乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠CD4^＋／CD8^及Fas、FasL蛋白表达的实验研究

目的：观察乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠CD4^＋／CD8^及Fas、FasL蛋白表达的影响。方法：采用雌性BALB／c小鼠皮下多点注射小鼠透明带多肽,建立免疫性卵巢早衰模型。将造模成功的小鼠随机分为模型组、己烯雌酚组、六味地黄丸组、乌鳖颗粒大、中、小剂量组。另设正常组和佐剂组,共灌胃给药4周。实验末应用免疫组化法测定脾脏CD4^＋、CD8^,计算CD4^＋／CD8^的比值。应用免疫组化法测定卵巢Fas、FasL蛋白的表达。结果：模型组小鼠脾脏CD4^＋／CD8^比值明显高于正常组和佐剂组（P〈0．05）。乌鳖颗粒各剂量组小鼠脾脏CD4^＋／CD8^比值明显低于模型组（P〈0．05,P〈0．01）。模型组小鼠卵巢Fas蛋白表达低于正常组,Fas—L蛋白表达明显高于正常组,卵巢Fas、Fas—L蛋白表达和Fas／Fas—L比值与正常组比较具有显著性差异（P〈0．05,P〈0．01）。乌鳖颗粒大剂量组和中剂量组小鼠Fas蛋白表达明显高于模型组,（P〈0．05,P〈0．01）。乌鳖颗粒各剂量组Fas—L蛋白表达明显低于模型组（P〈0．05,P〈0．01）。乌鳖颗粒大剂量组、中剂量组小鼠Fas／Fas—L比值与模型组比较具有显著性差异（P〈0．01）。结论：乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠具有调节CD4^＋／CD8^比值和Fas／FasL系统的作用。     

麻黄多糖对EAT小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响

目的：研究麻黄多糖对实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）小鼠免疫功能的影响。方法：通过对小鼠足跖皮下、背部皮下、腹部皮下、颈部皮下等部位进行免疫注射佐剂抗原，造成实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）。给药然后采用流式细胞仪检测各组外周血淋巴细胞亚群的水平。结果：麻黄多糖大剂量组脾指数低于模型组，表明麻黄多糖对EAT小鼠脾脏生长有一定的抑制作用；模型组小鼠CD4^＋淋巴细胞下降，CD4^＋淋巴细胞上升，与正常组相比，CD4^＋／CD8^＋比值显著增加。麻黄多糖33mg／kg与66mg／kg剂量组CD8^＋淋巴细胞相对含量较模型组显著上升，CD4^＋淋巴细胞略有下降，其CD4^＋／CD8^＋比值显著下降。结论：麻黄多糖治疗实验性自身免疫性甲状腺炎可能与其干预外周血淋巴细胞亚群有一定的关系。     

左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠抗卵巢抗体的影响

目的探讨左归丸对免疫性卵巢早衰(POF)小鼠生殖内分泌及抗卵巢抗体(AoAb)的影响。方法以SD雌性大鼠卵巢组织制备卵巢抗原,皮下多点免疫接种BALB/C雌性小鼠,建立POF模型。用左归丸处理造模过程中不同时间点小鼠,以泼尼松为阳性对照,光镜下观察卵巢组织的形态学特征,放射免疫法检测外周血血清卵泡刺激素(FSH)及雌二醇(E2)水平,酶联免疫法检测外周血AoAb。结果POF小鼠卵巢间质可见淋巴细胞浸润,外周血FSH升高,E2下降,AoAb阳性。左归丸能减缓POF小鼠外周血FSH升高,提高体内E2水平,抑制AoAb产生,早期用药比后期用药作用显著。结论左归丸能改善POF小鼠卵巢免疫性炎症的损伤,对POF具有一定的预防和治疗作用。     

