组织工程骨体内植入运动与感觉神经束后的成骨效果

目的：用放射学方法评估和比较两种组织工程骨体内神经支配重建方法的成骨效果，探讨神经化与成骨的相互关系。 方法：实验于2003-12／2005-03在南方医科大学南方医院动物所完成。20只新西兰大白兔随机分成3组：组织工程骨组、感觉神经束植入组、运动神经束植入组，每组6只。另2只兔作为骨缺损空白组。①除骨缺损空白组外，其余3组兔均制备组织工程骨。②各组兔均建立股骨1.5cm长骨缺损模型。③组织工程骨组于骨缺损处只嵌入β-磷酸三钙＋经诱导分化的骨髓基质细胞复合物；感觉神经束植入组将隐神经束植入β-磷酸三钙＋经诱导分化的骨髓基质细胞复合物的侧槽内；运动神经束植入组将股神经束植入β-磷酸三钙＋经诱导分化的骨髓基质细胞复合物的侧槽内并加以固定；骨缺损空白组骨缺损内不植入任何材料。④术后4，8，12周除骨缺损空白组外各组处死2只兔，观察组织工程骨的表面变化、内痂形成、骨缺损修复情况及周围组织反应。摄股骨正位X射线片，用放射影像学评分和X射线阻射影分析比较骨缺损修复情况。骨缺损空白组于术后12和18周各处死1只，摄片观察骨缺损愈合情况。 结果：实验兔20只均进入结果分析。①术后各组X射线片观察结果：组织工程骨组、运动神经束植入组在术后4，8，12周时，骨缺损区阻射影、材料吸收变化、截骨端愈合情况大体类似，感觉神经束植入组在各时间点的成骨量与骨痂塑形均较组织工程骨组、运动神经束植入组出现早且截骨端愈合快。②术后各组植入修复骨缺损的放射影像学评分结果：感觉神经束植入组正位照片骨缺损修复评分在4，8，12周均较组织工程骨组、运动神经束植入组的放射影像学评分为优14周：（8．333&;#177;0．816），（5.333&;#177;0.517），（5500&;#177;0.836）分；8周：（11.333&;#177;0.516），（7．166&;#177;0．408）．（8．167&;#177;0．307）分；12周：（12．500&;#177;0．894），（9．083&;#177;0．376），（10.083&;#177;0．801）分，P〈0．05]，但组织工程骨组、运动神经束植入组间无明显差异（P〉0．05）。③术后各组植入骨缺损阻射密度测量值的比较：感觉神经束植入组在4，8，12周的骨缺损阻射密度相对值均大于组织工程骨组、运动神经束植入组（4周：58．663&;#177;2．541．43．501&;#177;2．725，44．578&;#177;2．948；8周：62．375&;#177;0．992，54．638&;#177;1．265，54．203&;#177;1．556；12周：84．582&;#177;1．017，71.683&;#177;2．101．73．585&;#177;1．975，P〈0．05），但组织工程骨组、运动神经束植入组间差异不明显（P〉0．05）。 结论：利用感觉神经束植入的方法可以提高组织工程骨的成骨作用，而植入运动神经束却无此作用。     

新西兰大白兔组织工程骨的构建及体内异位成骨效果

目的:探讨新西兰大白兔组织工程骨股骨旁异位成骨(ectopic bone formation)的效果。方法:选取新西兰大白兔骨髓基质干细胞进行成骨诱导,与生物陶瓷构建组织工程骨,种植到新西兰大白兔股骨的骨膜旁,第8周获得异位成骨组织,检测分析收获的异位成骨材料结构。结果:第8周的异位成骨材料内有骨组织形成,成骨材料结构清晰,组织内部有新血管形成,荧光蛋白标记的标本有荧光蛋白表达。结论:组织工程骨在体内可顺利异位成骨。     

