应用MTT法测定IFN的生物活性效价

<正> 本文介绍一种MTT[3-(4,5二甲基噻唑-2-yl)-2,5-2苯基-四唑溴盐]染色法在测定IFN效价中的应用,结果表明,本法所需指示细胞数少,结果客观重复性好,操作方法简便。 在96孔或40孔细胞培养板上,将对照IFN和待测IFN进行倍比稀释,设细胞和病毒对照。每孔加入100μl 1.5～2×10~5/ml Hep-2细胞悬液,培养5～6小时后,每孔加入100μl 100个TCID_(50)VSV病毒攻击(细胞对照孔不加)。在终止培养前3～4小时,加入5mg/ml MTT 15μl/孔,混匀继续培养,3～4小时后,加入适量生理盐水,用滴管轻轻吹吸,弃去悬浮的病变细胞和死细胞,然后每孔加入200μl     

灵芝多糖对混合淋巴细胞培养反应的影响

灵芝多糖是灵芝[Ganoderma Lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst]的主要有效成分之一。以往实验证明灵芝多糖具有免疫增强作用。本文进一步观察了我校药学院植化教研室分离的两种灵芝多糖(BN_3 A,BN_3 C)对混合淋巴细胞培养反应(MLR)的影响。 材料与方法 无菌分离BALB/c及C_(57)BL/6J小鼠脾细胞,用RPMI1640培养液按1∶1混合制成8×10~6/ml细胞悬液。用96孔培养板进行培养,每孔加入上述细胞悬液100μl及不同     

双黄连粉针剂体外对小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌与吞噬功能的影响

目的探讨双黄连粉针剂(以下简称SHL)体外对小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌与吞噬功能的影响。方法无菌条件下制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液;MTT法检测药物对细胞悬液的毒性情况;Griess反应系统检测SHL对脂多糖(LPS)刺激的小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌的影响;1μm与2μm直径的荧光微球结合流式细胞术分析SHL对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响。结果终质量浓度为40、80 mg/L的SHL对细胞的毒性小;SHL抑制了腹腔巨噬细胞的NO分泌与吞噬作用,与非SHL组比较P<0.01。结论 SHL对小鼠腹腔巨噬细胞的NO分泌和吞噬作用的影响可能是SHL调节小鼠免疫系统的途径。     

气功外气对小鼠淋巴细胞和肿瘤细胞作用的体外试验

一、气功外气对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用按本室常规制备小鼠脾细胞悬液(2×10~6/ml),ConA最终浓度为3μg/ml或不加ConA,淋巴细胞转化试验用~3H-TdR掺入法测定,细胞悬液分装于设有对照组与试验组的平皿内各6ml,试验组接受气功外气15分钟,对照组不接受外气,发功完毕两组细胞充分摇匀后,分别吸取0.2ml加入96孔培养板内,每组设6个复孔,37℃,5%CO_2培养72小时。结果发现,气功外气对无     

免疫小鼠脾脏RNA引起的免疫记忆参与细胞

本工作用体外抗体产生系统,研究了由免疫核糖核酸(iRNA)引起的、参与免疫记忆的T细胞与B细胞.实验动物采用8-12周龄的BALB/C小鼠及由BALB/C小鼠培育的裸鼠.抗原用10%绵羊红细胞(SRBC)或马红细胞(HRBC).取0.1ml抗原给小鼠作腹腔内注射,四周后再加强注射.免疫后五天将小鼠解剖,用改进Kidson法自小鼠脾脏提取iRNA.取500μgiRNA给小鼠作腹腔注射,四周后再加强注射.脾细胞的制备及试管内抗体形成的测定:在双玻皿内将小鼠脾脏切开,加入培养液制备成无菌的单个细胞悬液.在1ml RPMl1640培养液内计数脾细胞1×10~7,并加入青霉素G50U/ml、硫酸链霉素50μg/ml、硫烷醇(5×10~(-5)M),再补足20%胎     

红车轴草提取物对小鼠淋巴细胞[Ca2+]i及腹腔巨噬细胞NO分泌和吞噬的影响

目的探讨红车轴草提取物(Trifoliumpratense Leguminosae extract,TLE)体外对小鼠淋巴细胞[Ca2+]i及腹腔巨噬细胞NO分泌和吞噬微球的影响。方法无菌条件下制备小鼠淋巴细胞悬液及小鼠腹腔巨噬细胞悬液;MTT法检测药物对细胞悬液的毒性情况;Fluo-4/AM染色结合流式细胞术分析TLE对小鼠淋巴细胞[Ca2+]i的影响;Griess反应系统检测TLE对脂多糖(LPS)刺激的小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌的影响;1μm与2μm直径的荧光微球结合流式细胞术分析TLE对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响。结果终质量浓度为20、40mg/L的TLE对细胞的毒性小;TLE促进了淋巴细胞的Ca2+内流;TLE抑制了巨噬细胞的NO分泌与吞噬作用,与非TLE组比较P<0.01。结论对淋巴细胞[Ca2+]i及巨噬细胞的NO分泌和吞噬的作用可能是TLE调节小鼠免疫系统的途径。     