左归丸和右归丸对自身免疫性脑脊髓炎大鼠中枢神经系统淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响

目的通过观察左归丸与右归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型大鼠脑、脊髓组织淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响,探讨滋阴补肾法与温阳补肾法治疗EAE作用机制。方法应用髓鞘碱性蛋白与完全福氏佐剂,按体积比1：1制成抗原并于Lewis大鼠双后足垫下注射,建立EAE模型。120只Lewis大鼠随机分为正常组、模型组、激素组、左归丸组及右归丸组,每组24只,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,3mL／（只·d）;激素组免疫后给予生理盐水灌胃,3mL／（只·d）,发病后改为醋酸泼尼松混悬液灌胃,5mg／（kg·d）;左归丸组免疫后给予左归丸混悬液,2g／（kg·d）;右归丸组免疫后给予右归丸混悬液,3g／（kg·d）。直至处死。分别于急性期（免疫后15d）和缓解期（免疫后27d）随机选取各组大鼠,取脑和脊髓组织切片进行CD4^＋、CD8^＋、CD3^＋、CD19^＋免疫组化染色。结果造模后第15日及第27日,模型组脑和脊髓组织中CD4^＋免疫组化表达均较正常组升高（P〈0．01）,CD8^＋表达降低（P〈0．05）,CD4^＋／CD8^＋比值升高（P〈0．01）;同模型组比较,左归丸组、右归丸组、激素组CD4^＋免疫组化表达均降低（P〈0．01）,且在造模后第27日,左归丸组和右归丸组脊髓组织CD4^＋表达较激素组显著降低（P〈0．01）;造模后第15日,右归丸组和激素组CD8^＋表达较模型组升高（P〈0．01）,造模后第27日,左归丸组和激素组CD8^＋表达较模型组升高（P〈0．01）;不同时点激素组、左归丸组及右归丸组CD4^＋／CD8^＋比值均显著低于模型组（P〈0．05）;造模后第15日及第27日,模型组中枢神经系统CD19^＋免疫组化表达均较正常组升高（P〈0．01）,急性期左归丸组、右归丸组、激素组脊髓组织CD19^＋表达较模型组降低（P〈0．01）,缓解期则见左归丸组和右归丸组CD19^＋表达减少（P〈0．01）。结论EAE大鼠CD4^＋／CO8^＋比值升高,这在EAE发病中发挥重要作用。滋阴补肾法和温阳补肾法可下调CD4^＋表达,下调CD4^＋／CD8^＋比值来治疗EAE。     

左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的探讨左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠(POF)卵巢Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法以小鼠透明带3为抗原,皮下多点注射免疫BALB/c雌性小鼠建立免疫性卵巢早衰模型。设左归丸低、中、高剂量进行治疗,以泼尼松、己烯雌酚为阳性对照,免疫组化法检测卵泡、卵巢间质Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与空白对照组比较,模型组大卵泡及小卵泡Bcl-2蛋白的表达均减少,Bax蛋白的表达均增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,左归丸高剂量组大卵泡及小卵泡Bcl-2蛋白的表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.001);左归丸高、中、低剂量组卵巢间质Bcl-2蛋白的表达均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05～0.001),大卵泡及小卵泡Bax蛋白的表达均减少,差异有统计学意义(P<0.01～0.001);左归丸中剂量组卵巢间质Bax蛋白的表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。左归丸各剂量组卵泡Bcl-2蛋白的表达呈现一定的量效关系。结论卵泡凋亡过快可能导致卵巢早衰,左归丸可能通过上调卵泡及卵巢间质Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,抑制卵泡的过快凋亡,从而改善卵巢功能。     

