阿魏酸钠对淀粉样β蛋白致神经细胞损伤的保护作用

目的:通过检测阿魏酸钠对联合培养的神经细胞和巨噬细胞中神经细胞的乳酸脱氢酶漏出量和微管相关蛋白-2的影响,观察阿魏酸钠对淀粉样β蛋白激活巨噬细胞引起神经细胞损伤的保护作用。方法:实验于2004-05/12在锦州医学院药理实验室和解剖实验室完成。选择8～10周龄的小鼠进行巨噬细胞培养,出生两三天的大乳鼠进行神经细胞培养。单独培养的神经细胞和巨噬细胞:将加入10μmol/L淀粉样β蛋白和未加入淀粉样β蛋白的巨噬细胞上清液分别移入单独培养的神经细胞中,通过Hoechst33258染色检测神经细胞的凋亡百分比。联合培养的神经细胞和巨噬细胞:联合培养24h后,加入10μmol/L的淀粉样β蛋白,阿魏酸钠组同时加入不同浓度(10μmol/L,100μmol/L,500μmol/L,1mmol/L)阿魏酸钠共孵育。48h后,采用免疫组织化学方法和乳酸脱氢酶检测试剂盒检测微管相关蛋白-2表达水平和乳酸脱氢酶漏出量。结果:将淀粉样β蛋白激活的巨噬细胞上清液移入到单独培养的神经细胞48h后,可使凋亡神经细胞的百分比明显增加,从正常11.3%增加到74.0%,(P<0.01)。在巨噬细胞和神经细胞联合培养中,淀粉样β蛋白组与空白对照组相比,乳酸脱氢酶漏出量明显增加,由375nkat/L增加到2859nkat/L,微管相关蛋白-2表达阳性的神经元数目相应减少,与淀粉样β蛋白组相比,阿魏酸钠(10μmol/L,100μmol/L,500μmol/L,1mmol/L)能显著地降低乳酸脱氢酶漏出量,使微管相关蛋白-2表达阳性的神经细胞数目明显增加,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论:①淀粉样β蛋白是通过激活巨噬细胞,使其释放毒性物质,从而引起神经细胞的损伤。②阿魏酸钠对淀粉样β蛋白引起的神经细胞损伤具有保护作用     

中药当归主要活性成分阿魏酸钠抑制淀粉样β蛋白激活炎症因子的量剂反应

目的：观察中药当归提取的主要活性成分阿魏酸钠对淀粉样β蛋白激活的小鼠腹腔巨噬细胞α肿瘤坏死因子、诱导型一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影响。方法：实验于2004-03／10在锦州医学院药理实验室和解剖实验室完成。选择8～10周龄的小鼠36只，随机分为6组，每组6只。正常对照组：巨噬细胞接种24h后用培养基继续培养。淀粉样β蛋白组：巨噬细胞接种24h后在培养基中加入经老化处理的终浓度为10μmol/L的淀粉样β蛋白。淀粉样β蛋白＋10，100，500μmol／L，1mmol／L阿魏酸钠组：在加入淀粉样β蛋白的同时加入10，100，500μmol/L，lmmol／L的阿魏酸钠共同孵育。培养48h后采用酶联免疫吸附法、免疫组织化学方法和Griess反应分别检测肿瘤坏死因子α分泌量、诱导型一氧化氮合酶表达和一氧化氮的生成量。结果：36只小鼠均进入结果分析。①巨噬细胞的肿瘤坏死因子α分泌量：淀粉样β蛋白组明显高于正常对照组[（28154&;#177;14．85），（1755&;#177;4．84）ng／L，（P〈0．01）]。淀粉样β蛋白＋10，100，500μmol／L，1mmol／L阿魏酸钠组可以不同程度地减少由淀粉样β蛋白诱导产生的肿瘤坏死因子α的分泌量[（238．05&;#177;6．21）．（186．90&;#177;7．44），（117．55&;#177;8.08），（71．77&;#177;10．50）ng/L，P〈0．011，且有明显剂量依赖关系（P〈0．05）。②巨噬细胞的一氧化氮生成量：淀粉样口蛋白组明显高于正常对照组[（85.04&;#177;6．16），（26．10&;#177;3．25）μmol／L，（P〈0．01）]，淀粉样β蛋白＋10，100，500μmol／L，1mmol/L阿魏酸钠组可以不同程度地减少由淀粉样β蛋白诱导产生的一氧化氮的量[（69.80&;#177;4.96），（54.52&;#177;345），（43.88&;#177;4.04），（33．83&;#177;3．13）μmol／L，P〈0．011，且有明显剂量依赖关系（P〈0．05）。⑧诱导型一氧化氮合酶的表达：正常对照组只有零星细胞染色阳性；而淀粉样β蛋白组多数细胞胞浆被染成黄褐色。各剂量组的阿魏酸钠可以不同程度地抑制由淀粉样β蛋白激活巨噬细胞造成的诱导型一氧化氮合酶的表达，该抑制作用呈明显剂量依赖性。结论：①淀粉样β蛋白能激活巨噬细胞，使其分泌大量的肿瘤细胞坏死因子α和一氧化氮，诱导型一氧化氮合酶表达也相应增加。②阿魏酸钠通过其抗炎作用呈明显剂量依赖性抑制淀粉样β蛋白对巨噬细胞的激活作用，从而使巨噬细胞生成肿瘤细胞坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶、一氧化氮水平降低。     