P物质对小鼠腹腔巨噬细胞功能的调整作用

本文研究了神经肽P物质(Substance P,SP)对经硫代乙醇酸钠(TG)培基活化的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)的免疫功能的影响。结果表明,经TG活化的Mφ在体外与SP共同培养18小时后,其吞噬中性红的能力明显提高,其有效浓度在10~(-6)～10~(-8)M之间(P<0.05)。实验中还发现SP在10~(-7)～10~(-9)M有显著增强Mφ产生IL-1的作用,SP与LPS(10μg/ml)联合应用可协同促进IL—1的产生。SP尚可增强Mφ对肿瘤细胞增殖的抑制作用,但这一作用较巨噬细胞活化因子(MAF)明显为弱。SP不能与Con A协同增强小鼠脾脏T细胞产生MAF的能力。     

人参皂苷Rg1对小鼠腹腔巨噬细胞的影响

目的研究人参皂苷Rg1对小鼠腹腔巨噬细胞的影响,并探讨其作用机制。方法无菌分离小鼠腹腔巨噬细胞,制备单细胞悬液,加入不同终浓度的人参皂苷Rg1 4 h后,细菌脂多糖LPS(10μg/ml)作用24 h,直径1μm的微球(1×1010/L)结合流式细胞术分析Rg1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响;Griess试剂盒检测NO的释放;H2DCFDA染色检测ROS的含量;Fluo-4/AM染色检测Rg1对Ca2+超载的影响;Sytox R Green染色,荧光酶标仪检测Rg1对CHX、CTX诱导的细胞凋亡的影响。结果 10、20μmol/L的Rg1时能明显抑制LPS诱导的巨噬细胞NO和ROS的产生以及吞噬微球的能力;10μmol/L的Rg1能显著抑制Ion诱导的的巨噬细胞Ca2+的超载以及CHX、CTX诱导的细胞的凋亡。结论 Rg1具有显著的抗炎作用,并可抵抗多种因素诱导的细胞凋亡,为进一步开发为免疫治疗药物提供了依据。     

巨噬细胞泡沫化对炎症反应的影响

目的:观察巨噬细胞泡沫化对促炎因子水平的影响。方法:取6-8周龄C57BL/6J雄性小鼠骨髓细胞,采用L929培养分化成巨噬细胞。在巨噬细胞悬液中加入不同浓度氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),分为空白对照组(0μg/ml)、10μg/ml组和25μg/ml组,再培养24h后观察各组细胞泡沫化程度,检测分析各组泡沫细胞中促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达水平。结果:所取骨髓细胞被成功分化为巨噬细胞。不同浓度ox-LDL均能诱导巨噬细胞的泡沫化,25μg/ml组巨噬细胞泡沫化程度高于10μg/ml组(P0.01)。与空白对照组相比,25μg/ml组的IL-1β和TNF-αmRNA表达水平均显著降低(P0.05)。结论:巨噬细胞泡沫化可以抑制炎症反应。     

8—8 恒定旋转低频脉冲磁场对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

本文报导以CS-403型旋磁机,旋转磁场平均强度为1100G,以钐钴合金永磁块,半径5mm,高6mm,场强3000G;以低频脉冲磁场机(系我院物理学教研室研究制造),场强为2.4G,频率20～200HZ为三种不同磁场装置,进行对C_(57)BL纯系小鼠腹腔巨噬细胞(MФ)吞噬白色念珠菌的吞噬功能观察,初步探讨以上三种磁场对抗感染作用的机理,为临床上常采用的磁场抗感染治疗提供实验依据。试验所用白色念珠菌系24小时培养物,浓度为4×10~6/ml,C~(57)BL纯系小鼠腹腔细胞悬液浓度为2×10~6/ml。以上浓度均用20％FCS1640培养基配制,等量混合,滴     