恒河猴体内构建组织工程骨的生物学安全性评价

目的:对恒河猴体内构建的组织工程骨进行生物学安全性评价。方法:实验于2003-05/2004-12在解放军第一军医大学完成。雄性恒河猴6只,体质量4～6kg,分别抽取实验动物的骨髓,体外培养骨髓基质干细胞并向成骨细胞诱导,将诱导后的骨髓基质干细胞以5×109L-1的浓度与可吸收羟基磷灰石复合,体外培养3d后回植入恒河猴背阔肌异位构建组织工程骨,分别于术前、术后2,4,12周4个时间点进行长期毒性试验(观察植入后动物的生理状况及血生化指标在术后各时间点与术前的变化)、肌内植入试验(观察炎性浸润、纤维包囊形成及有无异形细胞)、遗传毒性试验(观察嗜多染红细胞,记录微核数)等检测。结果:纳入恒河猴6只,均进入结果分析。①体内构建组织工程骨后,动物精神、行为、活动、摄食及粪便无异常,无血尿,体质量逐渐增加。术后2,4,12周和术前相比,外周血象、血生化指标差异均无显著性意义(P>0.05),②各时间点骨髓相均增生活跃、形态正常;植入试验2周周围肌肉可见少量炎性细胞浸润,4,12周未见明显炎性细胞和异型细胞。③各组骨髓涂片在镜下难以见到嗜多染红细胞,均未发现有微核形成。结论:恒河猴体内构建组织工程骨具有良好的生物学安全性。     

用于组织工程骨构建研究的兔单一负重骨缺损模型

目的：为组织工程骨构建及修复负重长骨缺损的研究提供标准化的实验性骨缺损动物模型。方法：本实验于2004-10／2005-04在南方医科大学南方医院组织工程实验室和实验动物研究中心完成。①测量成年新西兰大白兔5只10具股骨干标本相关解剖数据并据此改进兔股骨固定方法。②18只新西兰大白兔随机分为3组，每组6只，分别制备10mm，15mm，20mm的股骨干中段骨和骨膜缺损，普通钢板螺丝钉及钢丝固定。③术后4，8，12周分别摄X射线侧位片进行定性分析、双能量X射线骨密度测量仪（DEXA）测量骨密度进行定量分析，各时间点每组各取2只标本做组织学检查。结果：23只兔均进入结果分析。①兔股骨测量结果：股骨长度（94．1&;#177;3．01mm；股骨干中点横径（7．4&;#177;0．4）mm，矢状径（5．8&;#177;0．41mm；骨皮质平均厚度（1．2&;#177;0．1）mm；髓腔平均直径（4．1&;#177;0．2）mm。②大体观察：4周时各组骨缺损均为纤维组织填充；8周时10mm骨缺损组已经见到骨痂连接；12周时10mm骨缺损组骨痂坚实，无异常活动，而15mm，20mm骨缺损组均为纤维瘢痕组织填充，去除内固定后有异常活动度。③X射线观察缺损区骨生长情况：10mm骨缺损组第12周时骨缺损区图像与4周时相比有明显的新骨形成；而15mm，20mm骨缺损组各时间段均无骨性填充影像；DEXA测量结果显示10mm骨缺损组在12周时新生骨已达临近骨组织密度的一半，而15mm，20mm骨缺损组各时间段的骨密度均为零。④组织学检查：12周时10mm缺损组由新生骨和软骨组织填充，部分髓腔再通；15mm，20mm骨缺损组在12周的观察期内只有骨断端和钢板螺丝钉周围有少量骨痂生长。以上各项检查显示：10mm骨缺损组均于8～12周出现骨性愈合；15mm和20mm骨缺损组直到12周仍未见骨愈合现象。结论：钢板螺丝钉固定的兔股骨干15mm以上的实验性骨缺损不能自行愈合，可用于组织工程骨的血管神经同步构建研究。     