中药当归主要活性成分阿魏酸钠抑制淀粉样β蛋白激活炎症因子的量剂反应

目的:观察中药当归提取的主要活性成分阿魏酸钠对淀粉样β蛋白激活的小鼠腹腔巨噬细胞α肿瘤坏死因子、诱导型一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影响。方法:实验于2004-03/10在锦州医学院药理实验室和解剖实验室完成。选择8～10周龄的小鼠36只,随机分为6组,每组6只。正常对照组:巨噬细胞接种24h后用培养基继续培养。淀粉样β蛋白组:巨噬细胞接种24h后在培养基中加入经老化处理的终浓度为10μmol/L的淀粉样β蛋白。淀粉样β蛋白+10,100,500μmol/L,1mmol/L阿魏酸钠组:在加入淀粉样β蛋白的同时加入10,100,500μmol/L,1mmol/L的阿魏酸钠共同孵育。培养48h后采用酶联免疫吸附法、免疫组织化学方法和Griess反应分别检测肿瘤坏死因子α分泌量、诱导型一氧化氮合酶表达和一氧化氮的生成量。结果:36只小鼠均进入结果分析。①巨噬细胞的肿瘤坏死因子α分泌量:淀粉样β蛋白组明显高于正常对照组[(281.54±14.85),(17.55±4.84)ng/L,(P<0.01)]。淀粉样β蛋白+10,100,500μmol/L,1mmol/L阿魏酸钠组可以不同程度地减少由淀粉样β蛋白诱导产生的肿瘤坏死因子α的分泌量[(238.05±6.21),(186.90±7.44),(117.55±8.08),(71.77±10.50)ng/L,P<0.01],且有明显剂量依赖关系(P<0.05)。②巨噬细胞的一氧化氮生成量:淀粉样β蛋白组明显高于正常对照组[(85.04±6.16),(26.10±3.25)μmol/L,(P<0.01)],淀粉样β蛋白+10,100,500μmol/L,1mmol/L阿魏酸钠组可以不同程度地减少由淀粉样β蛋白诱导产生的一氧化氮的量[(69.80±4.96),(54.52±3.45),(43.88±4.04),(33.83±3.13)μmol/L,P<0.01],且有明显剂量依赖关系(P<0.05)。③诱导型一氧化氮合酶的表达:正常对照组只有零星细胞染色阳性;而淀粉样β蛋白组多数细胞胞浆被染成黄褐色。各剂量组的阿魏酸钠可以不同程度地抑制由淀粉样β蛋白激活巨噬细胞造成的诱导型一氧化氮合酶的表达,该抑制作用呈明显剂量依赖性。结论:①淀粉样β蛋白能激活巨噬细胞,使其分泌大量的肿瘤细胞坏死因子α和一氧化氮,诱导型一氧化氮合酶表达也相应增加。②阿魏酸钠通过其抗炎作用呈明显剂量依赖性抑制淀粉样β蛋白对巨噬细胞的激活作用,从而使巨噬细胞生成肿瘤细胞坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶、一氧化氮水平降低。     

