耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的临床研究

目的比较荧光定量PCR法和传统细菌培养药敏试验两种方法鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的能力,评估荧光定量PCR直接检测不同类型标本中MRSA的mecA基因是否具有临床应用价值。方法收集2013年11月-2014年11月经细菌培养和纸片药敏试验确定为金黄色葡萄球菌的111份临床标本,荧光定量PCR法检测标本的mecA基因,比较两种方法结果。结果两种方法具有较好一致性、吻合度,差异有统计学意义;以传统方法为对照,荧光定量PCR直接检出MRSA的敏感性为100.0%、特异性90.9%;PCR检出痰液标本的MRSA的敏感性为100.0%、特异性100.0%;PCR检出其他标本的MRSA的敏感性为100.0%、特异性81.8%;mecA基因直接检测与传统方法不一致的全部为血培养标本,但分离菌落基因检测与药敏结果一致。结论荧光定量PCR直接检测临床标本mecA基因用于筛查MRSA可靠,临床微生物实验室可推广以早期控制医院感染和指导临床抗菌药物使用。     

乳胶凝集试验检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的评价

MRSA是医院感染和社区感染的重要病原菌.该菌主要由mecA编码产生的青霉素结合蛋白2a （PBP2a）降低与β-内酰胺类抗生素的亲和力,对所有β-内酰胺类、头孢菌素类、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂均表现为耐药,通常对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类等抗生素也显示耐药,呈现多重耐药的特点.快速、准确地检测MRSA是控制其感染和限制其流行的重要步骤[1].基因检测法如核酸杂交法和PCR法由于直接检测耐药基因,被认为是检测MRSA的＂金标准＂[2].但基因检测法由于需要较高的实验条件,不易在常规实验室应用.我们应用乳胶凝集试验法快速检测PBP2a从而判断MRSA,并与PCR扩增mecA基因的检测方法进行比较,以评价乳胶凝集法的应用前景.     

医院外环境中检出金黄色葡萄球菌的耐药性

目的：对源自食品、公共用具、空气、食物中毒等医院外标本中分离到的金黄色葡萄球菌进行MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和多重耐药性测定，以了解其携带频度与耐药情况。方法：用琼脂筛选法和PCR法检测SA菌株中的MRSA，K-B法测定MRSA中的多重耐药性。结果：从189株SA中检出MRSA菌株18株，检出率为9．52％，检出的MRSA耐药性特征与院内分离到的MRSA相同，具多重耐药性，尤其是对青霉素和β-内酰类抗生素的耐药性。琼脂筛选法检出MRSA稍低于PCR，两法的相符率为88．8％。结论：分离于食品和环境标本中的SA检出MRSA等耐药菌株明显低于临床标本。琼脂筛选法具有良好的特异性和敏感性，由于该法简便、经济，不失为一种实用的筛选MRSA方法。     

多重聚合酶链反应检测儿童常见下呼吸道感染细菌

目的 探讨多重聚合酶链反应(PCR)检测儿童急性下呼吸道感染细菌的应用价值.方法 对383例急性下呼吸道感染患儿的深部呼吸道吸引物进行细菌培养及多重PCR检测,检测肺炎链球菌、流感嗜血菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌等9种病原菌.结果 细菌培养的总检出率为42.04％,多重PCR检出率45.95％,两者差异无统计学意义;以细菌培养为标准,多重PCR检测的总敏感性为77.02％,特异性为76.58％,其中大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的检出率明显高于培养法.结论 多重PCR检测可作为下呼吸道致病菌快速检测的有用工具.     

基于流感嗜血杆菌外膜蛋白ompP6基因的PCR的建立和临床应用

目的建立基于流感嗜血杆菌外膜蛋白omp P6基因的PCR检测方法,并确定其检测限、灵敏度和特异性。方法根据Gen Bank公布的omp P6基因核苷酸序列设计引物,用流感嗜血杆菌标准菌株验证其检测限,通过检测1 225例呼吸道感染标本并与细菌培养法比较确定所建立的PCR检测方法的灵敏度与特异性。结果 1 225例呼吸道感染标本,细菌培养流感嗜血杆菌的阳性率为10.94%(134/1 225),PCR检测流感嗜血杆菌的阳性率为19.18%(235/1 225),培养法检测阳性标本PCR法检测均阳性。建立的PCR方法检测临床标本流感嗜血杆菌检出率明显高于细菌培养(χ2=32.5,P0.01)。检测时模板的下限为3 pg,方法的灵敏度为100%,特异性为90.7%。结论建立的PCR方法具有快速和灵敏度高的特点,对于流感嗜血杆菌引起的呼吸道感染早期诊断有重要意义。     

