聚甲基丙烯酸酯纳米粒作为反义寡核苷酸传递系统的研究聚甲基丙烯酸酯纳米粒作为反义寡核苷酸传递系统的研究

目的 研究聚甲基丙烯酸酯阳离子纳米粒作为反义寡核苷酸传递系统的可行性。方法 以Eudragit RL100和RS100为材料,采用溶剂-非溶剂法制备纳米粒,再与寡核苷酸混合即得载药纳米粒。用透射电镜观察其形态、粒径测定仪测定粒径、超滤法测定药物的包封率,通过台盼蓝拒染试验和红细胞溶血试验测定纳米粒的细胞毒性,用流式细胞仪测定荧光标记的寡核苷酸的入胞量。结果 纳米粒的形态规整、大小均匀,平均粒径为127 nm左右,几乎所有的药物被负载。使用聚甲基丙烯酸酯纳米粒作为反义寡核苷酸载体后,进入细胞内的药物量急剧增加,并有显著的剂量依赖性,但对细胞有轻微的毒性作用。结论 聚甲基丙烯酸酯阳离子纳米粒是一种稳定、高效的反义寡核苷酸传递系统。     

反义寡核苷酸的体内研究

反义寡核苷酸通过序列特异地与靶ｍＲＮＡ结合而抑制其表达，从而有可能成为一类理想的，在基因水平调控的治疗试剂，寡核苷酸硫代磷酸酯因其较好的抗酶解活性，成为目前较广泛研究的寡核苷酸类似物之一。本文主要就其临床前体内药效学，以及动物及人体内的药动学，毒性，副作用和今后发展进行了综述。     

第二代反义寡核苷酸的研究

第一代反应核酸寡核苷酸硫代磷酸酯，是目前研究最广泛，最成熟的反义核酸药物，已进入临床试验阶段，但其具有一定的毒副作用；第二代反义核酸，包括嵌合寡核苷酸，杂合寡核苷酸等，是在硫代寡核苷酸的基础上，再引入其它的修复基团，从而提高其生物活性，减少毒副作用。本文着重介绍了第二代反应核酸的生物物理学性质，药动学及礤与第一代反应核酸毒性的比较。     

反义寡核苷酸药理的研究现状

人工合成的反义寡核苷酸抑制相关基因的转录和翻译，对许多涉及基因表达的疾病有一定的治疗作用。对反义寡核苷酸的药动学和药效学，不良反应已有较多的临床前研究，其对肿瘤，病毒感染等的临床试验初步结果，都显示了它的应用前景。     

反义寡核苷酸药理的研究现状

人工合成的反义寡核苷酸抑制相关基因的转录和翻译，对许多涉及基因表达的疾病有一定的治疗价值。对反义寡核苷酸的药动学和药效学、不良反应已有较多临床前研究，其对肿瘤、病毒感染等的临床试验的初步结果，都显示了它的应用前景。     

c-myc反义寡核苷酸对人肝癌细胞SMMC-7721端粒酶活性的影响

目的 :探讨c -myc反义基因治疗肿瘤的机制。方法:将正义 (sense)、反义 (antisense)、错配 (mismatch)的c -myc寡核苷酸作用于体外培养的人肝癌细胞SMMC -7721 ,分别应用免疫组化、RT -PCR、PCR -ELISA等方法 ,观察对c -myc蛋白表达、端粒酶亚单位及活性表达的影响。结果:10μmol/L浓度的反义c -myc寡核苷酸作用于SMMC -772124h、48h后 ,相应的c -myc蛋白、端粒酶催化亚单位hTERTmRNA及其端粒酶活性与空白对照组相比 ,差别有统计学意义(P<0.01);而正义组和错配组与空白对照组相比 ,差别无统计学意义(P>0.05)。结论:c -myc反义寡核苷酸可能通过抑制端粒酶活性而抑制肿瘤细胞增殖。     

反义寡核苷酸脂质体复合物性质对细胞摄入行为的影响

目的研究影响反义寡核苷酸脂质体复合物的性质和细胞摄取的因素。方法逆相蒸发法制备3种不同的空白脂质体,与反义寡核苷酸混合得到复合物,显微镜观察其形态,琼脂糖电泳分析载药量,流式细胞仪测定阳性细胞百分率和平均荧光强度。结果高电荷密度的脂质体和低离子强度介质可使复合物发生凝聚,载药量和细胞摄入量依赖于空白脂质体和药物的比例以及脂质体膜表面的电荷密度。结论阳离子脂质体可以提高载药量和细胞的摄入,其程度与复合物比例、脂质体膜表面电荷密度等有关。     

