8—氯腺苷抗生长因子诱导的血管内皮细胞增殖作用的研究

探讨８－氯腺苷对生长因子对诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用及可能的作用机理。方法在采用血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子诱导血管内皮细胞增殖的同时,加入８－Ｃｌ－Ａ,利用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入和流式细胞仪检测技术,研究８－Ｃｌ－Ａ对生长因子所诱导的血管内皮细胞ＤＮＡ合成的抑制作用。     

8-氯腺苷对抑制人晶状体上皮细胞增生的体外研究

目的探讨8-氯腺苷(8-chloroadenonosine)是否对体外培养的晶状体上皮细胞增生有抑制作用。方法取第2、3代传代培养的晶状体上皮细胞做药物抑制试验。加入不同浓度的8-氯腺苷(2,4,8,16μmol/L)作用24、48、72和96小时后,用MTT比色测定法和流氏细胞仪检测法确定药物对兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用。结果 8-氯腺苷在4-16μmol/L的浓度下能抑制晶状体上皮细胞的增生。并且其抑制程度呈时间、剂量依赖性。结论该结果可为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

生长因子诱导视网膜色素上皮细胞增殖的协同作用研究

目的从细胞水平探讨生长因子:肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖的协同调控作用。方法通过PPE细胞培养，采用氚标胸腺嘧啶核苷(3 H-thymidine,3 H-TdR)掺入测定三种生长因子单用和分别联用诱导RPE细胞DNA合成改变，细胞计数观察RPE细胞生长变化。结果三种生长因子单用均可明显促进RPE细胞DNA合成及细胞数目增加,TNF-α、IL-β和bFGF的3 H-TdR掺入每分钟计数值(counts per minute,cpm)分别是对照组的2.74、2.66和1.69倍(P<0.05)。两种生长因子联用较单用cpm明显提高,其中TNF-α+IL-βcpm是对照组的3.14倍(P<0.05)。三种生长因子联用时cpm是对照组的3.74倍(P<0.05)。结论三种生长因子间存在促RPE细胞增殖的协同作用,这可能是生长因子对RPE细胞增殖的重要调控机制之一。(中华眼底病杂志,1998,14:95-97)     

球后注射8—氯腺苷后眼内药代动力学研究

目的 观察新型抗代谢药物8-氯腺苷球后注射后眼内的分布情况。以探讨该药物用于视网膜和脉络膜新生血管性病变治疗的可行性。方法 采用高效液相色谱分析法分别测定单次球后注射及反复多次球后注射8-氯腺苷后,眼内的药物分布情况。结果 单次球后注射8-氯腺苷后,眼后段的各组织中均检测到不同浓度的8-氯腺苷以及其代谢产物8-氯腺嘌呤。反复多次球后注射8-氯腺苷后未见蓄积效应。结论 球后注射8-Cl-A后,该药在眼后段具有良好的分布,多次应用眼内无明显的蓄积作用。     

8-氯腺苷抑制肿瘤坏死因子α诱导的视网膜细胞原癌基因表达的实验研究

目的 探讨8—氯腺苷(8-CLA)抑制肿瘤坏死因子α(TNF—α)诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞原癌基因的表达情况,为寻找抑制细胞增殖的新药提供依据。方法 取健康牛眼RPE细胞进行培养,采用Northern杂交法测定8-CLA对TNF—α诱导的RPE细胞c—fos及c—myc mRNA表达的影响。结果 正常培养的RPE细胞有少量c—fos及c—myc mRNA表达;加入TNF—α实验组,RPE细胞中c—fos及c-myc mRNA表达量增加,分别为对照组的3．1和1．5倍;加入TNF—α和8—CLA实验组,经TNF—α刺激的：RPE细胞中c—fos及c—myc mRNA表达量降低,分别较未用药组下降25．0％和29．0％。结论 8-CLA可抑制TNF—α诱导的RPE细胞c—fos及c—myc原癌基因的表达,此项研究结果将为临床探索有效抑制生长因子诱导的RPE细胞增殖的药物研究提供理论依据。     

抗代谢药物8-氯腺苷抑制兔实验性视网膜新生血管的研究

目的探讨抗代谢药物8-氯腺苷(8-Cl-A)眼局部应用对兔实验性视网膜新生血管的抑制作用。设计实验研究。研究对象纯种青紫兰家兔40只。方法采用视网膜静脉直接光凝法建立兔视网膜静脉阻塞(RVO)模型。分别设立对照组及8-Cl-A给药组,每组各20只(20眼)。于造模后次日治疗组每日球后注射8-Cl-A 9mg(计10日),对照组注射等体积生理盐水,采用荧光素眼底血管造影观察注射后2周内2组兔视网膜新生血管的发生率,并进行统计学分析。主要指标视网膜新生血管发生率及程度。结果RVO对照组20眼中,17跟发生视网膜新生血管:8-Cl-A治疗组20眼中3眼发生光凝点远端的视网膜新生血管(P= 0.000),且发生的程度及范围小于对照组,同时未见视网膜静脉侧支循环的建立。结论8-Cl-A可有效抑制兔实验性视网膜新生血管的发生。在视网膜血管增生性病变治疗中可能具有潜在的临床应用价值。     

