不同浓度破骨细胞分化因子和巨噬细胞集落刺激因子体外诱导大鼠破骨样细胞形成的研究

目的探讨破骨细胞分化因子和巨噬细胞集落刺激因子在大鼠破骨样细胞形成、分化中的作用,为进一步研究正畸牙齿移动的生物力学机制奠定基础。方法应用不同浓度的破骨细胞分化因子和巨噬细胞集落刺激因子对提取的SD大鼠骨髓单个核细胞进行诱导培养,分别于培养1、3、5、7 d利用TRAP染色、骨吸收陷窝检测等对单核及多核破骨样细胞的生成进行鉴定,对TRAP(+)的细胞进行计数和统计学分析。结果巨噬细胞集落刺激因子和破骨细胞分化因子对TRAP(+)的单核及多核破骨样细胞的诱导分化作用与时间有关:第3 d时逐渐增多,以第5 d和第7 d为最多;缺乏巨噬细胞集落刺激因子时,骨髓单个核细胞不能有效地分化为TRAP(+)的细胞;在破骨细胞分化因子浓度一定的条件下(50 ng/ml),TRAP(+)的细胞数与巨噬细胞集落刺激因子的浓度有关,当其浓度超过30 ng/ml时,TRAP(+)细胞数不再显著增加,曲线趋于平缓;当巨噬细胞集落刺激因子浓度一定的条件(50 ng/ml)下,TRAP(+)的细胞数与破骨细胞分化因子的浓度无关。结论以巨噬细胞集落刺激因子和破骨细胞分化因子作为诱导因子,对大鼠骨髓单个核细胞进行诱导培养,可获得TRAP(+)吸收陷窝(+)的破骨样细胞,且巨噬细胞集落刺激因子30 ng/ml、破骨细胞分化因子50 ng/ml时具有最强的生物学效应。     

巨噬细胞集落刺激因子对体外培养人牙囊细胞破骨细胞分化因子表达的影响

目的：研究巨噬细胞集落刺激因子对体外培养的人牙囊细胞破骨细胞分化因子（RANKL）mRNA表达的影响。方法：原代培养人牙囊细胞，传至第3代，制备细胞爬片，进行RANKL免疫组化染色；选取生长状态良好的第3-6代人牙囊细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，培养基中分别加入25ng／mL的巨噬细胞集落刺激因子，共同孵育0．5、1、3、6、12h，提取总RNA进行RT-PCR，灰度值半定量分析RANKL mRNA的变化。结果：正常人牙囊细胞RANKL蛋白表达阳性；25ng／mL的巨噬细胞集落刺激因子可升高人牙囊细胞RANKL的表达；共同孵育3h，RANKL表达最高。结论：巨噬细胞集落刺激因子对体外培养的人牙囊细胞表达RANKL，具有正向调节作用。     

转化生长因子β对体外破骨细胞分化的影响

目的:研究在核因子κB受体活化因子配基(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)联合应用诱导体外骨髓细胞培养系统中,转化生长因子(TGF-β)对破骨细胞分化的影响。方法:选用小鼠M-CSF依赖性非附着性骨髓细胞,在含有25 ng/m l sM-CSF和30 ng/m l sRANKL的α-MEM培养液中进行培养,比较加入和不加入1 ng/m lTGF-β1培养4、9 d后,所形成的抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)阳性多核细胞的数目和骨吸收面积。结果:小鼠骨髓细胞在RANKL和M-CSF共同作用下可形成TRAP阳性多核巨细胞,并具有骨吸收功能。加入TGF-β后,破骨样细胞的数目及骨吸收面积显著增加。结论:TGF-β对RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞的分化及其功能的促进作用,可能为炎症状态下发生过度骨吸收的机制之一。     