成骨诱导脂肪基质细胞在骨组织工程体内成骨中的作用

背景:以往研究认为,经过成骨诱导后的脂肪基质细胞通过转化为成骨细胞分泌骨基质进而修复骨缺损,然而并没有明确结论证实。目的:将经过体外成骨诱导的脂肪基质细胞复合支架材料分别植入骨缺损区和非骨区,根据是否成骨,验证经过成骨诱导后的脂肪基质细胞是否转化为成骨细胞。方法:取12月龄犬背部皮下脂肪,经胶原酶消化法获得单个核细胞,将培养的第3代细胞与双相磷酸钙陶瓷形成复合物。在犬下颌骨两侧制备长20mm、高10mm的箱状缺损,拔除术区牙齿,将细胞支架复合物植入一侧术区,空白侧留作对照;另外在犬背部皮下肌肉区植入细胞支架复合物及骨诱导性磷酸钙陶瓷材料,术后6周及12周经组织学检测骨缺损修复情况。结果与结论:脂肪基质细胞复合双相磷酸钙陶瓷在骨缺损区成骨,在肌肉区未形成新骨;骨诱导性磷酸钙陶瓷在肌肉区形成新骨。提示成骨诱导并不能将脂肪基质细胞转化为成骨细胞,其确切机制有待进一步研究。     

新型组织工程化骨材料植入动物体内的成血管效应

背景:以生长因子、种子细胞、载体支架为基础的骨组织工程研究取得的成功,向人们展示了再造骨组织器官的美好前景,然而在临床应用方面往往效果不理想.其中很重要一个原因是组织工程骨很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效.目的:新型组织工程骨修复材料植入新西兰兔桡骨缺损处观察其成血管作用.方法:将聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物包裹碱性成纤维细胞生长因子制备成微球囊,然后与磷酸钙骨水泥混合,并与体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞共培养制备新型组织工程骨修复材料.60只成年新西兰兔建立15 mm桡骨缺损模型后随机分成2组,实验组植入新型组织工程骨修复材料,对照组植入复合骨髓间充质干细胞的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物与磷酸钙骨水泥的混合材料.于术后4、8、12周,通过组织细胞形态学观察、核素骨扫描等手段,观察各个时期血管形成情况.结果与结论:光镜下组织形态学观察结果及核素骨扫描结果示血管化程度是实验组优于对照组.结果显示聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物-成纤维细胞生长因子/磷酸钙骨水泥材料复合骨髓间充质干细胞构建的新型组织工程骨修复材料在动物体内有较好的成血管效果.     

新型组织工程化骨材料植入动物体内的成血管效应

背景：以生长因子、种子细胞、载体支架为基础的骨组织工程研究取得的成功,向人们展示了再造骨组织器官的美好前景,然而在临床应用方面往往效果不理想。其中很重要一个原因是组织工程骨很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。目的：新型组织工程骨修复材料植入新西兰兔桡骨缺损处观察其成血管作用。方法：将聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物包裹碱性成纤维细胞生长因子制备成微球囊,然后与磷酸钙骨水泥混合,并与体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞共培养制备新型组织工程骨修复材料。60只成年新西兰兔建立15mm桡骨缺损模型后随机分成2组,实验组植入新型组织工程骨修复材料,对照组植入复合骨髓间充质干细胞的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物与磷酸钙骨水泥的混合材料。于术后4、8、12周,通过组织细胞形态学观察、核素骨扫描等手段,观察各个时期血管形成情况。结果与结论：光镜下组织形态学观察结果及核素骨扫描结果示血管化程度是实验组优于对照组。结果显示聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物-成纤维细胞生长因子/磷酸钙骨水泥材料复合骨髓间充质干细胞构建的新型组织工程骨修复材料在动物体内有较好的成血管效果。     

骨与软骨组织工程研究成果的介绍及问题展望

近年来随着组织工程技术的兴起，医务工作者们看到了一种更有效、安全的修复和重建缺损组织的治疗措施。通过国内外大量的动物实验，证实了组织工程化骨与软骨修复组织缺损的可行性、有效性及优越性。组织工程化骨与软骨修复组织缺损、重建组织功能，在动物模型以及初步临床应用研究领域已取得了一定的成果，相较传统手术方法而言，组织工程技术拥有更广阔的临床应用前景，尤其适用于骨科、口腔科、颅面外科、耳鼻喉科等临床科室。然而，通过现有的研究结果，认识到目前构建的组织工程化组织还很不完善，存在组织成分单一、生物活性不足、支架材料及组织再生能力有限、未能实现产业化生产等局限性。     

