蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP-10的原核表达

目的 构建结核分枝杆菌(MTB)早期分泌蛋白CFP-10原核表达载体并进行诱导表达.方法 通过PCR技术从结核分枝杆菌H37 Rv基因组中扩增出lhp基因片段,目的基因片段克隆至表达载体pET-32a(+),构建pET-32a-CFP-10重组表达质粒,将其转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.结果 成功地构建原核表达载体pET-32a-CFP-10,以重组体转化E.coli BL21(DE3),成功进行诱导表达.结论 成功构建CFP10的原核表达质粒,高效表达目的蛋白CFP-10,为进一步研究其免疫学功能奠定了基础.     

HSV-1 UL18基因重组载体的构建及其编码蛋白VP23的表达

目的:构建含有单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的原核表达载体。方法:先将UL18基因进行全序列PCR扩增,再将PCR产物克隆进pET-28a(+)质粒,最后将重组质粒转化进入原核表达系统E.coli BL21(DE3)中表达出带有6个组氨酸标签的重组VP23蛋白。结果:UL18基因正确重组进pET-28a(+)质粒,并在E.coli BL21(DE3)中表达。结论:成功构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的重组载体,并在原核表达系统表达出其编码的衣壳蛋白VP23且带有组氨酸标签,为进一步优化VP23在发酵中的最佳表达条件,纯化并大量制备VP23,以及制备VP23的多克隆抗体奠定了基础。     

旋毛虫表皮胶原蛋白基因的原核表达

目的构建表皮胶原蛋白基因X21的原核表达载体pET28-X21ex,诱导其表达胶原蛋白。方法应用PCR技术扩增目的基因X21,纯化后将其克隆入表达载体pET28a,重组质粒经酶切鉴定后,转入大肠杆菌DE3诱导表达,利用SDS-PAGE检测胶原蛋白的表达效果。结果利用DNA重组技术构建了表皮胶原蛋白基因X21的原核表达载体pET28-X21ex,转化大肠杆菌后经诱导表达了30kDa的融合蛋白,以诱导3h的表达量最高,在35%以上。结论旋毛虫表皮胶原蛋白基因X21在大肠杆菌中能够高效表达,为进一步研究旋毛虫表皮胶原蛋白的结构与功能奠定了基础。     

前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体的构建及鉴定

目的克隆前纳豆激酶原基因,实现其在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究。方法从枯草芽孢杆菌中分离纯化基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α;将目的基因片段与表达载体pET30a连接,构建重组表达质粒pENK,转化大肠杆菌BL21（DE3）,对其表达条件进行研究。结果序列检测结果表明,所克隆片段全长1152bp,与Genbank中已报道序列相比较,同源性达到100%。转化菌pENK108-BL21（DE3）经IPTG诱导表达目的产物,SDS-PAGE检测结果显示具特异条带,Western Blotting检测结果表明,表达产物确系目的融合蛋白。转化菌pENK108-BL21（DE3）在LB培养基中经37℃培养,1mmol/L IPTG诱导4h后,目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的31%。时间凝块法显示表达物具有一定的纤溶作用。结论成功构建前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体,并对转化菌的表达条件进行了研究。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的:克隆空肠弯曲菌peb1A基因,构建其原核表达载体;鉴定重组表达产物的免疫原性。方法:PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,构建pET-28a(+)-peb1A表达载体。转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEB1。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEB1免疫反应性,双向免疫扩散试验鉴定rPEB1免疫家兔的抗血清效价。结果:所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99.9%,转化E.coliBL21(DE3)后,表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33%左右,纯化后获得纯度为96%的重组蛋白。Western blot证实rPEB1能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEB1血清的双向免疫扩散效价为1:16。结论:成功地构建了高效表达载体pET-28a(+)-peb1A,并获得rPEB1,所表达的rPEB1具有良好的免疫原性和免疫反应性,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的原核表达及纯化

目的 构建人附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的重组质粒pET28a(+)-Eppin,并研究该质粒在原核细胞中的表达及纯化.方法 本研究以人睾丸组织cDNA为模板获得人Eppin基因片段,将其插入pET28a(+)载体His6-Tag上游,构建重组质粒pET28a(+)-Eppin,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IP...     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列的克隆与表达