破骨细胞分化因子诱导小鼠骨髓细胞形成破骨细胞的实验研究

目的:探讨破骨细胞分化因子(ODF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)联合应用进行体外诱导小鼠骨髓细胞形成破骨细胞(OC)的能力。方法:收集5～6周小鼠骨髓细胞,在含M-CSF(10 ng/ml)的α-MEM全培养液中培养24h,然后将悬浮生长的细胞接种到24孔培养板,并加入不同浓度的ODF和M-CSF。,通过观察抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色的阳性细胞和能否在骨磨片上形成吸收陷窝来鉴定OC形成情况。结果:在只加入ODF或M-CSF一种细胞因子时,未见有TRAP阳性或CTR阳性细胞形成,同时加入ODF和M-CSF,可形成典型的OC。TRAP阳性多核细胞的数目和培养液中钙离子浓度的增加与ODF的浓度呈正相关。结论:小鼠骨髓来源的单核细胞在ODF和M-CSF共同作用下可形成具有骨吸收功能的OC,为体外研究OC的分化发育和功能调节提供了一种新的方法。     

体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞表型特征的研究

目的 对体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞的表型特征进行研究探讨。方法 组织块 法培养人牙周膜细胞,放射免疫法检测条件培养基中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣＮ）的分泌活性,免疫 组化法检测非分泌型的ＡＬＰ和ＯＣＮ的表达,原位杂交方法检测二者的ｍＲＮＡ水平的表达。结果 人牙 周膜细胞具有成骨细胞的部分表型,碱性磷酸酶在蛋白水平包括分泌和非分泌型及基因转录水平都有一 定的表达,随培养时间的变化不大;而不具有成熟的成骨细胞的表型特征——骨钙素的表达,其无论是在 基因和蛋白水平都没有表达二这一结果为进一步研究人牙周膜细胞在机械力作用下参与骨改建打下基础。     

小鼠骨髓细胞和脾细胞诱导形成破骨细胞潜能的比较

目的在体外破骨细胞分化因子(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)联合应用的情况下,比较小鼠骨髓细胞和脾细胞形成破骨细胞的能力。方法选用小鼠M-CSF依赖性非附着性骨髓细胞和脾细胞,以不同的细胞密度在含有25ng/mlsM-CSF和30ng/mlsRANKL的(-MEM培养液中培养5、9天后,计数形成的抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)阳性多核细胞的数目和骨吸收面积。结果脾细胞形成的破骨样细胞与骨髓形成的细胞形态与功能均无明显差异,但所需的细胞密度为骨髓细胞的10~20倍。结论在特殊情况下,脾细胞可替代骨髓细胞进行体外破骨细胞实验,但培养条件应适当调整。     

体外培养破骨样细胞OPG的表达

目的:观察体外培养破骨样细胞过程中骨保护素(osteoprotegerin OPG)的表达,探讨其与破骨细胞(Os-teoclasts,OC)功能的相关性。方法:应用l,25(OH)2D3 巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF) 核因子-kB受体活化剂配体(Receptor activator of NF-kB ligand,RANKL)体外诱导人外周血单个核细胞(Periph-eral blood mononuclear cell,PBMC),培养人破骨细胞样细胞(Osteoclast-like cell,OLC),用抗酒石酸酸性磷酸酶(tar-trate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色进行鉴定,并采用免疫组织化学的方法检测OPG的表达。结果:实验组可见OPG的阳性表达。结论:OPG可能直接作用于破骨细胞,负调节其分化与增殖。     

双因子对体外培养大鼠破骨细胞的诱导作用

目的：研究两种诱导因子复合作用对大鼠破骨细胞体外形成的影响。方法：采用大鼠脾细胞和骨细胞联合培养，实验组分别加入1，25(OH)2D3 M—CSF、1，25(OH)2D3 PTH、1，25(OH)2D3 PGE2、1，25(OH)2D3 IL—1β，并设1，25(OH)2D3单因子对照组和空白对照组，采用TRAP染色、扫描电镜等方法观察破骨细胞形成情况。结果：第5d实验组单核细胞出现融合趋势，TRAP染色阳性，以1，25(OH)2D3 M—CSF和1，25(OH)2D3 PTH组破骨细胞形成数量最多。结论：双因子联用诱导体外大鼠破骨细胞形成的作用优于单因子。     

破骨细胞分化因子和破骨细胞生长抑制因子在牙周组织细胞中的表达

目的:检测炎症前细胞因子IL- 1β和骨成熟因子PGE2 对人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor,ODF)和破骨细胞生长抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)表达的影响.方法:用RT- PCR和Southern- blot对该2 种细胞在IL- 1β或PGE2作用下细胞中ODF和OCIF mRNA的表达进行半定量.结果:上述2 种细胞在IL- 1β或PGE2作用下,ODF和OCIF的合成均有升高,各细胞合成ODF和OCIF的峰值随IL- 1β或PGE2作用时间和浓度的不同而发生变化.结论:牙周组织中ODF和OCIF可能同时参与炎症反应,并受致炎因子IL- 1β和骨代谢因子PGE2调节.     