生长因子对培养人眼视网膜色素上皮细胞增殖的调控作用

目的探讨生长因子对人眼视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＲＰＥ）细胞增殖的调控作用。方法建立人眼ＲＰＥ细胞培养体系，利用３Ｈ－ＴｄＲ掺入法和细胞计数观察表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ－ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂ－ＦＧＦ）、胰岛素样生长因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＩＧＦ－Ｉ）对培养ＲＰＥ细胞的作用。结果（１）ＥＧＦ，ｂ－ＦＧＦ，ＩＧＦ－Ⅰ与对照组比较，可明显增强人眼ＲＰＥ细胞ＤＮＡ合成６．６～１２．２倍，增强能力为ＥＧＦ＞ｂ－ＦＧＦ＞ＩＧＦ－Ⅰ。（２）当生长因子联合作用时，可数倍明显增强３Ｈ－ＴｄＲ掺入，能较单一因子更有效地刺激人眼ＲＰＥ增殖。结论结果提示，生长因子的协同作用可能是增殖性视网膜病变发生的重要机理之一。     

舒拉明对碱性成纤维细胞生长因子促进人视网膜色素上皮细胞增殖作用拮抗效应的研究

目的探讨舒拉明抗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的作用及机制。方法采用体外培养的人眼视网膜色素上皮(RPE)细胞,总共10组。其中5个对照组的培养基中分别加入终浓度为1、10、100、500ng/ml的bFGF和3125μg/ml的舒拉明。实验组4组,培养基中除加入3125μg/ml的舒拉明外,还分别加入终浓度为1、10、100和500ng/ml的bFGF。另设1组空白组。培养48h后,采用MTT法,酶联免疫检测仪测定各孔吸光度(A)值,计算细胞的增殖率。采用析因分析比较bFGF和舒拉明的交互效应和单独效应。结果各组细胞生长无明显的形态学差异。舒拉明与bFGF存在拮抗性交互效应(F=673,P<001)。对照组比较空白组,全部bFGF组A值都增加,最大A值为bFGF的10ng/ml浓度组;舒拉明组则降低;实验组中,各组A值较bFGF对照组都下降,最大A值左移对应bFGF的100ng/ml浓度组。结论舒拉明能够拮抗bFGF促RPE细胞增殖的作用,其抑制RPE细胞增殖并进一步防治PVR的机制至少包括拮抗了生长因子的生物学效应。     

高糖下腺苷A_（2A）受体对人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的研究高糖下腺苷A2A受体对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法体外培养人RPE细胞,应用免疫组化的方法检测腺苷A2A受体在人RPE细胞中的表达;用腺苷A2A受体作用培养的人RPE细胞,将其分为高糖（33mM）＋腺苷脱氨酶（ADA,2U/ml）、高糖＋ADA＋腺苷A2A受体特异性激动剂（CGS21680,50μM）、高糖＋ADA＋CGS21680＋腺苷A2A受体特异性拮抗剂（SCH58261,100μM）,药物组合刺激RPE细胞24h后,裂解细胞提取RNA,同时收集细胞培养液,分别应用real-time PCR和ELISA的方法检测高糖下腺苷A2A受体对人RPE细胞VEGF mRNA和蛋白的影响。结果腺苷A2A受体在RPE细胞中有表达,在高糖条件下,50μMCGS21680可以刺激RPE细胞VEGF mRNA水平升高约2.7倍,蛋白水平升高1.5倍,而再加100μMSCH58261反而使RPE细胞VEGF mRNA较前下降约 40%,蛋白水平较前下降60%。结论在高糖条件下,腺苷A2A受体可以刺激VEGF的合成,因此腺苷A2A受体可能参与糖尿病性视网膜病变新生血管的形成。     