何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用的机制

目的：观察2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙对两种拟痴呆细胞模型的作用，探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯甙神经保护作用的机制。为阐明何首乌及以其为主要成分的中药复方的功效机制提供实验依据。方法：不同浓度二苯乙烯甙(5～400μmol／L)分别与SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞共孵育6，24h，加人工具药β-amyloid25-35(终浓度25μmol／L)孵育24h或500μmol／L过氧化氢孵育2h。MTT法测定细胞存活率，细胞膜损伤测定乳酸脱氢酶漏出率(LDH％)。结果：①50～400μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h可明显拮抗β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降，随剂量增加，保护作用上升，至200μmol／L保护作用最强。200，400μmol／L二苯乙烯甙能拮抗β-amyloid25-35引起的细胞乳酸脱氢酶漏出率增高。5～200μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，可使β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降恢复正常。200μmol／L二苯乙烯甙使β-amyloid25-35引起的细胞LDH％增多恢复正常。②5μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h，即可明显拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH％增多[LDH％：(62．47&;#177;2．43)％；MTT(A)：0.1093&;#177;0.0074]，至200μmol／L保护作用最强[LDH％：(46．10&;#177;2．10)％；MTT(A)：0.2487&;#177;0.0283]。二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，5～400μmol／L二苯乙烯甙均能拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH%增多(P&;lt;0.05)，呈明显剂量依赖关系，且各浓度保护作用均较药物预孵育6h增加，200μmol／L二苯乙烯甙组细胞存活率及LDH％基本恢复正常。结论：二苯乙烯甙对β-淀粉样蛋白和过氧化氢致神经细胞存活率下降及乳酸脱氢酶漏出增多有明显拮抗作用。二苯乙烯甙作为何首乌的主要有效成分对老年性痴呆等神经系统退性行疾病的防治有良好应用前景。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景：在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的：探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位：解放军总医院南楼神经科。设计：随机设计。材料：实验于2002-05／2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法：P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液，在胶原被覆的25cm^2培养瓶中接种5mL细胞悬液，培养24h后，分别加50μmol／L、100μmol／L奥氮平培养24h，再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35（0．01μmol／L．2μmol／L、20μmol／L）培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡，采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm^2培养瓶中的PC12细胞，应用Western blot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标：细胞存活率的测定，PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果：①细胞存活率比较：淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75％降低到35％；50μmol／L、100μmol／L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响：0．01μmol／L，2μmol／L,20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加，50μmol／L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响：0．001μmol／L、0．01μmol／L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化，50μmol／L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响；2μmol／L、20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高，50μmol／L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论：①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达，提高PC12细胞存活的保护作用。     

淀粉样β蛋A对小胶质细胞活化作用的体外观察

目的：观察淀粉样β蛋白对小胶质细胞活性、形态学以及分泌炎性细胞因子的作用，为阿尔茨海默病的炎性反应机制及抗炎治疗提供体外依据。方法：实验于2003—03／2004—03在解放军总医院老年医学研究所进行。应用BV-2胞作为体外小胶质细胞模型，加入不同浓度淀粉样β蛋白25-35或1-42（5，10，20，40，60μmol／L）及20μmol／L不同孵育状态（37℃孵育3，6，12，24h、3，5和7d）的淀粉样β蛋白25～35或1-42分别培养2—24h。四唑盐法检测淀粉样β蛋白对细胞活性的影响，倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变，并应用放射免疫法测定加入淀粉样β蛋白后BV-2胞上清白细胞介素1β及白细胞介素6水平。结果：①细胞活性：淀粉样β蛋白对BV-2胞的生存活性没有影响（P均〉0．05）。②细胞形态学改变：在较低浓度时（5—10μmol／L）淀粉样β蛋白1-42就可以使BV-2胞出现明显的形态学改变（多数细胞聚集成团，有的胞体变得肥大，胞核大而圆，核仁明显；有的胞体变为梭形，由胞体伸出一个或多个较长的枝状突起），与淀粉样β蛋白1-42孵育状态有关（37℃孵育5-7d时最为明显），而淀粉样β蛋白25—35无此作用。⑨白细胞介素1β平：淀粉样β蛋白1β水平：淀粉样β蛋白1-42与25～35均可以刺激BV-2胞分泌，二者作用类似。20μmol／L淀粉样β蛋白作用6h后其水平升高，至12h达到高峰，约为对照组的3倍，此后逐渐下降（P〈0．01）。当不同浓度淀粉样β蛋白作用12h时，淀粉样β蛋白为20μmol／L时在上清中可以检测到白细胞介素1β显增加，此后随着浓度的增加其分泌也逐渐增加，至60μmol／L时为对照组的5倍（P〈0．01）。④白细胞介素6水平：各淀粉样β蛋白处理组细胞上清液均不能检测到其水平有明显变化。结论：淀粉样β蛋白对BV-2胞的生存活性没有影响，淀粉样β蛋白可以激活BV-2胞发生形态学改变并释放炎性细胞因子，但二者的作用途径不同，形态学改变与淀粉样β蛋白片段及聚集状态均有关；而分泌白细胞介素1β淀粉样β蛋白片段及聚集状态均无关，并且这种刺激作用具有时间以及浓度依赖性。     

