基因治疗成骨肉瘤的探索:人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区克隆和反义RNA表达质粒构建

目的:构建CD147反义RNA表达质粒载体,探索治疗骨肉瘤侵袭和转移的新方法。方法:实验于2004-05在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所实施,以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用反转录聚合酶链反应方法得到人CD147的编码区cDNA,用DNA重组技术将人CD147编码区基因反向克隆到真核表达质粒PcDNA3.1(+)中,构建成CD147反义RNA表达质粒PcDNAasCD147。用阳离子脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞系MG63,经G418筛选后获得的克隆进行鉴定。结果:CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。免疫组化SP法染色证实:转染细胞MG63/PcDNAasCD147,与亲本细胞相比,CD147的表达明显下降。结论:成功地从人成骨肉瘤细胞中克隆出CD147编码区基因,构建了CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147,此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能以及为成骨肉瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

自噬基因Beclin1与骨肉瘤发生和发展的相关性研究

目的 探讨自噬基因Beclin 1在骨肉瘤发生、发展中的作用,并分析其过表达对人骨肉瘤细胞株MG63体外生长的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹法对人成骨肉瘤细胞MG63及成骨细胞hFOB1.19中Beclin l mRNA及蛋白表达水平进行检测;构建表达融合蛋白的真核表达载体pEGFP/Beclin 1,并用脂质体转染人骨肉瘤细胞MG63.用MTT法分析外源性Beclin 1过表达对MG63增殖的影响,并用流式细胞仪检测凋亡情况.结果 人成骨肉瘤细胞MG63中Beclin 1mRNA及蛋白表达水平显著低于人成骨细胞hFOB1.19(0.17±0.06与0.43±0.11,t=29.493,P＜0.01;0.13±0.05与0.25±0.08,t=6.325,P＜0.01).pEGFP/Beclinl转染人成骨肉瘤细胞MG63后使其mRNA水平表达升高(5.34±0.50)倍,转染成功.正常培养的MG63细胞及空质粒转染的MG63细胞内,凋亡细胞很少,均为(0.10±0.05)％;而转染Beclin 1编码序列后凋亡细胞的比例明显升高,为(4.3±0.8)％,差异有统计学意义(t=5.752,P＜0.05).结论 Beclin1在骨肉瘤细胞中表达下降,可能与骨肉瘤的发生、发展密切相关,其过表达可抑制人成骨肉瘤细胞MG63的增殖并诱导其凋亡.     

反义Snail转录因子对骨肉瘤细胞增殖和转移能力的影响

目的:探讨反义Snail转录因子对人骨肉瘤细胞株MG-63增殖和转移的影响.方法:用脂质体转染法将高转移性骨肉瘤细胞株MG-63分别转染反义Snail质(pGenesil-snail AS)和空载体质粒(pGenesil).G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆.采用免疫组化、Western blot及半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同组MG-63骨肉瘤细胞中Snail表达;体外细胞运动实验及重组细胞基底膜(Matrigel)侵袭实验了解细胞转移潜能的改变;以噻唑蓝(MTT)比色法和克隆形成实验观察细胞增殖.结果:MG-63细胞内Snail表达明显,转染反义Snail质粒后,Snail表达明显被抑制.Snail表达下降的同时伴随着体外细胞增殖、黏附和侵袭力的抑制.结论:骨肉瘤细胞中存在Snail蛋白及mRNA的高表达,抑制Snail mRNA的表达对骨肉瘤细胞的侵袭、运动和增殖有抑制作用,可能为骨肉瘤的基因治疗提供新的靶点.     

RNA干扰表皮生长因子受体对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA载体介导抑制骨肉瘤细胞中表皮生长因子受体(EGFR)的表达和对骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响.方法:构建pSilencer-EGFR短发夹状小干扰RNA(siRNA)真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到骨肉瘤细胞中,用Western印迹法、RT-PCR检测EGFR基因在骨肉瘤细胞中的表达;通过原位末端标记 (TUNEL)法,DNA片段化检测观察其对骨肉瘤细胞凋亡的影响.结果:成功构建pSilencer-EGFR短发夹状siRNA真核基因表达载体,转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的骨肉瘤细胞中EGFR基因表达显著抑制(60%).与对照组比较,pSilencer-EGFR转染组骨肉瘤细胞培养 48 h后,DNA片段化检测出"DNA ladder"和TUNEL法显示细胞典型凋亡特征.结论:EGFR小发夹RNA质粒载体可显著抑制骨肉瘤细胞中EGFR基因的表达,促进骨肉瘤细胞凋亡,EGFR基因具有抑制凋亡的作用.     