骨诱导性磷酸钙陶瓷支架在脂肪组织中构建体内组织工程骨

背景：作为体内组织工程骨的构建场所,非骨组织的选择至关重要。早期研究大多选用肌肉作为异位骨移植物的构建区域,但其位置较深,可利用面积小、手术操作复杂,不利于临床推广。目的：采用体内骨组织工程的方法,探索骨诱导性磷酸钙陶瓷支架在不同非骨组织中构建骨移植物的可行性。方法：选取家犬的背部肌肉组织和脂肪组织为构建区,分别植入骨诱导性磷酸钙陶瓷支架以构建体内组织工程骨移植物。于移植后4,8,12,16周取样进行单光子计算机断层扫描及组织学检测,观察其构建过程,比较各个观测时间内,不同构建区的骨移植物中新骨组织的形成情况,评价不同非骨构建区域对体内骨组织骨移植物形成的影响。结果与结论：骨诱导性磷酸钙陶瓷支架在肌肉组织和脂肪两处非骨组织中均可形成体内组织工程骨移植物,在构建初期,肌肉组中新骨形成的时间比脂肪组早,骨量也较多,但随着构建时间的延长,两组的新生骨量差异逐渐减小。提示,应用体内骨组织工程的方法在肌肉和脂肪组织均可构建出具有生命活性的自体骨移植物。与肌肉组织比较,脂肪组织面积宽广,位置浅表,因此在脂肪组织中构建体内组织工程骨移植物更有临床应用前景。     

骨诱导性磷酸钙陶瓷支架在脂肪组织中构建体内组织工程骨

背景:作为体内组织工程骨的构建场所,非骨组织的选择至关重要.早期研究大多选用肌肉作为异位骨移植物的构建区域,但其位置较深,可利用面积小、手术操作复杂,不利于临床推广.目的:采用体内骨组织工程的方法,探索骨诱导性磷酸钙陶瓷支架在不同非骨组织中构建骨移植物的可行性.方法:选取家犬的背部肌肉组织和脂肪组织为构建区,分别植入骨诱导性磷酸钙陶瓷支架以构建体内组织工程骨移植物.于移植后4,8,12,16周取样进行单光子计算机断层扫描及组织学检测,观察其构建过程,比较各个观测时间内,不同构建区的骨移植物中新骨组织的形成情况,评价不同非骨构建区域对体内骨组织骨移植物形成的影响.结果与结论:骨诱导性磷酸钙陶瓷支架在肌肉组织和脂肪两处非骨组织中均可形成体内组织工程骨移植物,在构建初期,肌肉组中新骨形成的时间比脂肪组早,骨量也较多,但随着构建时间的延长,两组的新生骨量差异逐渐减小.提示,应用体内骨组织工程的方法在肌肉和脂肪组织均可构建出具有生命活性的自体骨移植物.与肌肉组织比较,脂肪组织面积宽广,位置浅表,因此在脂肪组织中构建体内组织工程骨移植物更有临床应用前景.     

99Tcm-MDP骨显像监测可注射组织工程骨的成骨活性

背景:有关牵张成骨传统的新骨生长形态观察方法如超声、X 射线、CT文献报道较多,但有关核素监测的报道较少.目的:探讨经皮注射可注射组织工程骨促进牵张间隙成骨的可行性及放射性核素骨显像对其的早期监测作用.方法:将20只日本大耳白兔以随机数字表法分为实验组和对照组,两组均于右胫骨中下段造成20 mm的骨缺损,干骺端截骨.7 d后延长,1 mm/次、1次/d.造模前实验组分离培养自体骨髓间充质干细胞,传至第2代后诱导成骨.延长达靶位点后,实验组牵张间隙内注射自体干细胞悬液,并同时注射自体富血小板血浆;而对照组只注射等量生理盐水.采用核素骨显像监测移植后2,4,8周时成骨情况.结果与结论:放射性骨显像99Tcm-MDP注入3 h后,实验组与对照组可见显像剂明显沉积于牵张间隙区,均较对侧健性部位显影强.骨骼、肾及膀胱显像清楚,骨/软组织的对比度清晰,各组均可见大关节及肌腱附着处有对称性放射性增高区.两组在2,4周时牵张间隙放射性聚集呈现出上升的趋势,实验组上升趋势更为显著;8周时实验组和对照组核素浓聚变弱,但两者差异仍有显著性意义(P < 0.01).结果说明经皮注射移植复合富血小板血浆的可注射组织工程骨能够促进牵张间隙成骨能力,缩短成骨时间.放射性核素骨显像在早期修复过程有比较灵敏的监测效果.     