大鼠颌下腺肌上皮分化的研究

目的 :观察组织块原代培养法是否可用于涎腺肌上皮细胞发育分化的研究 ,并探讨肌上皮细胞的组织发生。方法 :采用组织块原代培养法 ,通过相差显微镜、透射电镜及免疫组化染色等检测手段 ,对不同时期大鼠颌下腺肌上皮细胞进行研究。结果 :肌上皮样细胞及含有分泌颗粒的分泌细胞见于体外培养第 3d。肌微丝及Actin阳性细胞分别最早出现于培养第 6d和 7d。此结果与体内研究结果相一致。结论 :肌上皮细胞可能来源于上皮干细胞 ;体外组织块培养方法亦适用于细胞分化研究。     

人牙周韧带细胞和牙髓细胞表型特征的比较

目的研究人牙周韧带细胞（PDLCs）和牙髓细胞（DPCs）表型特征以及体外传代对其表型特征的影响,为选择适宜的表面标记分选生物性状同源性的细胞亚群提供依据。方法采用酶消化法体外培养PDLCs和DPCs,免疫组化检测和流式细胞仪分析细胞表面标记的表达。结果PDLCs和DPCs的STRO-1和CD146免疫组化染色阳性。流式细胞仪分析显示：获得的第1代PDLCs和DPCs表达间充质干细胞表面标记STRO-1、CD146、CD29、CD44和CD106,基本不表达CD34。PDLCs的STRO-1、CD29和CD44阳性表达百分比与DPCs间的差异无统计学意义（P>0.05）,PDLCs的CD106阳性表达百分比高于DPCs,CD146阳性表达百分比低于DPCs,且差异有统计学意义（P<0.001）。PDLCs和DPCs表达STRO-1和CD146的阳性表达百分比随传代而逐渐减低。结论PDLCs表面抗原表达与DPCs相似,而且其中成体干细胞的成分随传代逐渐减少。     

不同培养条件下牙周韧带细胞矿化能力的比较研究

目的：探讨牙周韧带细胞体外常规状态及矿化诱导下钙化特性的差异。方法：用组织块培养法进行人牙周韧带细胞的原代培养，取第4代细胞用于实验，在体外长期培养，条件培养组加入矿化诱导液，常规培养组不加任何矿化诱导因素，倒置显微镜下观察矿化情况，茜素红与Von-Kossa染色显示钙盐沉积。结果：牙周韧带细胞在体外长期培养过程中，两组均表现为融合期、复层期、结节期、矿化期，形成肉眼可见的白色结节，茜素红与Von-Kossa染色均显示结节内有钙盐沉积。但常规培养组矿化所需的时间要比条件培养组长1周左右。结论：牙周韧带细胞在体外长期培养过程中，无论有无矿化诱导因素存在，均具有向矿化组织形成细胞分化的趋势，但矿化诱导因素的存在可以促进矿化结节的早期形成。     

人牙囊细胞的体外分离、培养及表型鉴定

目的 :建立人牙囊细胞 (dentalfolliclecells ,DFCs)的体外培养方法 ,为牙周组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法 :分离人 8月龄胚胎下颌磨牙牙胚 ,胰酶消化后分离牙囊组织 ,采用胶原酶消化法和组织块法相结合原代培养人牙囊细胞 ,利用牙囊细胞和上皮根鞘细胞对胰酶的耐受性差别分离纯化 ,通过倒置显微镜及HE染色观察细胞形态及生长状况、透射电镜观察细胞的超微结构 ;采用免疫组化波形丝蛋白 (vimemtin ,Vim)、角蛋白(cytokeration ,CK)、Ⅰ型胶原 (typeⅠcollagen ,ColⅠ )、Ⅲ型胶原 (typeⅢcollagen ,ColⅢ )、纤维连接蛋白 (fibronectin ,FN)和早期矿化相关的标志骨桥蛋白 (osteopontin ,OPN)、骨涎蛋白 (bonesialapretion ,BSP)的表达情况对细胞做表型鉴定。结果 :原代培养的人牙囊细胞生长良好 ,但其中混有少量上皮根鞘细胞 ,经传代可完全分离 ,传至 11代仍保持原有活力 ;牙囊细胞为长梭型 ,成纤维样 ;电镜下见细胞核浆比例大 ,核仁明显 ,含有溶酶体、大量的粗面内质网和发达的高尔基体 ,含有大量的中间丝。电镜结果显示细胞代谢旺盛 ,增殖活性高 ,含有牙囊细胞特有的高密度电子颗粒 ,免疫组化Vim、ColⅠ、ColⅢ、FN、OPN、BSP呈阳性着色 ,抗角蛋白呈阴性着色。结论 :本实验培养的是牙囊细     