反义寡核苷酸药物分离分析技术的应用研究

综述反义寡核苷酸药物分离分析技术的应用研究，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱-质谱及毛细管电泳-质谱联用技术，并列举应用实例，讨论其优缺点，为该类药物研发所需分离分析手段提供依据。     

反义寡核苷酸阳离子脂质体的制备和体外细胞摄取研究反义寡核苷酸阳离子脂质体的制备和体外细胞摄取研究

目的制备高效促进细胞摄取反义寡核苷酸(ASON)和保护ASON的脂质体。方法以3β［n-(n′,n′-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇(DC-Chol)为类脂成分制备阳离子脂质体(以下简称DC-Chol脂质体),与ASON混合得到载药脂质体,测定载药率。用琼脂糖凝胶电泳分析载药脂质体的结构特点;流式细胞仪检测不同条件下细胞摄取荧光标记ASON的情况;变性聚丙烯酰胺电泳考察DC-Chol脂质体对ASON的保护作用。结果载药率与DC-Chol脂质体和药物的+/-电荷比有关,当+/-电荷比大于2时,载药率达90%以上;琼脂糖凝胶电泳显示ASON同时存在于DC-Chol脂质体的周围和包裹于其内部的两种形式;流式细胞仪测定结果表明,DC-Chol脂质体可明显增加细胞对ASON的摄取,阳性细胞染色率和胞内平均荧光强度均较对照组有明显增加,增加程度主要取决于+/-电荷比例,血清可降低细胞的摄取;变性聚丙烯酰胺电泳证实DC-Chol脂质体具有保护ASON的作用。结论DC-Chol脂质体具有显著增加细胞摄取ASON和保护ASON的作用,有望成为反义类药物的高效传递系统。     

慢性髓性白血病的反义寡核苷酸治疗

慢性髓性白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是造血干细胞的疾患,表现为在外周血中含有大量未成熟的粒细胞、嗜碱性细胞、血小板以及能引起脾大的白细胞减少症。发病率为（1～2）／100000,占成年人白血病的15％左右。     

In vitro release characteristics and cellular uptake of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for topical delivery of antisense oligodeoxynucleotides

The efficacy of antisense oligodeoxynucleotides (AsODNs) is compromised by their poor stability in biological fluids and the inefficient cellular uptake due to their size and negative charge. Since chemical modifications of these molecules have resulted in a number of non-antisense activities, incorporation into particulate delivery systems has offered a promising alternative. The aim of this study was to evaluate various poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles for AsODN entrapment and delivery. PLGA nanoparticles were prepared using the double emulsion solvent evaporation method. The influence of formulation parameters such as PLGA concentration and volume ratio of internal aqueous phase volume (Va1) to organic phase volume (Vo) to external aqueous phase volume (Va2) on particle size, polydispersity index (PDI) and zeta potential (ZP) was investigated using a full factorial study. The particle size increased with increasing PLGA concentrations and volume ratios, with an interaction detectable between the two factors. AsODN entrapment efficiencies ranged between 49.97% and 54.95% with no significant difference between various formulations. By fitting the in vitro release profiles to a dual first order release model it was shown that the AsODN release occurred via two processes: a diffusion controlled process in the early phase (25 to 32% within one day) and a PLGA degradation process in the latter (39 to 70% after 14 days). Cellular uptake studies using primary corneal epithelial cells suggested active transport of nanoparticles via endocytosis. PLGA nanoparticles therefore show potential to successfully entrap AsODNs, transport them into cells and release them over time due to polymer erosion.     