漆黄素对巨噬细胞和T淋巴细胞的免疫调节作用

目的探讨漆黄素(Fisetin,FIS)对小鼠巨噬细胞吞噬功能、NO的释放及对T淋巴细胞体外活化、增殖的影响。方法无菌制备小鼠巨噬细胞悬液及淋巴细胞悬液;荧光微球结合流式细胞术(FCM)分析FIS对巨噬细胞吞噬作用的影响;Griess试剂盒检测巨噬细胞NO的释放;双色荧光抗体染色结合FCM,检测CD3+T细胞CD69的表达水平;CFSE标记技术检测T细胞增殖的情况。结果 2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/LFIS均能明显抑制巨噬细胞的吞噬微球的能力;FIS能抑制LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞的NO的产生(P<0.05);FIS对ConA刺激的T细胞表达CD69有抑制作用,并能有效抑制ConA诱导的T细胞增殖(P<0.01),且均呈剂量依赖性。结论 FIS能显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力和分泌NO的能力,并能够抑制T细胞的活化和增殖,有望发展成为一种新的免疫抑制药物。     

碱性磷酸酶活性是活化B淋巴细胞的一种膜标志

组织化学和细胞组分研究表明,碱性磷酸酶(APase)存在于B细胞性白血病和淋巴瘤以及淋巴母细胞样B细胞株的细胞中,但T淋巴瘤细胞株或骨髓样细胞中则缺如。本文报道建立一种简单、快速检测小鼠脾脏细胞膜APase活性的微量滴定试验。将正常或培养的细胞(4×10~5,悬浮于50μ1PBS)加入聚苯乙烯微量滴定板小孔内,经离心后用0.25M戊二醛使贴壁细胞固定,继用含0.1%吐温的PBS洗涤后,加100μl含1mg/ml对硝基苯磷酸盐(底物)和10~(-3)M MgCl_2的0.05M碳酸钠缓冲液(pH9.8),在室温下放置30分钟,随即加入50μ10.3M NaOH终止反应。用平板多道扫描读数仪测量各孔在405 um的消光度。用本法检测了在体外经LPS和PWM激活的小鼠脾细胞质膜的     

应用取自淋巴器官的细胞通过被动皮肤过敏反应检测IgE抗体形成细胞

本文应用被动皮肤过敏反应(PCA)检测大鼠淋巴器官中抗原特异性IgE和IgG 2a抗体形成细胞,以PCA滴度表示抗原特异性IgE和IgG 2a抗体的含量。用3 000条第三期钩虫幼虫(Nb)给Wistar鼠皮下注射,使其感染。6周后再以同样剂量的Nb再次感染,第二次感染的7—9天杀鼠取脾脏和肠系膜淋巴结(MLN),获取单个细胞悬液,计数细胞并用Hank′s液调节成适当浓度。B53抗DNP IgE或27—74.3抗dansyl IgE抗体杂交瘤细胞,以10~7个IgE杂交瘤细胞给小鼠腹腔内接种7～10天后收获腹腔渗出液内杂交瘤细胞,用Hank′s液调节成适当浓度。上述二种细胞悬液于-20℃冷冻,25℃融化,反复二次,4℃3 000rpm离心10分钟,获得细胞提     

Toll样受体2(TLR2)基因敲除减轻小鼠胰岛素抵抗并促进巨噬细胞M2极化

目的研究Toll样受体2(TLR2)基因缺失对小鼠胰岛素抵抗和巨噬细胞极化的影响。方法出生28 d雄性TLR2基因敲除(TLR2~(-/-))和野生型(WT)的C57BL/6小鼠各12只,采用PCR验证每只小鼠的基因型。基础饲养3个月后,进行葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素抵抗实验(ITT);从外周血中分离单个核细胞,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)/γ干扰素(IFN-γ)和M-CSF/白细胞介素4(IL-4)/IL-13分别诱导培养为M1型和M2型巨噬细胞,流式细胞术检测CD11b、 F4/80、 CD11c、 CD206、早期生长反应蛋白2(EGR2),确定巨噬细胞表型。ELISA检测M1型巨噬细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、 IL-6的含量; M2型巨噬细胞培养上清液中IL-10的含量。结果 PCR验证结果显示TLR2~(-/-)和WT小鼠的基因型正确;行GTT后比较, TLR2~(-/-)小鼠血糖调节能力比WT小鼠强,在30 min时最明显;行ITT后比较, WT小鼠比TLR2~(-/-)小鼠调节血糖的能力和胰岛素敏感性均降低,在15 min差异明显;与WT小鼠相比, TLR2~(-/-)小鼠M1型巨噬细胞的比率降低, M2型巨噬细胞比率增加;与WT小鼠相比, TLR2~(-/-)小鼠M1型巨噬细胞培养上清液IL-6、 TNF-α含量降低, TLR2~(-/-)小鼠M2型巨噬细胞培养上清液IL-10含量增加。结论 TLR2信号影响巨噬细胞的极化,使巨噬细胞倾向于M1表型,从而分泌促炎因子使机体处于低度炎症的状态,导致葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的降低。     