人牙周膜干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外定向诱导人牙周膜干细胞分化为神经元样细胞,探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC）,用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的预诱导培养液诱导培养24 h,然后换用含5 mmol/L β-巯基乙醇（β-ME）的诱导培养液诱导培养6 h,光镜下观察诱导细胞形态学的改变,免疫荧光、RT-PCR等方法检测鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。同时以未诱导细胞为对照。结果体外诱导培养6 h细胞即发生形态学改变,可看到典型的神经元样细胞;免疫荧光、RT-PCR检测诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE、NF,未诱导细胞无表达。结论人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为神经元样细胞,具有多向分化的潜能。     

大鼠牙囊细胞体外培养与表型鉴定

目的：体外培养大鼠牙囊细胞（RDFCs）,鉴定其细胞来源及表型,为牙周组织再生的研究提供可靠的种子细胞来源。方法：选择出生后6-7d SD仔鼠,分离上、下颌第一、第二磨牙牙胚,取牙囊组织进行原代和传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况;波形丝蛋白（Vimentin,VIM）和角蛋白（Cytokeratin,CK）鉴定其细胞来源;免疫组化染色技术检测细胞骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、Ⅰ型胶原（type Ⅰ collagen,CoL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（typeⅢ collagen,CoL-Ⅲ）及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达。结果：细胞形态呈多形性,有长梭形,纺锤形、不规则三角形等,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。免疫组化染色显示OPN、BSP、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ、FN在胞浆中呈不同程度的阳性表达。结论：大鼠牙囊细胞来源于外胚间充质,具有成纤维细胞的形态特征及成骨/成牙骨质细胞表型特征,可将牙囊细胞作为种子细胞用于牙周组织工程的再生研究。     

FHL2蛋白在人牙周膜细胞体外矿化过程中的表达

目的 探讨胞内信号转导分子FHL2蛋白在人牙周膜细胞(hPDLCs)体外矿化过程中的表达.方法 体外培养hPDLCs,实验组用矿化诱导液培养,对照组不加诱导液.培养0、14、28 d后,茜素红染色检测矿化结节的形成;免疫细胞化学法检测hPDLcs矿化诱导0、14d时FHL2蛋白的表达;同时采用半定量RT-PCR方法检测...     

大黄蒽醌衍生物对人牙周膜细胞作用的体外实验研究

目的：探讨不同浓度大黄蒽醌衍生物对人牙周膜细胞（periodontal ligament cells,PDLC)体外生长的影响。方法：采用原代培养人PDLC技术和四唑盐（MTT）显色分光光度法。结果：20，50μg/ml大黄素对人PDLC有一定的促生长作用，并呈浓度依赖性；而大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚与对照组相比无明显差异。结论：大黄素对PDLC的促生长作用，可能对牙周组织再生修复起作用。     

人牙源性上皮细胞的体外培养研究

目的：建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法，为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法：采用组织块法原代培养人牙源性上皮细胞，用更换培养液类型、多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，用免疫荧光法检测细胞表达角蛋白和成釉蛋白的情况。结果：原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好，但有少量成纤维细胞混杂，经纯化后明显好转，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白及成釉蛋白。传至第5代后，细胞逐渐变为长梭形，失去上皮细胞形态。结论：体外培养的人牙源性上皮细胞在较长时间内可保持其特性，有望作为牙齿组织工程研究的种子细胞。