从卵泡凋亡的调节机制研究左归丸对免疫性卵巢早衰的治疗作用

目的:研究卵泡调节机制中左归丸对免疫性卵巢早衰患者的临床效果。方法:研究纳入雌性小鼠,抗原以小鼠透明带多肽ZP3为主,皮下多点注射免疫BALB/C建立免疫性卵巢早衰模型。根据左归丸治疗剂量不同分为低剂量、中剂量及高剂量三组,同时以己烯雌酚作为阳性对照组;分别采用流式细胞技术检测小鼠外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+、NK水平,以酶联免疫法(ELISA)检测小鼠外周血清FSH、E2及AZAb值,端口末端标记法(Tunel)检测小鼠颗粒细胞凋亡率,免疫组化法检测小鼠卵巢Fas-L、Bcl-2蛋白的表达,通过电镜观察小鼠卵巢组织的微观变化。结果:左归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组及己烯雌酚组FSH水平均显著低于模型组,其中以低剂量组和高剂量组下降明显,差异显著,P0.05;左归丸低剂量组、中剂量组及高剂量组E2水平均显著升高,差异显著,P0.05。各组间CD4~+、CD8~+、CD4~+/CD8~+数值水平变化不明显,差异无意义,P0.05;左归丸用药三组NK细胞均明显低于模型组,尤以左归丸低剂量组减少明显,差异显著,P0.05。左归丸三组和己烯雌酚组AZAb值均明显低于模型组,以左归丸高剂量组最明显,差异显著,P0.05;左归丸各剂量组AZAb值均明显低于己烯雌酚组,差异显著,P0.05;左归丸三组和己烯雌酚组细胞凋亡率均明显低于模型组,差异显著,P0.05。左归丸中剂量组、高剂量组及己烯雌酚组Bcl-2蛋白均明显高于模型组,以左归丸中剂量组最明显,差异显著,P0.05;左归丸三组Fas-L蛋白均明显升高,差异显著,P0.05。结论:左归丸治疗免疫性卵巢早衰主要通过调节免疫平衡、性腺内分泌水平、卵泡凋亡率及卵巢组织微观结构等方面有效改善卵巢功能,达到治疗卵巢早衰的目的,为临床维护和防治卵巢功能提供一定的基础依据。     

抗苗勒氏管激素在免疫性卵巢早衰中的发病意义及左归丸的作用机制

目的:研究抗苗勒氏管激素(AMH)在免疫性卵巢早衰(POF)中的发病意义及左归丸对POF小鼠AMH及其信号转导通路[AMH/活化素蛋白激酶2(ALK2)/Smad1]的影响,探讨左归丸的作用机制。方法:8周龄Balb/c雌性小鼠随机分为正常组、模型组、戊酸雌二醇组、左归丸组。以小鼠透明带3多肽建立POF动物模型,予左归丸及戊酸雌二醇进行治疗。电化学发光法检测小鼠血清AMH,卵泡刺激素(FSH)的水平,光学显微镜检测小鼠生长卵泡比率,免疫组化法及蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测小鼠卵巢AMH及其信号转导蛋白ALK2,Smad1蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清AMH水平明显降低,FSH水平明显升高(P0.05);与模型组比较,左归丸组明显升高小鼠血清AMH水平,明显降低FSH水平(P0.05)。与正常组比较,模型组小鼠卵巢生长卵泡比率明显减少(P0.01),与模型组比较,左归丸组生长卵泡比率明显增高(P0.05)。AMH,ALK2,Smad1蛋白均在卵泡颗粒细胞胞浆表达。与正常组比较,模型组小鼠卵巢AMH,ALK2,Smad1蛋白表达明显下降(P0.05);与模型组比较,左归丸组小鼠卵巢AMH蛋白表达明显升高(P0.05),免疫组化检测显示ALK2,Smad1表达均有上升,但无统计学差异,Western blot检测显示ALK2,Smad1表达也均明显升高(P0.05)。结论:POF的发生与AMH分泌不足、卵巢AMH蛋白表达低下有关,其通过影响AMH/ALK2/Smad1信号转导,影响始基卵泡的募集,从而使卵泡消耗过快,卵巢功能过早衰竭,卵巢处于衰老状态。左归丸可促进POF小鼠AMH分泌,上调卵巢AMH蛋白的表达,并通过影响AMH/ALK2/Smad1信号转导,抑制始基卵泡的过快募集和消耗,改善卵巢功能。     

