皮肤癣菌的分子生物学研究进展

皮肤癣菌是浅部真菌病的致病菌 ,对其分子生物学研究主要集中于基因结构的分析、基因诊断、基因分类等方面。目前 ,已在红色毛癣菌等某些癣菌的线粒体DNA上发现了重要的呼吸链酶 ,如细胞色素氧化酶、NADH脱氢酶的结构基因 ,以及诸多氨基酸的tRNA基因簇 ;建立了用真菌特异性通用引物或癣菌特异性引物聚合酶链反应诊断皮肤癣菌病的方法 ;应用限制性酶切片段多态性研究、随机扩增多态DNA分析、聚合酶链反应等方法进行皮肤癣菌的基因分类 ,分析癣菌的种间差异 ,对一些重要的皮肤癣菌 (如红色毛癣菌、须癣毛癣菌 )还进行了种内的分型研究。     

临床常见皮肤癣菌的分子生物学鉴定

目的应用任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)鉴定临床常见皮肤癣菌。方法用引物AP3(5-′TCAC-GATGCA-3′)、任意引物ATG(5-′ATGGATCGGC-3′)、任意引物TCA(5-′TCACCACGGT-3′)和任意引物TCT(5-′TCTGTGCT-GG-3′)对常见皮肤癣菌进行任意引物聚合酶链反应。46株须癣毛癣菌采用引物ATG和引物AP3进行AP-PCR,并对扩增产物进行电泳分析。结果扩增产物电泳分析发现不同菌种间产生的DNA带型存在明显差异,尤其用引物AP3和引物ATG扩增产生的DNA带型的种间差异最明显。46株须癣毛癣菌的表型,全部为粉型,且均产生具有明显的电泳带型,可分为2型。结论AP-PCR可作为常见皮肤癣菌的种间及种内鉴定的简单、快速、可靠的方法。     

用任意引物聚合酶链反应进行皮肤癣菌的分子生物学研究

目的 探讨任意引物聚合酶链反应（AP-PCR）方法对皮肤癣菌的分子生物学鉴定和分型的意义。方法 用随机引物OPAA115′-ACCCCACCTG-3′，OPD185′-GAGAGCCAAC-3′对皮肤癣菌的3个属9个种和孢子丝菌及白念珠菌共64个菌株进行AP-PCR，并对扩增产物进行电泳分析。结果 皮肤癣菌所试验的9个菌种之间均产生具有明显差异的电泳带型，来自不同地区的红色毛癣菌丝多次实验均出现主带相同的电泳带型，同时存在株间差异。结论 以OPAA11和OPD18为引物，用AP-PCR可对皮肤癣菌从基因分子水平上进行鉴别。并为分型提供依据。     

须癣毛癣菌随机扩增DNA多态性分型研究

研究须癣毛癣菌的ＤＮＡ分型，了解ＤＮＡ型别与形态学分型，有性型型别，以及与菌种来源地区，与人体感染部位之间的关系。用氯化苄法提取ＤＮＡ，以随机扩增ＤＮＡ多态性方法对临床分离的须癣毛癣功４２株以及部分其它皮肤癣菌和我科保藏的菌种Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ８株进行分型。     

用任意引物聚合酶链反应进行皮肤癣菌的子生物学研究

目的探讨任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)方法对皮肤癣菌的分子生物学鉴定和分型的意义。方法用随机引物OPAA115'-ACCCGACCTG-3',OPD185'-GAGAGCCAAC-3'对皮肤癣菌的3个属9个种和孢子丝菌及白念珠菌共64个菌株进行AP-PCR,并对扩增产物进行电泳分析。结果皮肤癣菌所试验的9个菌种之间均产生具有明显差异的电泳带型。来自不同地区的红色毛癣菌经多次实验均出现主带相同的电泳带型,同时存在株间差异。结论以OPAA11和OPD18为引物,用AP-PCR可对皮肤癣菌从基因分子水平上进行鉴别,并为分型提供依据。     