复智散对神经细胞胞体面积和轴突长度变化的影响

背景：自制中药复智散经已往的实验证实可延缓大鼠的自然老化过程，提示该药可能具有对抗衰老作用。目的：观察复智散培养神经细胞最佳有效浓度对神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞形态学改变的影响设计：重复测量设计。材料：实验于2002-06／2003-04在前都医科大学宣武医院北京脑老化重点实验室完成。自制中药复智散（菖蒲、远至等6味中药组成）由哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科王德生教授和上海东方医院神经科徐晓云教授共同组方，淀粉样β蛋白25—35片段，SH-SY5Y神经母细胞瘤株。方法：用不同浓度的复智散孵育神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞，利用噻唑蓝比色法测定细胞存活率，制定量一效关系曲线，寻找最佳药物浓度；6孔板培养细胞分为正常对照组、淀粉样β蛋白25—3525μmol／L组、淀粉样β蛋白25～3525μmol／L ＋复智散45&;#215;10^-3g／L组和复智散45&;#215;10^-3g／L组，孵育24h，观察细胞形态学改变，测定神经细胞的胞体面积和轴突长度主要观察指标：①各组SH-SY5Y细胞噻唑蓝代谢率的变化。②各组神经细胞胞体面积及轴突长度。结果：①复智散可增进SH-SY5Y细胞的存活，最佳有效浓度为45&;#215;10^-3g／L。②SH-SY5Y细胞胞体面积和轴突长度：淀粉样β蛋白25-3525μmol／L组明显低于正常对照组[（505．5&;#177;122．36），（599．8&;#177;141．25）μm^2；（26．0&;#177;13．97），（363&;#177;15．58）μm，（t=3．903,3．447,P=0．000）]。复智散45&;#215;10^-3g／L组与淀粉样β蛋白25—3525μmol／L＋复智散45&;#215;10^-3 g／L组均明显高于淀粉样β蛋白25—3525μmol／L组[（918．3&;#177;178．34），（896．6&;#177;257．14），（505．5&;#177;122．36）μm^2；（968&;#177;43．31），（88．3&;#177;30．23），（26．0&;#177;13．97）μm．t=10．922，14．172，P=0．000）1。结论：在淀粉样β蛋白25—35损伤条件下复智散依旧有促进培养神经细胞存活的作用，表现在增进细胞胞体面积的增长和轴突的延伸方面。     