拉曼光谱法快速区分周围神经束性质

目的探索一种快速鉴别神经束性质的方法。方法取新西兰大白兔32只,放血处死后,在手术显微镜下暴露取脊神经前根、后根各3~5 mm,立即做冰冻横切片,片厚30μm,进行拉曼光谱观察。结果同类标本拉曼光谱重现性好,光谱特征基本相似。运动神经与感觉神经的拉曼光谱在1 088 cm-1、1 276 cm-1、1 439 cm-1等附近的拉曼振动峰相对强度存在明显差异,1276 cm-1处的峰值与1 439 cm-1处的峰值比反映了运动神经与感觉神经之间的微观结构差异。结论不同性质神经拉曼光谱具有各自的特征谱,依据光谱特征的不同来区分神经束性质是一种鉴别神经束性质的有效方法。     

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复坐骨神经缺损

背景:作者前期已经成功将无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经,并证明可以促进周围神经再生.目的:构建组织工程人工神经,观察和验证桥接大鼠坐骨神经缺损后的神经功能恢复情况.方法:成年雄性SD大鼠60只构建大鼠坐骨神经15 mm缺损模型.随机分成3组,每组20只.桥接大鼠坐骨神经缺损,实验组采用组织工程人工神经,空白对照组采用无细胞组织工程神经支架,自体神经对照组采用自体神经移植.桥接后12周通过大体观察、胫骨前肌湿质量、组织学等方法分析坐骨神经组织学及功能恢复情况.结果与结论:桥接术后12周:实验组大鼠肢体可以支撑着地,钳夹大鼠手术侧足底皮肤出现逃避反射,足底皮肤s.100蛋白染色呈阳性反应.实验组与自体神经移植组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义(P＞0.05).实验组辣根过氧化物酶逆行示踪实验显示脊髓、后根神经节均可见数量不等的辣根过氧化物酶标记阳性细胞.实验组移植物与自体神经移植组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、神经组织面积比较差异无显著性意义.实验结果验证了无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损,可以促进神经组织学的修复重建和功能的恢复.     

感觉神经端侧吻合后再生纤维的功能

目的:应用两种电生理技术,评价感觉神经端侧吻合后再生神经的功能。方法:取兔(新西兰兔15只,雌雄不拘,随机分为实验组、对照组和正常组,每组5只)耳大神经移植体作为受神经,与对侧耳大神经端侧吻合并植入皮瓣。用神经单纤维放电引导电生理技术检测皮瓣内再生放电纤维数量、分布、感觉类型。同时以免(新西兰兔16只,雌雄不拘,随机分为10,20,30周实验组和正常对照组,每组4只)2条耳大神经作端侧吻合模型,用RM-6280多道智能生理记录及分析处理系统测定再生纤维动作电位幅值恢复率和神经传导速度。结果:植入皮瓣的受神经在术后4个月可再生触、压、痛、温冷觉末梢,使皮瓣初步建立神经再支配。受神经内再生纤维的动作电位幅值恢复率10,20,30周时分别为(53.0±3.7)%,(66.8±5.5)%,(88.8±2.3)%;神经传导速度10,20,30周时分别为(42.4±1.6),(55.6±1.2),(57.2±1.6)m/s,随时间延长逐步增加。术后30周受神经近端再生纤维幅值恢复率和传导速度分别达到正常的88.8%和94.38%。结论:感觉神经端侧吻合后能再生有功能的神经纤维,再生速度稍慢。