骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。     

兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究

目的：完善兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）体外扩增培养体系并观测其特性。方法：兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养，光镜、透射电镜观察所获细胞形态，流式细胞术检测细胞周期，体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果：原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的长梭形成纤维细胞样细胞，传代细胞具有类似的生长规律；透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力；细胞周期分析显示87％以上细胞处于G0／G1期；MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结论：利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs，所获细胞具备成体干细胞特性，于体外可大量扩增，做为种子细胞和载体细胞满足实验需要。     

造血干细胞移植预处理对人骨髓间充质干细胞的影响及机制研究

目的:研究造血干细胞移植(HSCT)前的预处理对HSCT患者骨髓间充质干细胞(MSCs)的影响并探讨其机制。方法:原代MSCs克隆培养集落形成单位(CFU-F),对比检测14例正常人和12例恶性肿瘤(恶性淋巴瘤9例、乳腺癌2例、小细胞肺癌1例)HSCT前后骨髓中的MSCs数量;传代培养测定细胞生长曲线,计算细胞倍增时间;流式细胞术测定细胞增殖周期和CD45、CD34、CD44表达。结果:骨髓CFU-F正常人为(29.7±14.1)/1×106MNCs;移植前为(29.3±16.2)/1×106MNCs,移植后为(8.4±3.7)/1×106MNCs,移植前与正常人比较无显著性差异,移植后明显少于正常人和移植前(P<0.01)。MSCs免疫表型为CD34-、CD45-、CD44+;指数增长期MSCs平均倍增时间均约为30h;细胞周期分析显示,正常人、移植前后MSCs的S+G2+M期细胞比例分别为18.2%、17.9%和18.7%,三组比较均无显著性差异。结论:HSCT前预处理对骨髓MSCs有损伤作用,其机理可能是使MSCs细胞数量减少,但不影响其细胞增殖特性。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性

从人骨髓中分离人间充质干细胞（ＭＳＣｓ）,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态,ＭＴＴ实验检测不同细胞因子对细胞增殖的影响。应用流式细胞学技术测定细胞周期及细胞表面抗原特征并观察细胞组织化学特点。结果：ＭＳＣｃ具有独特的表征,即ＣＤ２９,ＣＤ４４,ＣＤ１６６阳性,ＣＤ３４,ＣＤ４５,ＨＬＡ－ＤＲ和荆豆素阴性。细胞化学结果显示,几乎所有细胞酸性萘酚醋酸酯酶（ＡＮＡＥ）及糖原（ＰＡＳ反应）阳性,酸性磷酸酶（Ａ     

人胚胎骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的：摸索分离和鉴定高纯度的人胚胎骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法，分离含有间充质干细胞的人胚胎骨髓细胞悬液，获得人胚胎骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果：获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达85％。结论：密度梯度离心法分离获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高。     

骨髓间充质干细胞的免疫逃逸机制

间充质干细胞的自我更新和体外扩增的能力及其多向分化的潜能已经被广泛认识。近来的研究表明间充质干细胞避免了在人和动物体内的异体移植排斥反应的发生,这一点在体外研究的共培养中也得到证实。其作用机制有：（1）间充质干细胞的低免疫原性;（2）这些干细胞通过间接调节树突细胞和直接破坏NK细胞阻止T细胞的反应;（3）减低了局部微环境中的免疫性。笔者现对间充质干细胞的免疫调节机制予以综述如下。     

骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究进展

目前,溶栓和神经保护治疗的进展将脑梗死的治疗推进到一个新时代。但是大部分患者在治疗后仍遗留有瘫痪、失语等严重残疾。近年来应用间充质干细胞（MSC）治疗脑梗死越来越被人们所关注。本文就间充质干细胞在治疗脑梗死方面的研究现状作如下综述。     

骨髓间充质干细胞的应用研究进展

间充质干细胞 (ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞 ,主要存在于全身结缔组织和器官间质中 ,以骨髓组织中含量最为丰富 ,胎儿脐血中亦可分离得到[1 ] 。在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力 ;同时 ,ＭＳＣ还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化[2 5] 。这似乎突破了ＭＳＣ仅为中胚层干细胞的概念 ,展示了ＭＳＣ具有更为重要的理论研究意义和更为广阔的应用前景。笔者就近年来骨髓间充质干细…     