单克隆抗体标志乳胶凝集试验快速检测金黄色葡萄球菌及其耐药性

目的探讨金黄色葡萄球菌（SAU）的细菌学快速检测鉴定及其耐药性分析的试验方法。方法目标菌落先经传统鉴别方法怀疑葡萄球菌，采用Slidex MRSA Detection乳胶快速检测SAU菌株青霉素结合蛋白2a（PBP2a），确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）；设立SAU耐苯唑四林筛选试验对照，两组不符合菌株经PCR方法检测MceA基因确认。结果456株葡萄球菌中Slidex staph．plus乳胶凝集法阳性（鉴定为SAU）135株，135株凝集法阳性菌中最后确认为SAU127株，321株凝集法阴性菌最后确认为SAU11株，乳胶凝集法鉴定金黄色葡萄球菌灵敏度92．0％，特异性97．5％；Slidex MRSA Detection乳胶快速检测138株SA的PBP2a，阳性52株，138株SAU经苯唑西林筛选试验及PCR测定mceA基因，确定MRSA57株，乳胶凝集法快速检测SAU的PBP2a确定MRSA，灵敏度91．2％，特异性100％。结论单克隆抗体乳胶凝集法快速检测SAU及鉴定MRSA，具有较高灵敏度和特异性。     

金黄色葡萄球菌的耐药特征

目的 了解临床分离金黄色葡萄球菌的耐药性及克林霉素诱导型耐药的发生率,评价头孢西丁和苯唑西林纸片扩散法检测MRSA的临床应用价值.方法 VITEK-2微生物分析系统及K-B法药敏试验对临床分离菌株进行鉴定和药物敏感性测定;胶乳凝集试验检测PBP2a;头孢西丁和苯唑西林纸片扩散法检测MRSA;双纸片扩散法检测诱导型克林霉素耐药;WHONET 5.4及SPSS11.3软件对结果进行统计分析.结果 青霉素和氨苄西林耐药率最高,分别为98.9%和100.0%,未发现万古霉素耐药或中介菌株;93株金黄色葡萄球菌中,MRSA和MSSA分别为58株(62.4%)和35株(37.6%),MRSA对11种抗菌药物的耐药率高于MSSA;头孢西丁纸片扩散法的敏感性和特异性分别为98.3%和97.1%,苯唑西林纸片扩散法的敏感性和特异性分别为75.9%和94.3%;对红霉素耐药而克林霉素敏感的9株金黄色葡萄球菌中,5株(55.6%)为诱导型克林霉素耐药.结论 临床分离金黄色葡萄球菌耐药性已十分严重;头孢西丁纸片扩散法是检测MRSA简便、可靠的方法;临床微生物室应常规检测金黄色葡萄球菌红霉素对克林霉素的诱导耐药性.     

青霉素结合蛋白2a胶乳凝集试验检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的实验研究

目的 探讨青霉素结合蛋白2a(PBP2a)凝集试验检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的诊断价值和临床应用的可行性.方法 将临床分离的89株凝同酶阴性葡萄球菌,以聚合酶链反应(PCR)法检测菌株mecA基因的携带情况;并以此为金标准评价在苯唑青霉素诱导和非诱导条件下,PBP2a胶乳凝集试验检测MRCNS的敏感性、特异性、检出率等,并与传统的肉汤稀释法药物敏感试验作比较.结果 药物敏感试验检测MRCNS的敏感性为85.9%,特异性为25%,PBP2a凝集试验敏感性为87.1%,特异性为100%,经苯唑青霉素诱导后,敏感性升至95.3%,且检出率与PCR法无统计学意义.苯唑青霉索诱导可使β-内酰胺酶检测的阳性率由76.4%提高到91%.结论 PBP2a凝集试验快速、简便且敏感性较高,是一种较好的MRCNS检出方法.     