转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞增殖中NLRP3炎症小体的表达及意义

目的　探讨转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）刺激下Nod样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体在视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）增殖中的表达变化及意义。方法　利用TGF-β刺激RPE细胞增殖模拟增生性玻璃体视网膜病变模型，随机分为空白对照组（Sham组）和TGF-β诱导RPE细胞增殖组（TGF-β组），TGF-β组再根据浓度（0.5 μg·L^-1、2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1、12.5 μg·L^-1）分组。利用MTT 微量酶比色法检测RPE细胞增殖情况；Western blot观察NLRP3蛋白的表达变化；利用标准ELISA试剂盒检测白细胞介素（interleukin，IL)-1β和 IL-18表达情况。结果　与Sham组比较，0.5 μg·L^-1 TGF-β组RPE细胞增殖不明显，差异无统计学意义（P>0.05），但NLRP3、IL-1β和 IL-18表达明显提高（均为P<0.01）；2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖明显，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均提高（均为P<0.05）；与0.5 μg·L^-1 TGF-β组相比，2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖显著增加，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　不同浓度TGF-β诱导RPE细胞增殖中NLRP3炎症小体表达变化不同，两者可能相互调控影响RPE细胞增殖，在增生性玻璃体视网膜疾病发生发展中具有重要的作用。     

苏拉明对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 观察苏拉明(suramin)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(retinalpigment epithelial cells)生长、增殖的影响。方法 以300mg·L~(-1)苏拉明作用于培养的视网膜色素上皮细胞,于不同的时间点行细胞计数,绘制生长曲线,台盼蓝染色判定细胞的活性;将不同浓度的苏拉明(0、100、200、300、400mg·L~(-1))加入RPE细胞培养液,72h后用四甲基唑盐(MTT)比色法测吸光值A,并计算不同浓度条件下的细胞增殖抑制率;流式细胞技术检测细胞周期变化。结果 苏拉明在所设浓度内均抑制RPE细胞增殖,并存在时间-效应及剂量-效应关系,最大增殖抑制率约78％,72h时IC_(50)为272mg·L~(-1)。FCM示suramin使G_2/M期细胞增加了14.2％。结论 苏拉明能抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖,可作为防治增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的候选药物作进一步研究。     

Ascorbic acid reversibly inhibits proliferation of retinal pigment epithelial cells

PURPOSE: Proliferation control in adult retinal pigment epithelial (ARPE) cells is an essential factor in the clinical management of proliferative vitreoretinopathy (PVR). Factors which inhibit PVR and which are without toxic potential are therefore of interest in controlling proliferation. The aim of the present study was to gain insight into a possible function of high intraocular ascorbic acid levels as a physiological modulator of proliferation. METHODS: Adult retinal pigment epithelial cells were incubated in vitro with increasing concentrations of ascorbic acid (0.5-4 mmol, pH 7.4). Cell proliferation was assayed by the bromide-deoxy-uridine (BrdU) assay. The culture medium (CM) containing ascorbic acid was replaced with normal CM and the recovery of proliferation was measured after 24 hours. In order to be able to distinguish between proliferation inhibition, apoptosis, necrosis and recovery of proliferation, we performed TUNEL assays and fluorescence analysis cell-counter (FAC) analysis. RESULTS: Ascorbic acid significantly inhibits ARPE cell proliferation if it is present in concentrations above 2 mmol. Proliferation resumed in all ARPE cell cultures after pre-incubation with ascorbic acid, indicating that direct toxicity of ascorbic acid is a negligible factor. The time-point and extent of recovery in proliferation was dependent on the initial ascorbic acid concentration. Fluorescence-labelled cell counts on apoptosis markers (FAC) data showed some induction of apoptosis and necrosis after incubation with 4 mmol ascorbic acid. CONCLUSIONS: Ascorbic acid has a dose-dependent influence on the proliferation of vital ARPE cells. This possibly reflects the role of ascorbic acid at a physiological level within the vitreous cavity in preventing proliferative vitreoretinopathy (PVR). These findings may stimulate the development of new strategies in the clinical treatment of PVR.     