Aire 对巨噬细胞极化影响的研究

目的:研究自身免疫调节因子(Aire)对巨噬细胞极化的影响。方法:分别用LPS、IL-4 以及LPS 联合免疫复合物刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264郾7 细胞、稳定表达GFP-Aire 的RAW264.7 细胞(A33-3) 细胞和稳定表达GFP 的RAW264.7 细胞(C1-6),使其向M1(LPS)、M2a(IL-4)和M2b(LPS 联合免疫复合物)型巨噬细胞极化。通过Real-time PCR 检测各组细胞中M1 型巨噬细胞特征分子IL-1、iNOS 和IL-6,M2a 型特征分子Arg-1 和M2b 型特征分子IL-10 的表达水平,研究Aire 对各种类型巨噬细胞极化的影响。结果:LPS 在0.5 g/ ml 浓度时,RAW264.7 细胞中M1 型巨噬细胞产物IL-1 、iNOS和IL-6 基因表达量最高;而IL-4 以及LPS 联合免疫复合物的刺激作用有显著的剂量依赖性,都在浓度最高时RAW264.7 细胞中Arg1(M2a)和IL-10(M2b)基因表达量最高。LPS 刺激后,A33-3 细胞中IL-1 和iNOS 表达水平明显高于C1-6 细胞,IL-6 则相反;IL-4 及LPS 联合免疫复合物刺激后,A33-3 细胞中Arg1 和IL-10 的表达水平明显低于C1-6 细胞。结论:Aire 可能促进巨噬细胞向M1 极化,同时抑制其向M2a 和M2b 极化。     

碱性成纤维细胞生长因子对放射性诱导小鼠C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抑制放射性诱导小鼠C17.2神经干细胞凋亡的作用。方法:用直线加速器进行总剂量为8 Gy外照射C17.2神经干细胞建立放射损伤细胞模型,将处理后的C17.2神经干细胞悬液以1×108/L的浓度接种于96孔板中,每孔加细胞悬液200μl,然后分别加入bFGF 0(对照),25,50和100μg/L干预24 h处理。用4-甲基偶氮唑盐法检测细胞活性并拟合生存曲线,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:随bFGF浓度增加,放射诱导后的C17.2神经干细胞增殖比明显增加(P0.01),呈现明显剂量-效应关系(r=0.628,P0.01)。在一定放射剂量下,随着bFGF浓度增加C17.2神经干细胞生存曲线右移,表明bFGF能够提高神经干细胞的放射耐受性(r=0.569,P0.01)。bFGF为100μg/L时,C17.2神经干细胞活性最强,且无细胞毒性作用。流式细胞仪测定的对照组C17.2神经干细胞凋亡率明显高于bFGF 25和50μg/L(P0.01)处理组,并且凋亡率在bFGF 25,50和100μg/L组间也存在显著差异(P0.01)。结论:bFGF能显著抑制放射诱导的小鼠C17.2神经干细胞凋亡,其机制有待进一步研究。     

毒热平注射液对流感病毒感染的巨噬细胞分泌NO的影响

目的:研究毒热平注射液对流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1细胞分泌NO的影响。方法:用100TCID50流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1后换用6个不同浓度的含药维持液继续培养,分别于6、12、24和36小时收集细胞上清液,用Griess试剂法检测其释放NO的水平。同时提取1μg/ml药物组作用24小时后的细胞mRNA和核蛋白,利用RealTimePCR法和Westernblot技术,检测毒热平注射液对病毒感染前后巨噬细胞NF-κBp65mRNA及其蛋白表达水平的影响。结果:在药物作用的不同时间,60、30和10μg/ml各剂量组均能显著下调病毒感染巨噬细胞NO的分泌水平,且具有剂量依赖性;该药可明显下调病毒感染巨噬细胞NF-κBp65mRNA及其蛋白表达水平。结论:毒热平可通过下调细胞核因子-κB活性,抑制病毒感染巨噬细胞NO的分泌,发挥抗病毒感染作用。     