荚膜多糖基因聚合酶链反应在肺炎链球菌临床诊断中的应用

目的 评价荚膜多糖基因(capsular polysaccharide synthesis locus,CPS)聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)在肺炎链球菌病例临床诊断中的应用价值。 方法 收集保定市各医院诊断为肺炎病例的临床标本,其中痰液1 850份、血液1 850份、脑脊液245份,分别进行cpsA基因PCR检测和传统细菌培养,比较两种方法对肺炎链球菌的检测结果。同时根据cps基因血清特异性区域设计引物,采用多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,MP-PCR)对210株肺炎链球菌分型,并与荚膜肿胀试验结果进行比较分析。 结果 cpsA基因PCR检测法在3945份临床标本中检出肺炎链球菌600例,检出率为15.21%,高于细菌培养法。以细菌培养法为参考标准,cpsA基因PCR检测肺炎链球菌的灵敏度为97.67%,特异度为89.54%。且在两种方法中痰液中肺炎链球菌检出率均高于血液与脑脊液,差异具有统计学意义(P<0.05)。210株肺炎链球菌中,198株被MP-PCR法分出血清型,分型率为94.29%,高于荚膜肿胀试验。两种方法鉴定血清型别一致率达80.81%。其中有7株被荚膜肿胀试验鉴定为其它型别:63株多重PCR鉴定为19F的菌株中,有5株被荚膜肿胀试验鉴定为6A;35株多重PCR鉴定为19A菌株中,有1株被荚膜肿胀试验鉴定为19F;8株多重PCR鉴定为14的菌株中,有1株被荚膜肿胀试验鉴定为19A。 结论 cpsA基因PCR检测和cps基因血清特异性区域的MP-PCR检测在肺炎链球菌检出和分型上优于传统细菌培养法和荚膜肿胀试验,可用于肺炎链球菌的临床诊断,且标本以痰液为宜。     

应用多重PCR检测食品中的沙门菌

目的 建立快速检测食品中沙门菌的多重PCR方法. 方法应用软件设计4对沙门菌群特异引物,优化多重PCR扩增条件与样品处理方法,分别对61株沙门菌、14株非沙门菌及模拟标本进行检测,观察方法的特异性、敏感性和可行性. 结果建立的多重PCR检测所有的沙门菌均能扩出清晰、特异的预期条带,而非沙门菌均未检出;每反应的灵敏度平均为100 cfu.对食品中人工污染的沙门菌的检测,最低检测量是10 cfu,检测时间为8～9 h,与培养法比较,阳性符合率100%;对市售的481份禽制品进行检测,阳性结果12份,而细菌培养法检测阳性结果为10份. 结论多重PCR检测沙门菌敏感、特异、省时、省力,适用于沙门菌快速检测.     

Real-time polymerase chain reaction detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: impact on nosocomial transmission and costs.

OBJECTIVES: To assess the impact of real-time polymerase chain reaction (PCR) detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) on nosocomial transmission and costs. DESIGN: Monthly MRSA detection rates were measured from April 1, 2000, through December 31, 2005. Time series analysis was used to identify changes in MRSA detection rates, and decision analysis was used to compare the costs of detection by PCR and by culture.Setting. A 1,200-bed, tertiary care hospital in Canada. PATIENTS: Admitted patients at high risk for MRSA colonization. MRSA detection using culture-based screening was compared with a commercial PCR assay. RESULTS: The mean monthly incidence of nosocomial MRSA colonization or infection was 0.37 cases per 1,000 patient-days. The time-series model indicated an insignificant decrease of 0.14 cases per 1,000 patient-days per month (95% confidence interval, -0.18 to 0.46) after the introduction of PCR detection (P=.39). The mean interval from a reported positive result until contact precautions were initiated decreased from 3.8 to 1.6 days (P<.001). However, the cost of MRSA control increased from Can$605,034 to Can$771,609. Of 290 PCR-positive patients, 120 (41.4%) were placed under contact precautions unnecessarily because of low specificity of the PCR assay used in the study; these patients contributed 37% of the increased cost. The modeling study predicted that the cost per patient would be higher with detection by PCR (Can$96) than by culture (Can$67). CONCLUSION: Detection of MRSA by the PCR assay evaluated in this study was more costly than detection by culture for reducing MRSA transmission in our hospital. The cost benefit of screening by PCR varies according to incidences of MRSA colonization and infection, the predictive values of the assay used, and rates of compliance with infection control measures.     