〔目的〕表达SARS冠状病毒S蛋白部分序列S1。〔方法〕采用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)技术从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码S1蛋白的基因片段 ,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE3 0连接 ,构建重组表达质粒pQE3 0 -S1,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生S1重组蛋白。〔结果〕(1)RT -PCR扩增获得长约 115 0bp的S1基因片段。 (2 )SDS -PAGE证明 ,S1重组蛋白的分子量约为 40kDa。 (3 )表达的蛋白能与SARS病人血清反应。〔结论〕成功构建了SARS冠状病毒S1蛋白的重组表达质粒 ,该质粒在大肠杆菌中表达了S1蛋白     

麻疹病毒Edmonston疫苗株血凝素基因克隆及表达

目的 构建麻疹病毒(MV)血凝素蛋白(H蛋白)基因的重组质粒，使其在大肠埃希菌中大量表达H蛋白，为进一步研究奠定基础。方法从MV Edmonston株减毒活疫苗中提取基因组RNA，RT-PCR扩增H蛋白基因。用限制性内切酶Barn-HI和Hind-Ⅲ双酶切H基因片段和pGEMEX-1载体，连接后获得重组质粒MV-H-pGEMEX-1。然后，用IPTC诱导重组质粒在大肠埃希菌JM109(DE3)和BL21(DE3)中表达。结果 RT-PCR获得的片段长度约为1900bp，与MV-H基因相符。MV-H-pGEMEX．1测序结果显示：MV-H基因对码正确，核苷酸序列符合率达99．4％。转化重组质粒的大肠埃希菌，其表达产物经SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，出现与目的蛋白分子量相一致的条带。结论 成功构建MV-H蛋白表达载体MV-H-pGEMEX-1，并在大肠埃希菌中获得表达。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。     

3种食源性致病菌的多重PCR检测方法研究

目的建立一种快速、经济、实用的多重PCR方法,期望能同时检测3种常见致病菌。方法根据沙门氏菌的侵袭蛋白A（invasion protein A,invA）、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H基因（invasion plasmid antigen,ipaH）、副溶血性弧菌的不耐热肠毒素基因（thermolabile hemolysin,tlh）分别设计了3对引物,预计PCR扩增的目的片段依次为284、450、606bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的单管多重PCR方法。结果含沙门氏菌：42cfu/g,志贺氏菌：36cfu/g,副溶血性弧菌：116cfu/g的肉陷样品经过增菌、DNA提取、扩增、电泳,在16～18h内应用多重PCR体系能够检出。通过对10株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步建立能快速,灵敏,特异地检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的多重PCR体系,可以作为食物中毒病原菌检测的有效方法。     

PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

阜阳市2007～2011年食源性致病菌监测结果分析

目的了解阜阳市市售主要食品中致病菌的污染状况,为有效预防食源性疾病的发生提供科学依据。方法按国标GB4789和食源性致病菌监测手册的方法,对10类食品中的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、肠出血性大肠埃希菌O157:H7、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌进行分离与鉴定。结果2007～2011年859份食品样品中共检出致病菌114株,总检出率13.27%。10类食品中鲜奶的金黄色葡萄球菌污染率最高,达到52.50%(21/40),其次为水产品中的副溶血弧菌污染22.11%(21/95)。所有致病菌中金黄色葡萄球菌检出株数最多,阳性率为11.65%(53/455)。O157:H7检出株数最少,阳性率为0.26%(1/391)。农贸市场、超市、个体户三种不同监测点食源性致病菌的检出差异无统计学意义(χ2=5.15,P>0.05)。结论阜阳市主要市售食品中存在食源性致病菌的污染,其中鲜奶产品中金黄色葡萄球菌污染率最高。有针对性防范和控制各类食品致病菌的污染,是防止食源性疾病暴发的重要措施。     

三基因PCR检测志贺菌方法的建立及应用

目的建立志贺菌肠毒素1基因(set1B)、肠毒素2基因(sen)和侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的三基因PCR检测方法,实现志贺菌三基因同时检测。方法选择志贺菌的3种毒力基因作为靶基因,在一个反应管中同时进行PCR扩增,根据产物分子量定性判断结果。结果三基因同时检测与单基因PCR分别检测3种毒力基因两种方法具有相同的灵敏度与特异性。62株志贺菌具有3种毒力基因型。结论三基因PCR检测志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点,适用于医院实验室作为快速诊断志贺菌的辅助技术。     