皮肤癣菌的分子生物学鉴定

皮肤癣菌可侵犯角质组织引起皮肤癣菌病 ,常规的皮肤癣菌鉴定方法敏感性差且耗时长 ,ｒＤＮＡ序列分析可用于种系发育和进化研究 ,但不能用作种群鉴定。作者研究应用高度变异的内转录间隔 1 (ＩＴＳ1 )ｒＤＮＡ鉴定皮肤癣菌。方法 :测试菌为 1 7种皮肤癣菌 ,包括有性期的粉状节皮菌、格梯节皮菌、石膏节皮菌和四叉节皮菌 ;无性期的嗜角金孢子菌、絮状表皮癣菌、Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓｒｅｅｓｓｉｉ、奥杜盎小孢子菌、犬小孢子菌、鸡禽小孢子菌、须癣毛癣菌须癣变种、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、断发毛癣菌、疣状毛癣菌、紫色毛癣菌和Ｃｔｅｎ…     

红色毛癣菌的基因分型研究

目的 探讨探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌的基因分型并分析其基因型与来源地区的相关性。方法 用溴化十六烷基三甲铵（CTAB）法提取DNA，以皮肤癣菌的特异性引物NS5[5′-AACTAAAGGAATTGACGGAAG-3′]与ITS4[5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′]为引物，以红色毛癣菌的标准菌株为模板，用PCR法扩增出其rDNA部分18S区，ITSI区，5.8S区和ITSⅡ区为探针，用随机引物法将探针标记^32P，用EcoRI酶切基因组DNA，采用DNA印迹的标准流程将酶切的基因组DNA与探针杂交；显示的不同带型，以此作为红色毛癣菌基因分型的依据。结果 所试49株红色毛癣菌（南京21株，大连26株，北京2株）分为20型（A-T型），其中A-C型占48.98%。南京株绝大多数为3条带，大连株大部分为4条带。结论 用ITS区域探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌基因组分型敏感性强，分辨力高；南京与大连两地区红色毛癣菌DNA分型具有明显差异，DNA分型对红色毛癣菌病的流行病学，临床疗效的判定以及指导用药均具有重要价值。     

多重PCR诊断甲真菌病的实验研究

目的初步建立多重PCR诊断甲真菌病的方法。方法选择3对引物(真菌通用引物、皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立三重PCR体系,采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性;并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果筛选得到的真菌通用引物NS、皮肤癣菌特异性引物CHS1和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性;在适宜的反应条件下,无论对单模板,还是多模板,该反应体系均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;该反应体系的检测灵敏度为102cfu/ml。结论多重PCR技术是一种快速、敏感和特异诊断甲真菌病的方法。     

多重RT-PCR诊断甲真菌病的体外模拟研究

目的:拟建立多重RT-PCR诊断甲真菌病的方法。方法:采用Trizol提取真菌的RNA;选择3对引物(真菌通用引物,皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立3重RT-PCR体系,采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性;并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果:(1)所采用的真菌通用引物28srDNA、皮肤癣菌特异性引物ACT和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性;(2)在适宜的反应条件下,无论对单模板,还是多模板,该反应体系均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;(3)该反应体系对模拟临床标本的检测灵敏度为102cfu/mL。结论:多重RT-PCR技术可在较短时间内检测出皮肤癣菌、酵母和霉菌等,并可判断菌的活力,将为临床快速诊断和及时、合理地治疗甲真菌病和其他真菌性疾病提供参考。     

应用AP-PCR进行真菌菌型鉴定的方法建立

目的 建立应用斜引物聚合酶链反应进行真菌菌型鉴定的方法。方法 用任意引物ＯＰＡＡ１１（５’－ＡＣ－ＣＣＧＡＣＣＴＧ－３’）和引物ＯＰＤ１８（５’－ＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣ－３’）对一些常见真菌进行了任意引物聚合酶链反应。结果 扩增产物电泳分析发现不同菌种间产生的ＤＮＡ带型存在明显差异。结论 ＡＰ－ＰＣＲ用来进行真菌鉴定比较可靠、稳定。     

拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的：探讨拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR～RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法：用真菌拓扑异构酶Ⅱ基因区通用引物dPsD1、dPsD2，先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR（nested PER）扩增，扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶HincⅡ和HinfⅠ酶切，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果：通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3390bp、dPsD2能扩增出2380bp的片段，而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经HincⅡ和HinfⅠ酶切后表现为58—1670bp长短不等的片段组合，根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论：拓扑异构酶Ⅱ基因区的巢式PCR—RFLP方法，是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

须癣毛癣菌基因分型的研究

目的探讨ITS区域的探针与DNA印迹杂交法对须癣毛癣菌的基因分型,并分析基因型与来源地区的相关性。方法用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)法提取DNA,以皮肤癣菌的特异性引物NS5[5-′AACTTAAAGGAATT-GACGGAAG-3′]与ITS4[5-′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′]为引物,以须癣毛癣菌的标准菌株为模板,用PCR法扩增rD-NA部分18S区、ITSⅠ区、5.8 s区和ITSⅡ区为探针,随机引物法将探针标记,EcoR1酶切基因组DNA,按ECL试剂盒标准流程将酶切的基因组DNA与探针杂交;根据杂交的不同带型而分型。结果所试35株须癣毛癣菌分为14型(A~N型),A,B,C,D四型占62.86%。南方株以A和C型为主,北方株以B和D型为主。结论用ITS区域探针与DNA印迹杂交法对须癣毛癣菌基因组分型敏感性强、分辨力较高;南北方须癣毛癣菌DNA分型存在一定差异;DNA分型对须癣毛癣菌病的流行病学调查和菌学的生物学研究具有重要价值。     

任意引物聚合酶链反应鉴定皮肤癣菌研究

目的探讨任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)和引物OPD18、OPAA11对常见皮肤癣菌进行分子水平鉴定的意义.方法用任意引物OPD18(5'-GAGAGCCAA-3')和OPAA11(5'-ACCCGACCTG-3')对常见皮肤癣菌进行AP-PCR,并对扩增产物的DNA带型进行分析.结果皮肤癣菌所试的7个菌种之间均产生具有明显差异的DNA带型.结论用AP-PCR和引物OPD18、OPAA11可对常见皮肤癣菌进行分子水平鉴定.     

某些皮肤癣菌凝集素结合形式

我们采用凝集素ＡＢＣ组织化学染色方法对１４种皮肤癣菌的凝集素糖基受体进行了检测，结果报道如下。一、材料和方法１．菌种：红色毛癣菌、须癣毛癣菌、断发毛癣菌、马类毛癣菌、犬小孢子菌、铁锈色小孢子菌、石膏样小孢子菌、絮状表皮癣菌均为本科真菌室保存菌种；紫色...     

聚合酶链反应技术检测申克孢子丝菌的实验研究

目的研究申克孢子丝菌的种特异性引物聚合酶链反应鉴定方法,从而为临床孢子丝菌病的分子诊断奠定基础。方法采用根据申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列设计合成的一对寡核苷酸引物,分别对26株申克孢子丝菌(包括1株标准株,7株实验室保存株,18株临床分离株)及6种6株普通真菌(分属于3个菌属)的基因组DNA进行PCR扩增。结果扩增产物选择性的从26株申克孢子丝菌基因组DNA中获得,而对念珠菌属、毛癣菌属、小孢子菌属的6株普通真菌基因组DNA均为阴性。结论采用以申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌特异、简便、快捷,可用于临床诊断。     