新型TaqMan-MGB探针法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的探讨新型MGB探针在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测中的临床应用价值。方法以TaqMan-MGB探针技术为基础,用已克隆的mecA基因作参比品,实时检测临床标本和阴性参考品。结果所建立方法的最低检测限度为1个基因拷贝/反应,在100~109范围内,CT值(C代表Cycle,T代表阈值)同DNA量的对数呈线性关系;用该方法检测20例MRSA培养阳性的临床标本,结果均为阳性;用该方法检测20个非MRSA细菌株,结果均为阴性。结论所建立的方法适用于临床MRSA快速诊断。     

葡萄球菌医院感染及其耐药性

目的通过院内患者葡萄球菌感染及耐药状况调查分析,为临床治疗提供依据。方法按《全国临床检验操作规程》培养分离菌种,用法国生物梅里埃公司VITEK-60 System全自动细菌分析仪鉴定菌种及K-B单片琼脂扩散法做药敏试验。结果门诊患者626例分离出葡萄球菌159株,其中耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)占46.1%,以生殖道感染为主;住院患者3 236例分离葡萄球菌390株,其中MRS占81.7%,以呼吸道感染为主;甲氧西林敏感葡萄球菌(MSS)对青霉素的耐药率较高,而万古霉素和替卡拉宁则对MRS显示较强的抗菌活性。结论从感染部位显示,门诊患者以生殖道为主,住院患者以呼吸道为主,预防和控制MRS传播应成为医院感染的重要课题;从药敏试验结果显示,万古霉素是MRS感染的最佳抗菌药物,其次是替考拉宁,对MRS感染联合用药是必要的。     

环介导恒温扩增结合纳米横向流生物传感技术对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立与应用

目的 基于环介导恒温扩增结合纳米生物传感技术（loop - mediated isothermal amplification combined with nanoparticle - based lateral flow biosensor, LAMP - LFB）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin - resistant Staphylococcus aureus,MRSA）快速、准确、便捷检测技术的构建及应用评价。方法 以MRSA菌株特异性基因mecA为检测靶点,设计并修饰LAMP引物。采用实时浊度仪、孔雀石绿扩增指示剂（Malachite green, MG）及纳米生物传感器（nanoparticle - based lateral flow biosensor, LFB）为检测手段对LAMP扩增产物进行鉴定。对MRSA - LAMP - LFB检测体系的扩增温度和扩增时间进行优化,分析MRSA - LAMP - LFB检测方法灵敏性和特异性。应用微生物培养技术,PCR技术和新构建的MRSA - LAMP - LFB方法分别对48份临床疑似MRSA感染患者全血样本进行检测,进而评价MRSA - LAMP - LFB技术的临床应用性。结果 MRSA - LAMP - LFB技术优化后的反应条件为67 ℃,40 min。该技术的检测结果可直接通过观察LFB板条上的CL和TL条带显色进行结果判定。该技术的灵敏度为100 fg/μl（32 copies/μl）,其检测特异性为100%,与非MRSA菌株无交叉反应。经临床样本验证,LAMP - LFB技术对MRSA的检测结果与传统的“细菌培养 - 药敏鉴定”检测结果一致,其灵敏度高于传统的PCR方法。结论 基于LAMP和LFB技术建立的MRSA - LAMP - LFB检测方法特异性强、灵敏度高,能准确、快速地检测MRSA菌株,能为临床用药和MRSA防控提供准确、快速的实验室诊断依据。     

葡萄球菌凝固酶试验玻片法结果最佳判读标准的探讨

目的探讨葡萄球菌凝固酶试验玻片法结果的最佳判读标准。方法对临床标本分离的70株葡萄球菌属细菌,以聚合酶链反应（PCR）法检测葡萄球菌凝固酶基因（金标准）,同时以乳胶凝集法快速检测金黄色葡萄球菌(Slidex Staph Plus),试管法、玻片法检测葡萄球菌凝固酶。经VITEK Ⅱ全自动分析仪鉴定细菌到种。结果70株葡萄球菌属细菌中,PCR法检测葡萄球菌凝固酶基因56株为阳性;Slidex Staph Plus与PCR法相对应的56株为阳性;试管法检测与前2种方法相对应的54株为阳性,2株为假阴性;玻片法为强阳性;VITEK Ⅱ全自动分析仪鉴定56株为金黄色葡萄球菌（与PCR法同）。另14株菌经鉴定为溶血性葡萄球菌。玻片法以粗大颗粒状或明显大絮片状凝集为血浆凝固酶试验阳性的判断,其准确度为80.00%,假阳性率为20.00%。结论葡萄球菌凝固酶试验玻片法结果最佳判读标准：以10 s内血浆中呈不可磨散的明显团块状凝集,液面清亮,在无菌生理盐水中不凝集为阳性。     