骨髓间充质干细胞生物学特性及其在血液学的应用

近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的快速发展，干细胞的研究和应用成为生命科学的热点。干细胞（stemcell，sc）是一种具有自我更新（self-renew）能力和多向分化（muhilneage differentiation）潜能的未分化细胞，根据其分化潜能的大小，可分为：①全能干细胞（totipotent stem cells，TSCs），即受精卵；②胚胎干细胞（plurlpotent stem cells or rembryonic stem cells，ESCs），可生成除胎盘外机体所有的组织细胞；     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

Ad-GFP修饰MSCs静脉移植在严重烫伤延迟复苏大鼠体内的定向迁移

目的:观察携带目的基因的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 静脉移植在严重烫伤延迟复苏损伤体内的分布.方法:分离培养MSCs,用Ad-GFP转染MSCs,25只Wistar大鼠随机分为延迟复苏组(A组,10只)、即时复苏组(B组,10只)、假伤组(C组,5只).A、B两组大鼠背部造成Ⅲ度30%烫伤,制备A组为延迟复苏模型,B组为即时复苏模型,同时制备C组为假伤模型,经股静脉移植转染Ad-GFP 48 h后的MSCs.24 h,7 d后取小肠、肝脏、肾脏、烫伤皮肤创缘等组织,快速冰冻切片,荧光显微镜下观察在体内的分布.结果:MSCs 体外分离培养扩增5代,细胞数可达(1～2)×1011个,具有多态性和贴壁生长特性,MOI=100时,Ad-GFP转染MSCs效率可达86.4%.经股静脉移植24 h,在延迟复苏组烫伤皮肤组织创缘,小肠黏膜广泛可见绿色荧光,而在肝、肺等器官少见,即时复苏组荧光以烫伤皮肤创缘分布为主,小肠黏膜较少,假伤组中绿色荧光分布以肝脏为主.延迟复苏组小肠荧光强度明显强于即时复苏组和假伤组(P《0.05),而延迟和即时复苏组皮肤创缘荧光强度又强于假伤组(P《0.05).结论:导入目的基因可能不会改变MSCs归巢特性,并将为后续启动基因治疗烧伤延迟复苏后的损伤研究提供参考.     

骨髓间充质干细胞条件培养基对INS-1细胞凋亡的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞条件培养基(BMSC-CM)对促炎因子诱导大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)凋亡的影响及其作用机制.方法 培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)至第3代,收集、浓缩其上清液,获得富含BMSCs分泌因子的条件培养基.用含促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的培养基处理INS-1细胞48h,造成炎症损伤β细胞模型,加入不同浓度的BMSC-CM继续培养12h,所获细胞分为以下5组:正常对照组,促炎因子组,1×BMSC-CM组,2×BMSC-CM组,4× BMSC-CM组.采用CCK-8法检测INS-1细胞存活率,膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)检测细胞凋亡率,二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成量.结果 与正常对照组相比,促炎因子组INS-1细胞存活率下降至正常对照组的75.84％±1.53％,细胞凋亡率增加(17.23％±1.77％),细胞内ROS水平明显升高(34.3％±0.80％),差异均具有统计学意义(P＜0.01).而BMSC-CM有效对抗了促炎因子导致的INS-1细胞损伤,其作用呈剂量依赖性,4×BMSC-CM组效果最佳,该组INS-1细胞存活率较促炎因子组升高了11.86％,达到87.7％±2.08％,细胞凋亡率下降至8.67％±1.59％,ROS生成量减少至17.1％±2.14％,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 BMSC-CM可抑制促炎因子诱导的INS-1细胞凋亡,其作用机制可能与BMSC-CM降低细胞内ROS水平有关.     