短肽N328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响

目的：分析淀粉样β蛋白前体蛋白N端328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，在体外寻找具有神经营养作用、促进神经细胞生长的最适浓度，为进一步细胞损伤的保护及药物体内研究提供理论依据。方法：细胞分组：根据实验目的不同，分组处理如下：第一步分为对照组、短肽N328—3322．5，5，10，20，40，80，160μmol／L组。第二步分为对照组、短肽N328—33240μmol／L组。以MTT代谢率测定细胞存活率以筛选肽对神经细胞生长促进的最佳有效浓度。以MTT代谢率测定细胞存活率、细胞计数观察细胞增长情况、乳酸脱氢酶漏出率观察细胞死亡率和WesternBlotting检测P-CREB、Bcl-2表达水平为观察指标，分析短肽N328—332对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响。结果：①从10μmoL／L起，短肽N328—332即对SY5Y细胞生长有促进作用，其最小有效浓度为20μmol／L，40μmol／L促进作用最强，80μmol／L开始作用减弱，故选用40μmol／L浓度作为以下试验浓度。（9短肽N328—33240μmol／L加药组代表细胞存话率的A值高于对照组，组问比较差异有显著性意义（0．9741&;#177;0．0047，0．6001&;#177;0．0019，P〈0．01。⑧短肽N328—33240μmmoL／L加药组乳酸脱氢酶漏出率明显低于对照组，组间比较差异有显著性意义（84．9135&;#177;31．5759，199．6252&;#177;40．7273，P〈0．01。④从接种第4天始，短肽N328—332组SY5Y细胞数增加，与对照组相比，差异有显著性意义（P〈0．05）。⑤短肽N328—33240μmol／L组P-CREB、Bcl-2蛋白表达高于对照组（37424．08&;#177;83．59，34957．24&;#177;78．03，19110．24&;#177;45．80，2761．36&;#177;58．61，P〈0．05）。结论：短肽N328—332对SY5Y细胞具有神经营养作用，40μmol／L浓度，效果优于其他浓度。     

依达拉奉对淀粉样β蛋白25～35致PC12细胞氧化损伤的神经保护作用

目的：观察特异性清除羟自由基的神经保护剂依达拉奉对淀粉样β蛋白25-35诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法：实验于2005-03／07在吉林大学中日联谊医院神经内科进行。将培养的PC12细胞分为3组：①正常对照组：加入含体积分数0．25的胎牛血清的DMEM维持液培养。②依达拉奉预处理组：加入依达拉奉20μmol／L预处理12h，然后加入淀粉样β蛋白25～35 30μmol／L继续孵育24h。③淀粉样B蛋白25～35干预组：淀粉样β蛋白25～35 30μmol／L孵育24h。采用MTT法测定细胞生存率；采用ELISA法测定羰基蛋白和晚期糖基化终产物的含量；硫代巴比妥酸法测定丙二醛的浓度。结果：①3组细胞生存率比较：正常对照组为（100．0&;#177;5.7）％，依达拉奉预处理组显著高于淀粉样β蛋白25～35干预组[（86．4&;#177;17．7炀，（42．5&;#177;9．4）％，P〈0．001]。②3组细胞内羰基蛋白含量比较：正常对照组为（0．35&;#177;0．09）μmol／g，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[（0．41&;#177;0．12），（0．81&;#177;0．17）μmol／g，P〈0.01]。③3组晚期糖基化终产物水平比较：正常对照组为（12．21&;#177;3．26）mg／L，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25-35干预组[（14.65&;#177;4．25），（26．57&;#177;5，18）mg／L，P〈0．01]。④丙二醛浓度：正常对照组为（4．11&;#177;0．98）μmol／L，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[（4．92&;#177;1．30），（7.58&;#177;1．01）μmol／L，P〈0.01]。结论：依达拉奉能够减少淀粉样β蛋白25～35对PC12细胞内蛋白质氧化产物、晚期糖基化终产物及脂氧化终末产物的生成，具有神经保护作用。     

脑损伤保护作用的基础研究：神经元兴奋性氨基酸损伤保护模型的建立

目的：建立体外培养神经细胞N-甲基-D-天冬氨酸(N．methyl-D-aspartate，NMDA)损伤及地佐环平(MK-801)保护作用模型。方法：采用原代培养的大鼠皮质神经细胞模型，给予NMDA直接损伤，加入MK-801，在不同时间窗测定不同剂量时神经细胞损伤的形态学，及生化改变。结果：NMDA 100μmol／L组细胞死亡率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率分别为(54．30&;#177;3．79)％，(67．13&;#177;5．90)％，NMDA的损伤作用具有明显的浓度时间依赖性，至NMDA 1000μmol／L组细胞死亡率和LDH漏出率分别为(97．74&;#177;7．28)％，(94．10&;#177;6．31)％，MK-801具有明显的保护作用。结论：NMDA和其拮抗剂MK-801具有明显的剂量和时间依赖损伤和保护作用，LDH测定是检测其变化的良好指标，此实验可以作为神经元兴奋性氨基酸毒性损伤保护因素的检验模型。