验分为3组：NSCs移植组(A组)、DMEM填充组(B组)、正常对照组(C组)。大鼠SCI后第7d移植NSCs，应用免疫组化和RT—PCR法观察NSCs移植后是否存活，以及大鼠脊髓损伤区PLP基因表达的动态变化。结果：NSCs移植后在受体脊髓内存活，NSCs移植组较单纯损伤组明显促进了PLP基因在分子和蛋白水平的表达。结论：NSCs移植后可存活并促进PLP基因的表达，是促进脊髓损伤后髓鞘再生的机制之一。     

脑源性神经营养因子基因修饰神经干细胞对体外培养的脊髓背根神经节细胞的生物学作用

目的建立稳定表达脑源性神经营养因子(BDNF)基因的神经干细胞并观察其对于体外培养的脊髓背根神经节(DRG)细胞存活及突起生长的影响。方法以PCR技术从人脑cDNA文库中获取人BDNF基因片段。采用分子克隆技术构建带有绿色荧光蛋白报告基因的多顺反子的MSCVBDNFIRES2EGFP重组鼠干细胞病毒表达载体,病毒经PT67细胞包装后感染神经干细胞株C17.2。通过免疫组化,RTPCR,ELISA检测BDNF的表达,在双室共培养系统中共培养3,10d后观察经筛选的稳定表达株对原代培养DRG细胞的生物学作用。结果RTPCR证实BDNF基因在C17.2细胞中转录,ELISA分析显示转基因C17.2培养上清中在转染24h后即可检测到BDNF表达,并在3个月后仍表达(14.6±0.8)ng·d-1·10-1细胞;免疫细胞化学显示,与对照组相比较,BDNF基因修饰的神经干细胞组,DRG细胞突起生长较长交织呈网状的,节细胞存活较多。结论干细胞病毒介导转染的BDNF基因能够在神经干细胞C17.2中稳定表达,并且BDNF基因修饰的神经干细胞对体外培养的DRG细胞的存活及突起、延伸具有显著促进作用。     

嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓组织中BDNF表达的影响及意义

目的 观察嗅鞘细胞(OEC)移植治疗大鼠脊髓损伤的作用以及脊髓损伤组织中脑源性神经营养因子(BDNF)表达的变化,从神经营养因子角度探讨OEC移植修复脊髓损伤的机制.方法 分离和培养绿色荧光蛋白转基因大鼠的OEC,备移植用.取SD大鼠制备脊髓损伤模型,用随机数字表法将建模成功后的SD大鼠分为2组.实验组:建模成功后立即进行OEC移植,移植部位为脊髓损伤处及其首尾正中血管的左右两侧;对照组:用DMEM/F12培养液替代OEC悬液,操作同实验组.移植后对各组大鼠的运动功能进行评分,每周1次.采用实时逆转录聚合酶链反应检测BDNF mRNA的表达,采用免疫组织化学法检测BDNF蛋白的表达,取正常SD大鼠BDNF mRNA和蛋白的检测水平作为正常对照.结果 移植后两组大鼠的运动功能均逐渐改善,移植后21 d时,实验组大鼠运动功能评分明显高于对照组(P＜0.05).移植后OEC存活良好,实验组损伤的脊髓组织周围分布有大量的呈绿色荧光的OEC.移植后21 d时,实验组BDNF mRNA和蛋白的表达水平显著高于对照组和正常对照组(P<0.05),而对照组也显著高于正常对照组(P<0.05).结论 OEC移植可明显修复大鼠的脊髓损伤,其机制可能与OEC通过增强损伤脊髓组织中BDNF mRNA和蛋白的表达,改善局部微环境有关.

Abstract：

Objective To observe the expression of brain-derived neurotrophical factor (BDNF) in injury spinal cord after transplantation olfactory ensheathing cells (OECs), and to investigate the mechanism of OECs repairing spinal cord injury.Methods OECs from GFP transgenic rats were separated and cultured for transplantation. Spinal cord injury rats were separated two groups by random digits table. In experimental group, OECs suspension were transplanted into injured spinal cord following spinal cord injury. In control group, DMEM was transplanted into the injured spinal cord after spinal cord injury. Motor function was evaluated per week after transplantation. The expression levels of BDNF mRNA and protein were detected by using RT-PCR and immunohistochemistry respectively, and compared with those from normal SD rats.Results Motor function of two groups was improved gradually after transplantation. The motor function scores in experimental group was obviously higher than in control group at 21st day after transplantation (P<0.05). A lot of survival GFP OECs distributed around impaired myeloid tissue. At 21st day after transplantation, BDNF mRNA and protein expression in experimental group were strongest (P<0.05), and stronger in control group than in normal group (P<0.05).Conclusion The transplantation of OECs can repair the injured spinal cord by increasing the expression of BDNF mRNA and protein to improve local microenvironment.     