多重实时PCR检测沙门菌、志贺菌和致泻性大肠埃希菌

目的 建立多重实时荧光PCR检测沙门菌侵袭蛋白A基因（invA）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）不耐热肠毒素基因（elt）、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌侵袭力基因（ipaH）的方法。方法 优化多重实时荧光PCR的反应条件,检测系列10倍稀释的阳性菌DNA提取物。90份腹泻患者粪便样品经缓冲蛋白胨水（buffered peptone water,BP）增菌6h后进行多重实时荧光PCR检测,并对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10CFU／μl的福氏2aF301株、10。CFU／μl的鼠伤寒沙门菌和ETEC44815株。检测腹泻患者粪便样品,elt基因阳性率为14．4％（13／90）,ipaH基因阳性率为5．6％（5／90）;并从阳性样品中分离到3株elt基因阳性大肠埃希菌和4株ipaH基因阳性大肠埃希菌。整个检测过程可在10h内完成,其中包括BP增菌6h。结论 建立了同时检测invA、elt、ipaH毒力基因的多重实时荧光PCR方法,具有高度的特异性,可用于沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌菌株的毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。     

华支睾吸虫GST的新编码基因的克隆与纯化

目的 扩增华支睾吸虫(Cs)一个编码谷胱甘肽转移酶(GST)的新基因，确认是否存在内含子，进行原核表达，纯化。方法 用PCR方法从成虫cDNA文库和基因组中扩增CsGST基因，测序，定向克隆到原核表达载体pET-30a( )，在大肠杆菌BL21／DE3表达，按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和薄层色谱(TLC)分析。结果 CsGST基因全长639bp，没有内含子，构建的原核表达质粒pET-30a( )-CsGST在大肠杆菌中得到了有效表达，融合蛋白的分子量约为30kDa。重组蛋白达总蛋白的33％，纯化后的重组蛋白纯度为97％。结论 CsGST基因没有内含子，在大肠杆菌中能有效表达，重组蛋白得到了纯化，为进一步研究该基因的功能打下基础。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立

目的:建立快速检测食源性致病菌的多重PCR方法。方法:本研究根据肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)的大肠杆菌不耐热毒素(Heat labileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)的侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),分别设计了三对引物,预计PCR扩增的目的基因片段为194、279和435 bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测肠毒性大肠埃希菌、伤寒沙门菌和福氏志贺菌的稳定的单管多重PCR方法。结果:该方法检测的灵敏度分别为:145 pg/ml肠毒性大肠埃希菌的基因组DNA、100 ng/ml伤寒沙门菌的基因组DNA、7 ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA,与单基因PCR检测的灵敏度相同。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。结论:该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控。     

双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用

目的 建立同时检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因的双重聚合酶链式反应(PCR)法. 方法 根据副溶血性弧菌的tlh、tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测.同时优化反应体系,测定稳定性、重复性、特异性及灵敏度. 结果 本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269 bp的片段,而对其它种类的菌物无特异性扩增,结果表明该方法特异性好,双重PCR检测灵敏度为100 cfu/ml.并进行了肛门拭子样品的检测. 结论 初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地检出副溶血性弧菌毒力菌株的双重PCR技术.     

致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA文库的构建及体外表达

目的构建致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA文库并进行EST测序,通过生物信息学软件分析EST序列同源性及生物学功能,筛选重组阳性基因克隆进行体外表达。方法利用SMART方法构建致农民肺嗜热吸水链霉菌的cDNA文库,随机挑选重组阳性克隆进行EST测序。挑选有关目的基因连接入pET-28a载体并转化大肠埃希菌BL2（DE3）,IPTG诱导体外表达。结果该文库的重组率为96．3％,是一个较高质量的文库。从文库中随即挑选的1020个重组阳性的克隆,获得978个有义序列,平均长度为495bp,含有347个单一基因,同源性比较发现部分序列与猪胸膜肺炎放线菌外膜蛋白（omla）,转铁蛋白B（TbpB）具有较高的同源性,分别为51％和42％。将重组阳性的基因克隆至载体中,IPTG诱导得到表达产物的相对分子质量分别为63×10^3和30×10^3。结论所构建的致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA文库包含全部EST序列,可能包含嗜热吸水链霉菌相关疾病巨大部分毒力分子,这些数据的积累将有助于农民肺特异性毒力分子的进一步筛选,同时为研究农民肺的发病机制奠定基础,如果能准确筛选出相关毒力基因,将为农民肺血清学诊断以及特异性疫苗的研发奠定基础。