人骨肉瘤mta1 mRNA的siRNA载体构建及其对mta1沉默作用

目的本实验拟构建针对mta1 mRNA的siRNA重组载体,将siRNA对应的DNA发卡样双链序列克隆入载体内,位于H1启动子下游,转染入人骨肉瘤细胞内,在细胞内表达mta1靶向的siRNA分子,特异性沉默mta1的表达。方法依据GenBank中mta1基因(NM-004689)的序列,用设计分析软件进行设计候选序列,确定针对mta1的siRNA序列。合成mta1发卡样siRNA寡核苷酸,退火成双链DNA,克隆入T载体,利用α互补和T7/SP6PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-mta1;用BglⅡ和HindⅢ双酶切重组子pGEM-T-mta1和siRNA表达载体pSuperneo;将双粘mta1发卡样siRNA片段亚克隆入siRNA表达载体pSuperneo中;利用BglⅡ和HindⅢ双酶切筛选鉴定重组子pSuperneo-mta1;对插入序列进行DNA序列分析。将siRNA表达载体pSuperneo-mta1转入人骨肉瘤细胞系MG-63中,用RT-PCR方法检测细胞mta1 mRNA表达水平。结果转染pSuperneo-mta1的实验组骨肉瘤细胞中mta1 mRNA表达几乎完全被抑制,而2个对照组(无关siRNA对照组和空载体对照组)和未转染的骨肉瘤细胞系MG-63细胞中都存在较高水平的mta1 mRNA表达。结论设计出针对mta1的发卡样siRNA寡核苷酸片段,成功构建出针对mta1的siRNA表达载体pSuperneo-mta1,pSuperneo-mta1转染骨肉瘤细胞后能显著降低细胞mta1 mRNA表达。     

siRNA对骨肉瘤U20S细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的 研究载体介导的siRNA(small interfere RNA)技术对骨肉瘤细胞株U20S中MDM2-mRNA表达的抑制作用.方法 依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体(PGCsilencerTM-MDM2 siRNA).实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U20S细胞中MDM2-mRNA表达改变.结果 成功构建发卡样MDM2 siRNA真核表达载体(PGCsilencer TM-MDM2 siRNA);PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U20S细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降(P＜0.05),转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异(P＞0.05).结论 成功构建PGCsilencer TM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U20S细胞中MDM2-mRNA表达.     

人CD13基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的 克隆人CD13全长cDNA,构建稳定表达人CD13 分子的基因转染细胞株.方法 提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR 克隆人CD13基因,将人CD13基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD13 和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞.结果 成功克隆人CD13基因和构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/ CD13,并成功获得稳定表达人CD13的基因转染细胞株L929/CD13.结论 成功克隆了人CD13基因及其逆转录表达载体,成功制备了稳定表达人CD13的基因转染细胞株,为研究CD13生物学功能奠定了基础.     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

人雌激素β受体RNAi反转录病毒载体在人成骨样MG63细胞中的表达

背景：目前已有较多关于雌激素α受体基因如何参与骨代谢的研究,而对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究则相对较少。目的：构建人雌激素β受体RNAi反转录病毒表达载体,并通过病毒介导其在人成骨样MG63细胞中表达。方法：根据GeneBank数据库提供的雌激素β受体基因核苷酸序列,选择设计3条针对人雌激素β受体干扰靶序列,并与pRNAT-H1.4/Retro质粒定向连接,构建真核表达载体pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。将pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA经脂质体转染至293细胞包装成反转录病毒。将包装好的反转录病毒,以空白及非特异性shRNA作为对照,感染人成骨样MG63细胞株。结果与结论：3个连接了雌激素β受体-shRNA的重组质粒经酶切鉴定分析证实目的序列己插入到预计位点,符合设计要求,测序鉴定表明重组质粒中含有针对雌激素β受体基因目的序列,表明重组质粒构建成功。并经脂质体转染至293细胞后成功包装成反转录病毒。反转录病毒载体能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞株,感染效率为70%左右。包装后的3种雌激素β受体-shRNA反转录病毒均能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞,并显著抑制雌激素β受体的表达。其中以雌激素β受体-shRNA3为最佳的干扰序列。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

siRNA对骨肉瘤U2OS细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的 研究载体介导的siRNA（small interfere RNA）技术对骨肉瘤细胞株U20S中MDM2-mRNA表达的抑制作用.方法 依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体（PGCsilencerTM-MDM2 siRNA）.实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U20S细胞中MDM2-mRNA表达改变.结果 成功构建发卡样MDM2 siRNA真核表达载体（PGCsilencer TM-MDM2 siRNA）;PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U20S细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降（P＜0.05）,转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异（P＞0.05）.结论 成功构建PGCsilencer TM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U20S细胞中MDM2-mRNA表达.     