经体外预处理人胎儿骨髓间充质干细胞的潜在自身成瘤性

目的评价经体外预处理、启动免疫保护功能的人胎儿骨髓间充质干细胞（hfBMSCs）的潜在自身成瘤性。方法采用流式细胞术检测细胞表型及细胞周期,染色体核型分析检测遗传稳定性,裸鼠皮下接种检测体内成瘤性。结果体外预处理的hfBMSCs呈正常间充质干细胞表型,可通过阻滞细胞周期于G0-G1期抑制hfBMSCs生长增殖（P〈0.05）,对染色体核型无影响,不具备体内成瘤性。结论经体外预处理的人胎儿骨髓间充质干细胞不具有自身成瘤性。     

HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用

目的：探讨HGF基因在间充质干细胞（mesenehymal stem cell，MSC）中过表达对细胞生物学的影响，为扩充MSC临床应用范围提供依据。方法：用携带HGF基因的重组腺病毒感染人骨髓来源的间充质干细胞后。与对照细胞相比，进行以下项目的检测：FCM测定细胞表型；MTT法测定细胞增殖能力；ALP和钙定量以及组织化学染色检测细胞体外成骨和成脂肪能力；^3H—TdR掺入法测定MSC—HGF对混合淋巴细胞反应中效应细胞增殖活性的抑制作用。结果：HGF基因转染后MSC表型、体外增殖和分化能力无改变；混合淋巴细胞反应中，MSC—HGF对异基因抗原诱导的淋巴细胞增殖活性的抑制效应存在剂量依赖关系；MSC—HGF／MSC与效应细胞比例为1：80时，MSC组淋巴细胞增殖活性（cpm值）降低19．8％，MSC—HGF组降低68．3％，抑制率是MSC组的3．45倍。结论：HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持固有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，提示MSC—HGF在造血干细胞移植和器官移植中的潜在应用价值。     

人羊水来源MSC的分离培养鉴定及其免疫抑制特性的初步研究

目的：体外分离培养鉴定具有间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）特征的人羊水来源细胞,并对其免疫抑制特性进行初步评价。方法：贴壁法体外分离培养人羊水来源细胞,多次传代扩增后,采用形态学观察、流式细胞术分析表型以及定向诱导分化为脂肪样细胞、成骨样细胞等方法进行鉴定后,以细胞计数试剂盒（cellcounting kit-8,CCK-8）体外检测人羊水来源间充质干细胞（amniotic fluid derived-mesenchymal stem cells,AFMSC）对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,并对其时效、量效关系进行分析。结果：具备MSC形态、表型及分化潜能特征的人羊水来源细胞,可于体外显著抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖（P〈0．05）,时效、量效关系显著（P〈0．05）。结论：从免疫抑制特性角度证明羊水可成为替代骨髓的MSC新来源。     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达，而没有Coilagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后98.39％的细胞呈CD44^ 、HLA-DR^-。结论BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）分离纯化及培养扩增的方法。方法：利用Ｐｅｒｃｏｌｌ（１．０７３ｇ／ｍｌ）及Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ）两种分离介质分离骨髓单个核细胞,筛选体外培养ＭＳＣｓ适宜的血清及浓度,通过流式细胞术分析鉴定ＭＳＣｓ的纯度。结果：经Ｐｅｒｃｏｌｌ分离,应用１０％筛选出的血清培养与扩增的ＭＳＣｓ,细胞纯度可达９５％左右;相反,应用常规Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离骨髓单个核细胞或增加血清浓度,ＭＳＣｓ纯度显著下降。结论：建立了一种稳定而实用的体外分离与培养ＭＳＣｓ的方法。     

人脐带源和胎盘源间充质干细胞的生物学特性比较

目的：探讨人脐带和胎盘来源间充质干细胞（ MSCs）的分离培养和生物学性状的差异,为MSCs的临床应用提供选择依据。方法利用组织贴壁法分离培养脐带MSCs,酶消化法分离培养胎盘MSCs。传代培养后于倒置显微镜下观察两种不同来源的MSCs的细胞形态,流式细胞仪检测两者表面标志物表达的差异,通过细胞周期和群体倍增时间测定比较两者生长增殖能力,体外成骨和成脂诱导比较其分化能力。结果胎盘MSCs和脐带MSCs为贴壁生长、形态均一的成纤维样或长梭形外观,两种细胞均高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。胎盘MSCs的群体倍增时间为40．8 h,52．12％处于G0／G1期,脐带MSCs的群体倍增时间为39．5 h,57．50％处于G0／G1期,表明两者增殖能力旺盛,且无明显差异;两者在体外均可诱导分化成骨细胞和脂肪细胞。结论胎盘源MSCs具有与脐带源MSCs相似的生物学特性,两者均可作为临床治疗用细胞或组织工程的种子细胞。