左归丸对卵巢早衰小鼠性激素及Bcl-2/Bax表达的影响

目的:探讨左归丸对卵巢早衰小鼠性激素及Bcl-2/Bax表达的影响。方法:选取48只SPF级雌性小鼠,随机分为对照组、模型组、实验1组(左归丸高剂量组)、实验2组(左归丸低剂量组)。对照组每日腹腔注射生理盐水30ml/kg,其余三组注射环磷酰胺30 mg/kg,连续20d建立POF模型,干预30d。ELISA方法检测血清雌激素(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、抗苗勒管激素(AMH)、基础抑制素B(INHB)、抗透明带抗体(AZpAb),Western blot检测卵巢组织Bcl-2、Bax蛋白。结果:模型组E_2明显低于对照组,FSH明显高于对照组,说明造模成功。与对照组比较,模型组E_2、AMH、INHB、Bcl-2、Bcl-2/Bax明显降低,LH和FSH、AZpAb、Bax明显增高(P0.01);与模型组比较,实验1组、2组E_2、AMH、INHB、Bcl-2、Bcl-2/Bax明显增高,LH和FSH、AZpAb、Bax明显降低(P0.01)。结论:左归丸能够改善卵巢早衰小鼠性激素水平,抑制透明带抗体产生,使Bcl-2蛋白上调、Bax蛋白下调,抑制卵巢颗粒细胞凋亡,提高卵巢储备功能,减少卵巢早衰。     

左归丸对免疫性卵巢早衰模型小鼠卵巢GDF-9/ Smad2信号转导的影响

目的 观察左归丸对免疫性卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）模型小鼠卵巢生长分化因子-9（growth differentiation factor-9,GDF-9）/Smad2信号转导的影响,探讨左归丸治疗POF的机制。方法 将84只雌性Balb/c小鼠随机分为空白对照组（12只）、模型组（24只）、左归丸组（24只）及己烯雌酚组（24只）。除空白对照组外,其余3组以小鼠透明带多肽3（zona pellucida 3, ZP3）为抗原,皮下多点注射建立POF模型,左归丸组及己烯雌酚组分别给予2.7 g/（kg·d）左归丸及0.15 mg/（kg·d）己烯雌酚水溶液灌胃,每日1次,每周6次,连续灌胃4、8周。观察各组小鼠卵巢生长卵泡比率;分别采用免疫组化法及Western blot法检测小鼠卵巢组织GDF-9及Smad2蛋白表达水平。结果 与空白对照组比较,模型组造模4、8周小鼠卵巢生长卵泡比率及GDF-9、Smad2蛋白表达均明显减少（P<0.05）;与模型组同期比较,左归丸及己烯雌酚组小鼠卵巢生长卵泡比率、GDF-9蛋白水平表达明显升高（P<0.05）,左归丸组8周Smad2蛋白水平表达升高（P<0.05）。结论 POF的发病可能与卵巢GDF-9蛋白表达水平不足,GDF-9/Smad2信号转导功能低下,导致始基卵泡不能有效募集,原位闭锁有关。左归丸能增加卵泡GDF-9蛋白表达,其机制可能是通过GDF-9/Smad2信号转导通路对卵泡生长发育进行调节,从而发挥治疗POF的作用。     

左归丸对小鼠自身免疫性卵巢损伤的保护作用

目的探讨补肾复方左归丸对卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）的影响。方法以SD雌性大鼠卵巢组织制备卵巢抗原,皮下多点注射免疫BALB／C雌性小鼠,建立卵巢早衰模型。于造模过程中不同时间点用左归丸处理小鼠,以泼尼松为阳性对照,放射免疫法检测外周血卵泡刺激素（FSH）、雌二醇水平（E2）,酶联免疫法检测外周血抗卵巢抗体（AoAb）,原位杂交法检测卵巢组织生长分化因子-9（GDF-9）mRNA的表达。结果POF小鼠卵巢间质可见淋巴细胞浸润,外周血FSH升高,E2下降,AoAb阳性,卵母细胞GDF-9 mRNA阳性细胞数减少,生长卵泡及成熟卵泡数减少。左归丸能减缓POF小鼠外周血FSH升高,提高体内E2水平,抑制AoAb产生,提高卵母细胞GDF-9 mRNA阳性细胞数,使生长卵泡及成熟卵泡数增加,早期用药比后期用药作用显著。结论左归丸能改善卵巢免疫性炎症的损伤,对免疫性卵巢早衰具有治疗作用。