核转运蛋白2慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的探索构建针对人类核转运蛋白2(KPNA2)基因的重组慢病毒干扰RNA(sh RNA)载体的方法,研究其对人骨肉瘤细胞株MG63的沉默效率。方法针对KPNA2基因设计小片段干扰序列。加入AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶酶切位点,根据设计好的序列合成单链DNA oligo并退火合成双链DNA oligo。将合成好的双链DNA oligo与GV115载体重组,形成GV115-sh RNA慢病毒载体。聚合酶链式反应(PCR)法鉴定筛选出阳性重组子,经测序后包装慢病毒载体。荧光法测定病毒滴度,重组慢病毒感染骨肉瘤细胞株MG63,通过显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达来计算其转染效率。RT-PCR法检测重组慢病毒RNA干扰载体对人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2表达的沉默效率。实验结果数据以均数±标准差(sx±)表示,应用SPSS 13.0统计软件分析,两组均数间的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计意义。结果经PCR分析和测序证实,成功构建KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体;荧光法测定病毒滴度为4×108 TU/ml;荧光显微镜下观察GFP,显示细胞感染效率达到80%以上;RT-PCR检测对照组及实验组KPNA2 m RNA表达分别为0.991±0.087 vs.0.216±0.012,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体构建成功,并有效干扰人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2 m RNA的表达。     

HBVe抗原的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有HBV e抗原基因的pcDNA3真核表达载体,并在BEL7402肝癌细胞中表达与鉴定.方法 设计合成针对e基因片段的PCR引物序列,以pUC19/3HBV为模板扩增出HBeAg基因片段,克隆到真核表达载体pcDNA3的多克隆位点中,构建pcDNA-HBeAg真核表达载体.然后采用脂质体转染法将其转染人肝癌细胞系BEL7402肝癌细胞,分别运用逆转录PCR和ELISA在RNA水平和蛋白水平检测其在真核细胞中的表达.结果 所克隆HBV e抗原基因片段经测序完全正确;重组质粒转染BEL7402细胞后,检测有HBeAg表达.结论 成功构建pcDNA3-HBeAg真核表达载体,并在肝癌细胞中有效表达,为进一步体外研究HBeAg奠定基础.     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

乙肝反义全基因真核载体的构建及在SMMC—7721细胞内的表达

目的 研究HBV反义全基因真核表达载体在抗HBV基因治疗的可能性,方法 采用基因重组技术,将HBV全基因片段反向插入真核细胞表达载体pBK-CMV克隆位点中,通过FuGENE^TM6转染试剂,将重组体转染人肝癌细胞系SMMC-7721细胞,结果 经RT-PCR表明,重组体导入的人肝癌细胞内有HBV反义RNA转录表达,且重组体导入对细胞生长无明显影响。结论 HBV全基因真核细胞表达载体在SMMC-7721细胞中能转录表达反义RNA,因而有可能利用反义技术和转基因方法进行HBV全基因反义RNA抗HBV研究。     

乙肝反义全基因真核载体的构建及在 SMMC－ 7721细胞内的表达

目的研究HBV反义全基因真核表达载体在抗HBV基因治疗的可能性。方法采用基因重组技术,将HBV全基因片段反向插入真核细胞表达载体pBK－CMV克隆位点中,通过FuGENETM6转染试剂,将重组体转染人肝癌细胞系SMMC－7721细胞。结果经RT－PCR表明,重组体导入的人肝癌细胞内有HBV反义RNA转录表达,且重组体导入对细胞生长无明显影响。结论HBV全基因真核细胞表达载体在SMMC－7721细胞中能转录表达反义RNA,因而有可能利用反义技术和转基因方法进行HBV全基因反义RNA抗HBV研究。     

乙肝反义全基因真核载体的构建及在SMMC-7721细胞内的表达

目的 研究HBV反义全基因真核表达载体在抗HBV基因治疗的可能性。方法 采用基因重组技术 ,将HBV全基因片段反向插入真核细胞表达载体pBK -CMV克隆位点中 ,通过FuGENETM6转染试剂 ,将重组体转染人肝癌细胞系SMMC -7721细胞。结果 经RT-PCR表明 ,重组体导入的人肝癌细胞内有HBV反义RNA转录表达 ,且重组体导入对细胞生长无明显影响。结论 HBV全基因真核细胞表达载体在SMMC -7721细胞中能转录表达反义RNA ,因而有可能利用反义技术和转基因方法进行HBV全基因反义RNA抗HBV研究。     

反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

沉默IL-37表达对骨肉瘤细胞的影响及其作用机制研究

目的 探讨IL-37对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法 定量逆转录PCR（RT-qPCR）检测人正常成骨细胞（hFOB1.19）和骨肉瘤细胞（U2OS、MG63、Saos-2）中IL-37 mRNA的表达情况;设计沉默IL-37的小干扰RNA（siRNA）序列转染骨肉瘤细胞系,将转染干扰序列si...