大鼠胚胎脊髓移植后对损伤脊髓神经营养因子表达的影响

目的：研究大鼠胚胎脊髓移植对损伤脊髓神经营养因子表达的影响。方法：将孕１４ｄ大鼠胚胎脊髓组织移植到成鼠半切洞损伤的脊髓中,手术后采用免疫组织化学技术,对损伤脊髓组织中神经生长因子（ＮＧＦ）、脑源性神经生长因子（ＢＤＮＦ）、神经生长因子３（ＮＴ－３）、睫状神经生长因子（ＣＮＴＦ）进行定量分析。结果：移植组神经营养因子１周、２周、４周、都明显高于单纯损伤组,４周时移植组ＢＤＮＦ表达高于其它各组（Ｐ〈０     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的时效性分析

目的：观察脊髓损伤后不同时间点骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治疗后大鼠行为学变化、脊髓的病理改变及脑源性神经营养因子（brain—derived neurotrophic factor,BDNF）和神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）表达变化,探讨BMSCs的最佳移植时间。方法：80只健康成年SD大鼠随机分为8组,每组10只。A组为假损伤组,暴露胸10段脊髓但不造成冲击伤,B、C、D、E、F、G、H组以改良Allen法建立脊髓损伤模型。造模成功后,C、D、E、F、G、H组分别于损伤后0h、6h、24h、3d、5d和7d,将lxl0。体外培养的BMSCs用微量注射器注入于脊髓损伤局部,B组为单纯造模组,用等量细胞培养液代替。各组分别于损伤后1、2、4周进行脊髓运动功能BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）运动学评分;分别取各组脊髓损伤组织0．5cm,制作HE染色病理切片,观察其形态学改变;Elisa法检测各组大鼠脊髓BDNF和NGF表达情况。结果：假手术组1、2、4周大鼠脊髓功能BBB评分均明显高于其余7组（P〈0．01）;术后l周细胞移植各组评分与单纯造模组相比差异无统计学意义（P〉0．05）;术后2周和4周细胞移植各组评分高于单纯造模组（P〈0．05）;损伤后2周BBB评分从高到低依次为F、E、G、D、H、C组,但6组组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）;损伤后4周BBB评分,F组与其余5组（C,D,E,G,H组）比较差异有统计学意义（P〈0．05）,但其余5组组间差异无统计学意义（P〉O．05）。EUSA检测结果显示,F组BDNF和NGF含量均高于其他7组（P〈0．05）。大鼠脊髓标本切片HE染色,假手术组脊髓组织结构完整清楚,无中性粒细胞浸润;其余7组局部组织水肿明显,灰白质交界处模糊,周围可见不同程度胶质细胞增生及炎细胞浸润。结论：大鼠脊髓损伤后同种异体BMSCs移植对脊髓功能恢复有一定疗效,损伤后3d可能是BMSCs最佳移植时间。     

腺病毒介导脑源性神经营养因子基因转移对神经根损伤后再生相关基因的影响

目的观察腺病毒介导的脑源性神经营养因子（BDNF）基因脊髓内转移对神经根损伤后再生相关基因表达的影响。方法在大鼠神经根切断吻合模型基础上，通过显微注射法在立体定位仪上将2μl复制缺陷型重组腺病毒载体（AxCA-BDNF）直接注入大鼠神经根损伤部相应的脊髓腹角。损伤组注射病毒缓冲液2μl。术后1、3、7、14、28d，利用免疫组化、原位杂交，观察β管蛋白和GAP-43 mRNA表达的改变。结果与损伤组比较，注射AxCA-BDNF组动物β微管蛋白和GAP-43 mRNA表达在术后3、7、14、28d间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AxCA-BDNF治疗能促进神经根损伤后神经元B管蛋白的合成，促进轴突的延伸；同时发现AxCA—BDNF治疗，能上调GAP-43表达，增加损伤神经元发芽的潜能。     

静脉移植骨髓间充质干细胞促进脊髓损伤后GDNF基因的表达

[目的]探讨经静脉移植骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠脊髓损伤(SCI)后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响。[方法]MSCs提取自成年Wistar大鼠的股骨干骨髓,经原代培养、鉴定及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)核标记。以改良Allen′s打击装置制作大鼠T10节段脊髓损伤(SCl)模型,于伤后立即缝合切口并经尾静脉注射移植MSCs。实验共分为3组MSCs尾静脉移植组(A组)、生理盐水注射组(B组)、正常对照组(C组)。术后不同时间点应用免疫组化法和逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)观察MSCs移植后的存活状态以及不同时间点GDNF基因的表达变化。[结果]免疫组化结果MSCs经尾静脉移植后在损伤脊髓平面可以检测到迁移及存活,标记细胞呈棕黄色的核标记,以损伤区域为多并向周围迁移,移植术后第14d,A组Brdu阳性细胞较多,最远于距离损伤区2.5cm处可检测到。B及C组则均未检测到阳性细胞。RT-PCR结果移植术后第1、3、5d,A组表达量呈逐渐升高趋势,B组呈一过性表达升高,C组无变化。各时间点A组GDNFmRNA的表达量明显高于B组,P<0.05。免疫组化结果移植术后第7、14、28dGDNF的表达量明显高于B组,P<0.05。[结论]骨髓间充质干细胞经尾静脉移植后可迁移至脊髓损伤区域,并上调胶质细胞源性神经营养因子基因的表达,是该移植方式修复大鼠脊髓损伤的机制之一。     