三氧化二砷对表皮生长因子诱导的视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响

背景 细胞因子失衡所导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞的异常增生和迁移是增生性玻璃体视网膜病变( PVR)的主要病理变化之一.三氧化二砷(As2O3)是中国传统中药中的有效成分,可有效抑制肿瘤细胞的增生和迁移.但As2O3对细胞生长因子引起的RPE细胞增生和迁移的影响尚未明确. 目的 探讨As2O3对表皮生长因子(EGF)诱导的ARPE-19细胞增生和迁移的影响.方法 用无血清培养基对RPE细胞系ARPE-19细胞进行培养,将终浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L的As2O3分别加入到无血清培养基和含10 mg/L EGF的ARPE-19细胞培养液中作用24 h和48 h,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各培养组ARPE-19细胞活性的吸光度(A)值,以探讨As2O3对细胞的药物毒性作用,并筛选安全、有效的As2O3作用浓度.用10 mg/L EGF加入培养基诱导ARPE-19细胞迁移,分别在培养板中加入0、0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3 作用24 h和48 h,并通过划痕试验和Transwell试验检测As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞迁移的影响.结果 MTT法检测发现不同浓度As2O3组作用24 h和48 h后,无血清培养组细胞A值随As2O3浓度的升高而逐渐下降,总体差异有统计学意义(F浓度=38.269,P=0.000;F时间=0.874,P=0.358).与空白对照组(0μmol/LAs2O3组)比较,0.5～ 5.0 μmol/L As2O3组ARPE-19细胞A值的差异均无统计学意义(P＞0.05).对含10 mg/LEGF组的ARPE-19细胞,药物对细胞A值的影响呈现浓度和时间依赖性(F浓度=152.155,P=0.000;F时间=51.649,P=0.000).与对照组比较,0.5～2.0μmol/L As2O3加入24 h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(P＞0.05),而0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3加入10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞中作用24h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(F浓度=2.215,P=0.126;F时间 =2.230,P=0.155).5.0 ～20.0 μmol/L As2O3作用于EGF诱导的ARPE-19细胞中作用后,细胞A值明显下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),5.0～20.0 μmol/L As2O3作用24 h后,对EGF诱导的ARPE-19细胞增生抑制率分别为12％、32％、37％;作用48 h后细胞抑制率分别为39％、44％和53％.划痕试验结果显示,0.5～2.0 μmol/L As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞的横向迁移具有抑制作用.Transwell试验结果表明,0.5～2.0 μmol/L As2O3对10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞纵向迁移有明显的抑制作用,0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3作用12h对ARPE-19细胞的抑制率分别为22％、33％和46％. 结论 As2O3在一定浓度范围内对ARPE-19细胞无毒性作用,2.0 μmol/L以下浓度的As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞增生无明显影响,但可影响细胞的迁移能力,5.0 μmol/L以上浓度的As2O3可明显抑制ARPE-19细胞的增生.     

Thalidomide and prednisolone inhibit growth factor-induced human retinal pigment epithelium cell proliferation in vitro

Thalidomide and prednisolone were recently introduced as treatment modalities in age-related macular degeneration (AMD). Growth factor-induced activation of retinal pigment epithelial (RPE) cells is a crucial event in this disease. The purpose was to examine the effect of thalidomide and prednisolone on growth factor-preactivated RPE cells. Human RPE cells were stimulated with 10 ng/ml platelet-derived growth factor (PDGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), or vascular endothelial growth factor (VEGF) for 24 h. Afterwards, thalidomide (50 microg/ml) or prednisolone (100 ng/ml) were added for 24 h. RPE cell proliferation was determined by [3H]-thymidine incorporation. PDGF and bFGF significantly stimulated human RPE cell proliferation (p < 0.005), the value for VEGF stimulation was not significant (p = 0.3). The effect of the growth factors was diminished after addition of thalidomide and prednisolone (p < 0.005). The current study shows that the inhibitory properties of thalidomide and prednisolone remain even after growth factor activation of the cells.     

肝细胞生长因子对培养的视网膜色素上皮 细胞移行及增生的作用

目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)对视网膜色素上皮 (retinal pigment epitheliaum, RPE) 细胞的促增生和促移行作用。方法在无血清培养液培养的人RPE细胞中分别加入1、2、10、50、100 μg/L不同浓度的HGF,四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)测定促细胞增生情况; 采用RPE细胞损伤愈合模型,在无血清培养液中分别加入1、2、10、50、100 μg/L 不同浓度的HGF,培养20 h后计数进入刮痕区的细胞,观察HGF对RPE细胞移行的作用。结果HGF浓度处于10 ～100 μg/L时对RPE细胞具有促增生作用(P<0.05或P<0.01), 增生率为18.2 %～34.8 %,其中浓度为50 μg/L作 用3 d达到最大促增生效果(P<0.01）,增生率为32.8 %;HGF可明显促进RPE细胞移行,促移行能力分别为113.0 %(10 μg/L), 91.7 %(50 μg/L) 和50.3 %(100 μg/ L )。浓度自2 μg/L开始出现促细胞移行作用(P<0.05),促移行能力为9.3 %。结论HGF可促进RPE细胞增生和移行,是RPE细胞的有丝分裂原和强力的促移行因子。(中华眼底病杂志,2001,17:307-310)     

胶质细胞培养液对视网膜色素上皮细胞生长的影响

目的 观察体外培养的视网膜色素上皮细胞条件培养液对视网膜神经胶质细胞生长的影响。方法 用不同稀释度的视网膜条件培养液培养视网膜神经胶质细胞，细胞计数法观察细胞数量的变化；MTT法测定对细胞增生活性（吸光度A值）的影响；流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果 随着视网膜条件培养液浓度的增加，视网膜胶质细胞的数量明显增加，吸光度A值升高，进入S期的细胞明显增加，显示体外培养视网膜色素上皮细胞促进视网膜神经胶质细胞增生。结论 视网膜色素上皮细胞和视网膜神经胶质细胞细胞间的相互作用对于PVR等的产生和发展是非常重要的。