高分辨率溶解曲线在4种皮肤癣菌快速鉴定中的初步应用

目的:建立准确、快速鉴定红色毛癣菌、指(趾)间毛癣菌、犬小孢子菌、堇色毛癣菌等4种常见皮肤癣菌的高分辨率溶解曲线(HRM)的方法。方法:根据目的基因序列及参考文献合成基因扩增引物,应用4HRM方法鉴定4种常见皮肤癣菌,并利用rDNA ITS测序验证其准确性。结果:4种皮肤癣菌表现出不同的HRM曲线及Tm值,后续rDNA ITS测序证实了HRM溶解曲线鉴别不同种皮肤癣菌的准确性。结论:本研究采用PCR-HRM分析方法,获得4个常见皮肤癣菌的不同溶解曲线,可用于临床该类皮肤癣菌感染的初步鉴定。     

拓扑异构酶II基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的:探讨拓扑异构酶II基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法:用真菌拓扑异构酶II基因区通用引物dPsD1、dPsD2,先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR(nested PCR)扩增,扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶Hinc II和Hinf I酶切,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果:通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3 390 bp、dPsD2能扩增出2 380 bp的片段,而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经Hinc II和Hinf I酶切后表现为58~1 670 bp长短不等的片段组合,根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论:拓扑异构酶II基因区的巢式PCR-RFLP方法,是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

一些皮肤癣菌的脂类分解活性

皮肤癣菌能浸入表面覆盖着脂类的表皮角质层.因此,在感染的早期阶段,在真菌建立与角蛋白的持久性接触以前,皮肤癣菌的脂类分解活性可能是特别重要的.有人发现皮肤癣菌能够水解动物和植物的脂类.从组织化学上和在皮肤癣菌菌丝体的滤液里,都证明了有脂酶的存在.作者对较常见的皮肤癣菌是否存在脂酶进行了筛选.材料和方法:一、皮肤癣菌株:从病人身上分离絮状表皮癣菌、犬小芽胞菌、须疮毛癣菌和红色毛癣菌各9株,以挑选单个孢子进行繁殖.二、底     

PCR-RFLP鉴别临床常见的皮肤癣菌

目的 建立一种快速而简便的分子水平上鉴定常见皮肤癣菌的方法。方法 采用通用引物ITS1（5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘)、ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘)对7种常见皮肤癣菌的核糖体的ITS（internal transcribed spacer)区（包含5.8SrDNA)进行PCR扩增，PCR产物分别应用限制性内切酶MvaI、TaqI、HinfI酶切。结果 7种皮肤癣菌的ITS区扩增产物条带大小不同；以MvaI、TaqI、HinfI三种酶分别酶切PCR-ITS区产物，7种皮肤癣菌均产生独特且易于区分的酶切图，尤其是MvaI酶产生的酶切图在种间差异最为明显。可将7种菌明确区分开。结论 核糖体ITS区PCR-RFLP分析是区分常见皮肤癣菌的有价值的方法。     

多重聚合酶链反应用于D－K型沙眼衣原体基因分型的研究

目的摸索一套泌尿生殖道沙眼衣原体基因分型的多重聚合酶链反应法。方法选择某一型与其它各型均不同的可变区部位作为下游引物，以恒定区 1区的高度保守区作为各型的公用上游引物，优化反应条件，进行标准株和临床野生株的多重聚合酶链反应扩增，并与聚合酶链反应－限制性内切酶片段多态性方法比较。结果用摸索出的反应系统和条件，对 8个标准株进行扩增，扩增出与理论值一致的片段，并可直接在普通水平琼脂糖凝胶进行电泳。特异性检测证明：①衣原体各型之间没有非特异性交叉扩增，②对泌尿生殖道病原和寄生微生物进行扩增，未扩出任何 DNA带。对临床野生株分型结果证明：复合聚合酶链反应阳性率为 100％，而聚合酶链反应－限制性内切酶片段多态性为 94.44％。结论本套衣原体基因分型的多重聚合酶链反应法特异、敏感、快速、实用，最终能用于临床分型。