低温保存神经干细胞移植促进脊髓损伤后轴突再生的实验研究

目的:观察低温保存(-70℃)的神经干细胞(NSCs)复苏后移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后轴突再生的影响.方法:NSCs在处于对数生长期阶段冻存2周,复温后由5-溴脱氧尿嘧啶核苷法(Brdu)标记,制备大鼠SCI模型.实验分为3组:NSCs移植组(A组)、DMEM填充组(B组)、正常对照组(C组).脊髓损伤后立即进行移植干预,应用免疫组化法观察Brdu标记的移植细胞的存活及迁移情况,应用辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪法观察损伤处轴浆运输的重建.结果:复苏的NSCs经Brdu标记后移植到SCI区,在损伤脊髓区域可检测到标记的阳性细胞,辣根示踪技术显示细胞移植组较DMEM填充组阳性细胞明显多,组间差别有统计学意义.结论:低温保存的NSCs在移植到脊髓损伤区域后可存活,并参与脊髓损伤处轴浆通路的结构重建.     

骨髓间充质干细胞表达神经营养因子及治疗脊髓损伤的研究

目的　研究大鼠骨髓间充质干细胞 (BMSC)表达脑源性神经营养因子 (BDNF)和神经生长因子 (NGF)以及BMSC移植对脊髓损伤的治疗作用。方法　取大鼠骨髓培养BMSC并传代 ,进行CD44、CD45和CD71免疫细胞化学染色鉴定。逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测BM SC中BDNF和NGFmRNA的表达。用NYU方法建立大鼠脊髓损伤模型 ,将 15 0 0 0个BMSC注射到损伤脊髓中。 1～ 5周后进行BBB运动功能评分 ,观察BMSC在脊髓中的迁移 ,进行NF、GFAP和Gal C免疫荧光检测。结果　BMSC贴壁生长 ,免疫细胞染色CD44 (+ )、CD45 (-)和CD71(+ ) ,表达BDNF和NGFmRNA。移植BMSC后脊髓损伤的大鼠运动功能改善 ,5周后BBB评分从对照组的 (11.6± 1.7)分提高到 (15 .4± 2 .2 )分。BMSC在脊髓内向头、尾两侧迁移约 5mm ,未检测出向神经细胞诱导转化。结论　BMSC表达神经营养因子BDNF和NGF ,移植后能促进大鼠脊髓损伤的运动功能恢复。     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF基因和血管生成的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后运动功能恢复、VEGF基因表达和血管生成的影响,探讨BMSCs治疗SCI的机制。方法取5只4周龄Wistar雄性大鼠骨髓,分离培养BMSCs,取第3～4代细胞进行实验。取Wistar雌性成年大鼠87只,体重220～250 g,随机分为假手术组(A组,21只)、DMEM注射组(B组,33只)和BMSCs移植组(C组,33只)。A组仅咬除T8～10棘突和椎板;B、C组参照Nystrom方法制备T8～10 SCI模型,伤后30 min C组注射BMSCs(共3.0×105个),B组注射等量DMEM。于术后3、7、14、28 d采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评价大鼠后肢运动功能;术后3、7、14、28 d应用Ⅷ因子免疫组织化学染色行微血管计数观测血管生成情况;术后1、3、5 d应用RT-PCR法检测损伤脊髓组织内VEGF mRNA的表达。结果术后各时间点B、C组大鼠后肢功能随时间延长均有不同程度恢复,各时间点BBB评分与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后28 d,C组BBB评分显著高于B组(P<0.05),其余时间点B、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后3 d,B、C组损伤周围区脊髓灰质腹侧角内微血管数目明显少于A组(P<0.05);术后7、14、28 d与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组术后3、7 d脊髓灰质腹侧角内微血管数目与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);但术后14、28 d显著高于B组(P<0.05)。各组术后各时间点损伤周围区脊髓白质内的微血管数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测示,A组大鼠脊髓组织内VEGF mRNA表达水平较低。B、C组与A组相比,于术后1 d开始VEGF mRNA表达增加,3 d时表达达峰值,5 d时表达下降但仍高于A组,各时间点与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);C组各时间点均高于B组(P<0.05)。结论 BMSCs可能通过上调VEGF基因表达和增加脊髓内新生血管而促进大鼠SCI后运动功能恢复。     