人参皂甙对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响及其作用机制初步探讨

目的:观察人参皂甙(GS)对巨噬细胞的免疫激活作用,探讨GS活化巨噬细胞及免疫调节机制。方法:在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中加入不同浓度的GS后,观察巨噬细胞一氧化氮(NO)合成及MTT比色法检测活化后的巨噬细胞对肿瘤细胞杀伤活性的影响;扫描电子显微镜(SEM)观察巨噬细胞的超微结构改变;激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察巨噬细胞表面组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)的变化;以特异性荧光探针Fluo-3/AM负载细胞,应用LSCM检测巨噬细胞内Ca2+浓度。结果:小鼠腹腔巨噬细胞经GS作用后,细胞形态发生活化性改变,杀瘤活性增强,细胞表面MHCⅡ表达增加并增强对H22细胞杀伤活性;GS作用细胞4小时后,25~200 mg/L GS细胞内Ca2+浓度升高,并与药物浓度呈正相关。结论:GS在体外能激活小鼠巨噬细胞,促进其发挥免疫防御功能,其免疫调节机制可能与细胞内Ca2+浓度升高有关。     

红景天苷对小鼠腹腔巨噬细胞体外增殖、凋亡、吞噬、ROS和NO产生的影响

目的:研究红景天苷(Sal)对小鼠腹腔巨噬细胞体外增殖、凋亡、吞噬、胞内活性氧簇(ROS)及分泌一氧化氮(NO)的影响,初步探讨其对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用。方法:无菌分离小鼠腹腔巨噬细胞,并制备单细胞悬液,以不同终浓度(80μmol/L、160μmol/L及320μmol/L)的Sal和巨噬细胞共培养4 h,再以脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)进行共刺激。利用MTT比色法检测Sal对巨噬细胞体外增殖的影响。用放线菌酮(CHX)诱导巨噬细胞凋亡,用Sytox G reen染色结合荧光酶标仪检测Sal对CHX诱导巨噬细胞凋亡的影响。用流式细胞术(FCM)检测Sal对巨噬细胞吞噬功能的影响。用2-7-二氯氢化荧光素乙二脂(H2DCFDA)染色法结合荧光酶标仪检测Sal对胞内ROS产生的影响;用G riess反应检测Sal对巨噬细胞分泌NO的影响。结果:MTT比色法检测显示,终浓度为80、160、320μmol/L的Sal均可显著促进LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞增殖(P<0.05)。荧光酶标仪检测Syto xG reen染色法的结果显示,160μmol/L的Sal可抑制CHX诱导的巨噬细胞凋亡(P<0.01)。FCM结果显示,各浓度的Sal均能促进单纯药物组和实验药物组LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞的吞噬功能(P<0.05)。用荧光酶标仪检测DH2DCFDA染色结果表明,各浓度的Sal对LPS+IFN-γ刺激的巨噬细胞胞内ROS的产生均具有显著的抑制作用(P<0.01)。Griess反应检测NO含量的结果显示,各浓度的Sal对LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞产生NO均具有促进作用(P<0.05)。结论:Sal对LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞增殖具有显著的促进作用,对CHX诱导的巨噬细胞凋亡具有显著的抑制作用,对静息态和活化态的巨噬细胞的吞噬功能均有增强作用,并能减少LPS和IFN-γ活化的巨噬细胞胞内ROS的产生;但能促进LPS和IFN-γ活化的巨噬细胞NO的分泌。     

TY-51469对疲劳运动的小鼠巨噬细胞格局调节作用的实验性研究

本实验研究TY-51469对疲劳运动引起小鼠巨噬细胞格局变化的调节作用。选用健康雄性(6~8)周龄C57BL/6小鼠,分为安静对照组、运动组、运动+TY组。运动组及运动+TY组进行2周平板跑步运动,前3d为适应性运动,以后每日逐渐增加运动量,运动至小鼠普遍出现疲劳征象。第5d起运动+TY组每日运动后按15mg/kg腹腔注射TY-51469,安静对照组及运动组第5d起每天腹腔注射等体积PBS,一共注射8d。运动结束后取脾脏制作单个核细胞悬液标记巨噬细胞后进行流式细胞检测,并提取巨噬细胞基因测定IRF5和IRF4mRNA表达量,观察并分析疲劳运动对脾脏M1、M2型巨噬细胞数量及比例的影响,以及TY-51469对疲劳运动引起巨噬细胞格局变化的调节作用。实验结果显示,疲劳运动可导致小鼠脾脏巨噬细胞M1/M2比值上升,TY-51469通过恢复M1/M2比例起到对巨噬细胞不同亚群的调节作用,使巨噬细胞格局恢复正常。