秀丽隐杆线虫在神经科学研究中的应用

模式生物秀丽隐杆线虫(C. elegans)是多细胞无脊椎动物,其中神经细胞占体细胞的三分之一之多.虽然解剖结构十分简单.但神经递质、突触蛋白、离子通道等基本组成与人类具有高度的保守性.由于其全基因组遗传信息已知,基因操作便捷,秀丽隐杆线虫已经在高级神经功能活动、神经系统疾病等研究领域中发挥重要作用.本文就秀丽隐杆线虫在神经科学研究中的应用进行综述.     

以秀丽隐杆线虫为模型的电离辐射损伤研究进展

秀丽隐杆线虫（简称线虫）作为一种经典模式生物,已被广泛应用于辐射损伤研究领域。电离辐射在线虫体内造成的损伤与脊椎动物相似,主要体现在DNA损伤、活性氧水平上升、衰老加速和生殖系统受损等。以线虫作为电离辐射动物模型的研究已经在辐射损伤领域中取得很多突破。电离辐射引起的线虫衰老受多种因素影响,包括错误的蛋白表达、脂质代谢的改变等。电离辐射可诱导线虫生殖细胞凋亡、细胞周期阻滞和DNA损伤。以线虫作为电离辐射动物模型的研究对高等生物的辐射效应研究有重要意义。笔者简要综述了以线虫为模型的辐射损伤研究进展。     

神经酰胺在辐射诱导的秀丽隐杆线虫生殖细胞旁效应中的机制研究

目的 利用秀丽隐杆线虫为研究对象,以单粒子束为辐射源,从活体水平探究神经酰胺在辐射旁效应中的作用。方法 以野生型N2和突变体L4期线虫的后食道球为辐射部位,分别给予2 000个质子的辐照剂量,检测和分析成虫的生殖腺凋亡细胞以及基因表达水平。结果 定点辐射N2的后食道球可显著诱导线虫旁区生殖腺细胞凋亡的增加（t=9.007,P<0.05）,但在神经酰胺合酶基因突变体中未表现出这一现象（P>0.05）。实时定量PCR结果显示,辐射诱导N2和神经酰胺合酶基因突变体lagr-1（gk327）;hyl-1（ok976）线虫中凋亡核心通路基因egl-1和ced-13表达量的上升,但两品系线虫间的差异无统计学意义（P>0.05）;辐射可诱导N2和DNA损伤检验点突变体hus-1（op241）中hyl-1和lagr-1表达量的上升,且两品系间的差异无统计学意义（P>0.05）。非受体络氨酸激酶abl-1突变可显著增加辐射诱导的旁区细胞凋亡（t=13.241,P<0.05）,而当神经酰胺合酶基因与abl-1同时突变时,凋亡增加的现象被抑制（t=13.462,P<0.05）。结论 神经酰胺参与线虫体内辐射引起的旁区凋亡过程,且可能与凋亡核心通路中的促凋亡蛋白egl-1和ced-13以及DNA损伤响应通路中的HUS-1协同发挥作用。抑凋亡基因abl-1与神经酰胺合酶在凋亡过程中表现出拮抗关系。     

一低剂量辐射诱导新基因的转录调控和初步功能分析

目的：克隆低剂量辐射诱导基因，研究辐射对其转录调控作用和生物学功能。方法：用mRNA差异显示技术分离辐射诱导表达基因，用RACE技术获取cDNA旁侧序列，Northern杂交分析基因的转录调节，生物信息学分析基因的结构和功能。结果：获得包括3'端在内的辐射诱导新基因LRIGx的cDNA片段，序列同源性比较显示与人染色体20ql 1.2-12一段DNA高度同源（＞99％），Northern杂交结果揭示该基因转录子全长约8．5kb，在0．2Gy照射后2h出现诱导表达，4h后转录子水平为对照细胞的5倍多，也受0．02Gy更低剂量照射诱导表达，2Gy大剂量照射后1h出现短暂诱导表达，但不如低量照射明显，2h后恢复正常水平，生物信息学分析结果显示该基因编码产物含有解旋酶活性保守区，结论：分离鉴定出一低剂量辐射反应基因，其编码蛋白可能参与DNA代谢（如修复）等细胞辐射反应过程。     

秀丽隐杆线虫神经免疫相互作用的研究进展

机体受外源病原体入侵时,会迅速激活固有免疫反应.免疫反应过强会导致炎症反应和组织损伤,过弱则会使机体受到感染.神经系统可通过释放神经递质、神经肽及激素来调节固有免疫反应的强度.与哺乳动物复杂的神经免疫系统结构相比,秀丽隐杆线虫的神经免疫系统结构简单,且易于进行遗传学、分子生物学和行为学分析等,因而被应用于神经免疫相互作用的研究.近年来,对秀丽隐杆线虫的研究发现,调节其固有免疫反应的神经通路主要是转化生长因子β通路、胰岛素信号通路和多巴胺通路.由于这些通路在进化上有许多保守之处,因而为高等生物神经免疫相互作用分子机制的研究提供了新思路.本文仅就近年来该领域的研究进展做一概述.     