神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的体内示踪

目的:探讨观察神经干细胞(NSCs)移植到大鼠损伤脊髓(SCI)后迁徙情况的方法.方法:体外培养大鼠NSCs,应用超顺磁性氧化铁(super paramagnetic iron oxide,SPIO)及多聚左旋赖氨酸(PLL)标记NSCs,分别进行普鲁士蓝染色、电子显微镜观察NSCs在体外标记情况.66只SD大鼠随机分为假损伤组(A组)、脊髓损伤对照组(B组)、脊髓损伤后NSCs移植治疗组(C组),分别在细胞移植术后第7d、14d、21d、28d及35d,按照改良Tadov评分法和Rivlin斜板试验观察大鼠神经功能恢复情况,B、C组术后第7、21、35d行MRI检查,扫描序列包括T1WI、T2WI、T2*WI.结果:(1)普鲁士蓝染色证实SPIO和PLL标记NSCs的有效率为100％.(2)细胞移植后7～35d,C组与B组动物运动功能均有不同程度恢复,但B组恢复较慢,14d、21d、28d和35d时C组Tarlov评分和斜板试验角度与B组相比差异有统计学意义(P<0.05).(3)1.5T MRI榆查,C组移植处在T2*WI序列呈低信号改变,第21d低信号向损伤区扩大,第35d损伤区见到低信号改变.B组相同时间点无低信号改变.第35天时与B组相比,C组3个扫描序列中信号强度分别下降32.55％、54.14％、62.27％,T2*WI的信号强度变化最大,T1WI变化最小.结论:磁共振技术可以追踪SPIO及PLL标记的移植在体内的NSCs.     

Effect of brain-derived neurotrophic factor, nerve growth factor, and neurotrophin-3 on functional recovery and regeneration after spinal cord injury in adult rats

This study examined whether continuous intramedullary infusion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), nerve growth factor (NGF), or neurotrophin-3 (NT-3) had either an early neuroprotective effect or a delayed effect on regeneration after spinal cord injury (SCI) in adult rats. BDNF, NGF, NT-3 or vehicle was infused at a rate of 625 ng/h into the SCI site at T3 through an implanted cannula attached to an osmotic pump. This infusion was maintained for 14 days after a 35-g clip compression injury. At 4 weeks after injury, the axonal tracer fluorogold (FG) was introduced into the spinal cord caudal to the lesion and the animals sacrificed 3 days later following behavioral assessment. The inclined plane score was significantly higher in BDNF-treated animals (45 +/- 3 degrees) compared to control animals (36 -/+ 1 degrees) at 1 week after injury (p < 0.05), although the scores were not significantly different at later times. BDNF-treated animals also showed more FG-labeled cells in the red nucleus and sensorimotor cortex (1,638 +/- 350 and 124 +/- 83, respectively) compared to controls (1,228 +/- 217 and 36 +/- 15, respectively) and a lower percent cavitation at the injury site (21.4 +/- 10.4%) compared to control animals (32.3 +/- 11.7%). Invasion & proliferation of Schwann cells and formation of peripheral myelin were more prominent at the injury site in the BDNF-treated animals than in the other groups. These results indicate that continuous intramedullary infusion of BDNF provides neuroprotection and enhances some regenerative activity after SCI.     

丙戊酸对大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞的影响

目的：探讨丙戊酸（valproic acid,VPA）对大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞的影响.方法：45只Wister成年大鼠,随机分为正常对照组（A组,n=5）、单纯损伤组（B组,n=20）、损伤后VPA治疗组（C组,n=20）.B组和C组采用Allen＇s打击模型（25gcm）,在T10段造成急性脊髓损伤,C组损伤后半小时给予VPA治疗,每日300m/kg,经腹腔分两次注射,直至取材;B组以相同方法给予等量生理盐水.于损伤后1d、3d、1周、4周、8周进行取材,对距离损伤中心5mm处脊髓进行巢蛋白Nestin免疫组化检测,应用图像分析软件进行Nestin阳性区域面积测算.结果：A组脊髓室管膜细胞中极少数细胞胞浆内有Nestin表达,白质中几乎无表达.B组损伤后24h Nestin表达于室管膜以及软膜,1周达到高峰（P＜0.05）,并相向延伸至脊髓白质和灰质;损伤后4周Nestin表达明显下降,8周时很少或几乎无表达.C组Nestin表达在伤后24h与B组无显著性差异,1周时在中央管周围Nestin阳性细胞明显较B组多（P＜0.05）,持续至4周时仍高表达,8周时仍有表达.结论：VPA在大鼠脊髓损伤后能够激活内源性神经干细胞.