鉴别脑膜炎奈瑟菌A、B、C、Y、W135群的多重聚合酶链反应诊断方法

目的建立一种能鉴别脑膜炎奈瑟菌（Nm）A、B、C、Y、W1355个血清群的多重聚合酶链反应（PCR）方法.方法首先PCR扩增Nm crgA基因,确定Nm感染;再通过多重PCR扩增荚膜表达基因orf-2和siaD基因,根据特异条带区分不同群Nm.结果多重PCR检测61株Nm与4株非Nm,能准确地鉴定并可将Nm分成5个血清群;检测4例流行性脑脊髓膜炎患者的脑脊液,2例出现A群400 bp的特异条带,而细菌培养和胶乳凝集方法检测均为阴性;检测18份流行性乙型脑炎患者标本,与胶乳凝集试验结果一致.结论多重PCR诊断方法能正确鉴别不同群Nm,对流行性脑脊髓膜炎的临床诊断与流行病学调查有重要意义.     

MRSA呼吸系统医院感染的分子流行病学调查

目的对广州呼吸疾病研究所2001年7月～2003年3月间,金黄色葡萄球菌引起的呼吸系统医院感染进行病原学监测. 方法收集临床分离菌株,应用脉冲场凝胶电泳的方法(PFGE)进行分型,确定菌株亲缘关系,结合临床资料分析. 结果在各种呼吸道采集标本中共收集到76株金黄色葡萄球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)68株,占金黄色葡萄球菌检出率89.47%,MRSA在我所病区中引起59例医院感染,属于暴发形式发病的有23例,属于聚集性发病的有19例,散发病例17例,PFGE分型表明,绝大多数MRSA属于同一型(A型)共有60株,其中A1亚型28株,A2亚型14株,A3亚型17株,A4亚型1株. 结论MRSA引起的呼吸系统医院感染十分严重,并主要由少数菌株的传播引起,及时采取有效措施控制MRSA的流行和播散非常必要.     

呼吸道感染病原菌分布及耐药性调查

目的了解呼吸道感染病原菌谱及耐药性。方法对1999年7月～2001年7月间，呼吸道感染住院患者合格痰标本进行细菌学培养，测定药物敏感性。结果2423份痰标本中分离细菌1053株，革兰阴性杆菌占72．08％，铜绿假单胞菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、流感嗜血菌、肺炎克雷伯菌分别占6．77％、5．90％、4．33％、4．17％、3．51％，其中154份标本为多重感染菌；大肠埃希菌、克雷伯菌属的ESBLs阳性率分别为40．0％、29．9％；MRSA及MRCNS的阳性率分别为41．5％、73．1％；药敏结果提示铜绿假单胞菌、肠杆菌属细菌、沙雷菌属、不动杆菌属及ESBLs阳性的大肠埃希菌、克雷伯菌属等均出现多重高比例耐药。结论近年呼吸道感染以革兰阴性杆菌为主，而且出现多重耐药。     

ICU下呼吸道医院感染病原菌分布及耐药性分析

目的 了解医院ICU患者的下呼吸道医院感染病原菌特征并进行耐药性分析,为临床用药提供依据.方法 对2010年1月-2011年7月ICU 951例医院感染患者,痰标本的细菌学培养结果进行回顾性分析.结果 ICU下呼吸道医院感染的病原菌以革兰阴性杆菌为主,占79.0％,主要有鲍氏不动杆菌225株、铜绿假单胞菌151株、肺炎克雷伯菌102株、大肠埃希菌43株、阴沟肠杆菌31株、嗜麦芽寡养单胞菌27株;革兰阳性球菌占17.7％,主要有金黄色葡萄球菌91株,其中MRSA 86株占94.5％,凝固酶阴性葡萄球菌30株,其中MRSCN 26株占86.7％,真菌占3.3％;革兰阴性杆菌对常用抗菌药物耐药率高,对亚胺培南、美罗培南耐药率相对较低,革兰阳性球菌对万古霉素、替考拉宁均敏感.结论 ICU下呼吸道医院感染以革兰阴性杆菌为主,显示多药耐药性,且耐药现象严重,应严格控制并谨慎使用新的超广谱β-内酰胺类抗菌药物,加强医院感染的预防和控制.