一个新的Ⅰ型咪唑啉受体可变剪接体的克隆、鉴定及亚细胞分布

目的克隆Ⅰ型咪唑啉受体（I1R,Nischarin）新的可变剪接体,并对其进行表达特征和亚细胞定位研究,探索其表达与I1R的差异,从而为解释I1R药理学作用多样性奠定基础。方法在本课题组前期研究基础上设计引物,通过RT-PCR从大鼠肝组织中克隆新的可变剪接体,将其克隆到pcDNA3.1、pEGFP-N1和PCMV-myc3个真核表达载体中,并通过细胞转染探索其在293T细胞中的分布,应用Western印迹测定其在真核细胞中表达蛋白的相对分子质量特征。结果成功克隆获得一个新的I1R可变剪接体（命名为I1R-ISO-472）,编码472个氨基酸,与GenBank中序列号AK036043.1的新基因的序列完全一致。生物信息学分析表明,该基因染色体定位于14号染色体14B,含有磷酯酰肌醇结合位点（PX_domainsuperfamily）与亮氨酸富集重复（LRR-RIsuperfamily）两个重要的功能结构域。I1R-ISO-472在293T细胞中表达的蛋白相对分子质量约为52×103,与预测基本一致。细胞免疫荧光结果表明,其在293T细胞内呈均匀弥散分布。结论成功克隆一个新的I1R可变剪接体,其表达特征及亚细胞分布提示其药理学作用可能与已知的I1R不同。     

飞行人员广泛性焦虑障碍与5-羟色胺2A受体基因多态性相关性的研究

目的探讨飞行人员广泛性焦虑障碍(generalized anxiety disorder,GAD)与5-羟色2A(5-HT2A)受体基因T102C和A-1438G位点多态性的关系。方法用聚合酶链反应技术(PCR)检测19例飞行人员GAD患者及55名正常健康对照飞行人员两基因位点的多态性。结果 GAD组与健康对照组飞行人员在T102C位点基因型的构成比上不存在统计学差异(P0.05),在A-1438G位点基因型的构成比上存在统计学差异(P0.05),患者组G-1438等位基因型频率(65.8%)明显高于对照组(34.2%)。结论5-HT2A基因A-1438G位点多态性可能与飞行人员GAD相关,G-1438等位基因可能是飞行人员GAD的一个易感基因。     

电离辐射后人类1、2和4号染色体畸变位点的分布

目的 :通过对染色体断裂位点的定位 ,研究电离辐射后人类 1、2和 4号染色体断裂位点的分布及与 DNA含量的关系。方法 :进行离体照射与活体照射两组研究。离体照射组取两名健康供血者的外周血淋巴细胞 ,分别用 0 .1至 2 Gy的6 0 Coγ射线照射。活体照射组取材于 1994年 Estonia辐射事故暴露人员 ,5名受试者分别暴露于 0 .5至 1Gy以上的不同剂量 ,在事故后 8个时间点随访取样 ,培养后用荧光原位杂交 (FISH)法染色 ,进行中期染色体检测。通过计算机 ISIS系统进行染色体畸变位点的计数与测量。结果 :1两组经测量与计数所得染色体互换数值…     

辐射诱导的野生型及突变型PTEN基因重组质粒的构建及鉴定

目的构建辐射诱导人野生型及突变型PTEN基因重组质粒并进行鉴定。方法以HeLa细胞总DNA为模板PCR扩增Egr-1基因启动子辐射敏感区,将PCR产物分别定向插入携带野生型PTEN和突变型PTEN蛋白编码基因的表达载体pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E启动子区,构建具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E。同时,将Egr-1基因启动子辐射敏感区亚克隆入pGL3-Promoter载体中,通过荧光素酶报告实验,验证不同照射剂量、照射后不同时间点下人肝癌SMMC-7721细胞中Egr-1启动子区对X线照射的辐射诱导能力。Western印迹检测X线照射对PTEN蛋白表达的影响。结果凝胶电泳分析证实,PCR扩增出Egr-1基因启动子辐射敏感区,构建出具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E,经不同酶切实验均证实含有与Egr-1辐射诱导区和PTEN基因相同片段大小的条带。荧光素酶报告实验证实,在不同时间点和不同照射剂量照射下,含Egr-1启动子区报告质粒细胞组的荧光素酶活性均明显高于转染空载体细胞,Western印迹检测表明,转染了pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E的细胞组在未接受照射时PTEN蛋白的表达量极低,但在接受8 Gy的X线照射后,PTEN蛋白的表达量明显提高,高于转染了pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E的细胞。结论成功构建了具有辐射诱导能力的含人野生型及突变型PTEN基因的重组质粒,为今后肿瘤的治疗奠定了基础。     

新疆维吾尔族精神分裂症与5-羟色胺受体基因多态性关联分析

目的:探讨13q14.1区域5-羟色胺受体基因多态性与新疆维吾尔族(维族)精神分裂症的关系;方法:采用病例一对照研究,应用飞行时间质谱生物芯片技术(MassARRAY)检测新疆地区106例维族精神分裂症患者和123例维族对照组在13q14.1区域5-HT2A的2个SNP(rs6311、rs6313)位点基因型;应用卡方检验和数量性状分析分别进行等位基因、基因型关联分析;结果:维族病例组和对照组rs6311、rs6313位点基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05);等位基因T/C在患者组和对照组中的频数分布比较均无显著性差异(P＞0.05);基因型T/T、C/T、C/C频数分布比较无显著性差异(P＞0.05).结论:5-HT2A基因rs6311、rs6313位点可能不是维族精神分裂症的易感基因,但是不能排除该基因其他SNP位点与维族精神分裂症的关联;新疆维吾尔族精神分裂症5-HT2A基因rs6311、rs6313位点无交互作用.