声振脂质微泡作为反义寡核苷酸传递系统的研究

目的研究声振脂质微泡(PGM)作为反义寡核苷酸传递系统的可行性。方法应用PGM将结合荧光蛋白的反义核苷酸片段ZL转染到乳腺癌细胞SK-BR-3中，考察不同因素如：ZL浓度、PGM浓度、超声持续时间和机械指数(MI)等对ZL转染率及细胞存活率的影响。考察PGM的结果，并与其他脂质载体如lipofectamine和脂质体的转染效果比较。应用荧光显微镜观察转染率，碘化丙锭(PI)染色观察细胞存活率。结果考察因素中，PGM浓度，超声持续时间和MI对ZL转染率和细胞存活率影响较大。最佳超声条件为：PGM浓度为2%，超声持续时间为30 s和MI为1.0，在此条件下转染率为78%±10%，比未超声的PGM(4.0%)和lipofectamine(4.3%)的转染率增加了约18倍，而细胞存活率相近。结论在适宜条件下，声振脂质微泡可以有效促进体外反义核苷酸的转染。     

反义寡聚硫代磷酸脱氧核糖核苷酸的抗巨细胞病毒作用

目的　研究互补于CMV主要即刻早期 (MIE)mRNA的起始密码子位点和MIEmRNA前体内含子 1/外显子 2拼接位点的 2个 19个碱基的ASS ODN (AS1和AS2 )对CMV复制的抑制作用。方法　采用原位ELISA法测定 2BS细胞上CMV抗原量。结果　 2个S ODN均有抗CMV作用 ,半数有效浓度 (EC50 )分别为 4 5 3和 10 2 μmol·L-1。 8 0 μmol·L-1的AS1使CMV抗原分泌推迟 3～ 4d。感染后立即加药效果最好 ,12h后加药效果大大下降 (P <0 0 5 ) ,感染后 36h再添加同一剂量及与DHPG联合使用效果明显增强 (P <0 0 5 )。 2种ASS ODN 6 4 0 μmol·L-1时仅有轻微的细胞毒性 ,16 0 μmol·L-1以下浓度无明显毒副作用。采用 5mg·L-1的脂质体使 2种S ODN的EC50 分别降低了 111 0和 15 1 7倍。 2种正义序列对照也显示出抑制效应 ,EC50 分别为 2 6 2和 30 1μmol·L-1。NorthernBlot分析提示激活RNA酶H降解杂交双链中的mRNA分子为重要的特异性作用机制 ,而干扰CMV对细胞的吸附与侵入为重要的非特异性作用机制。结论　作用于MIE基因的ASS ODN可有效地抑制CMV复制 ,值得进一步研究以应用于治疗CMV感染     

HER-2癌基因反义寡脱氧核苷酸对乳腺癌细胞放射敏感性的影响

目的探讨癌基因HER-2反义寡核苷酸联合放疗对乳腺癌细胞的影响。方法实验分组如下:HER-2反义寡脱氧核苷酸组、HER-2正义寡脱氧核苷酸组、叶酸对照组和空白对照组。用RT-PCR方法、MTT法及平板克隆形成实验检测乳腺癌细胞SK-Br-3受药物处理后,经60Coγ射线照射,HER-2表达水平、细胞存活分数和集落形成率的改变。结果经HER-2反义寡核苷酸-叶酸处理的细胞,对60Coγ射线的放射敏感性增加,细胞的HER-2癌基因表达水平降低,存活分数及集落形成率与正义寡核苷酸、叶酸和空白对照组比较明显降低(P<0.05),而正义寡核苷酸、叶酸与空白对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论HER-2反义寡核苷酸抑制癌基因表达的作用增加乳腺癌细胞SK-Br-3对放疗的敏感性。     

脂质体包裹的反义寡核苷酸逆转耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性的研究

目的：用人工合成磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC），二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（dimyristoyl phosphatidylglycerol，DMPG）制备反义寡核苷酸阴离子脂质体并研究脂质体包裹的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）耐药基因表达信号传导通路中BlaRlmRNA表达的反义寡核苷酸（antisense phosphothioate oligodeoxynucleotides，AS-ODNs）对MRSA耐药性的影响。方法：设计合成AS-ODNs；薄膜分散冻干法制备其脂质体；透射电镜观察脂质体的形态；离心纯化脂质体并用紫外分光光度计测定包封率、渗漏率；振荡法检测体外释放度；平板克隆形成实验计数菌落数CFU；微量法测定细菌生长曲线。结果：反义寡核苷酸阴离子脂质体大小均匀，为圆球体，包封率为77．38％，冷冻条件下保存1月后渗漏率为0．18％，体外释放度实验表明24h后约60％的药物从脂质体中释放，反义寡核苷酸脂质体可显著抑制MRSA生长，脂质体包裹的不同剂量的AS-ODNs中MRSA的菌落形成单位（CFU）与空白对照组比较明显减少，具有剂量依赖性，且效果明显优于未被脂质体包裹的AS-ODNs。结论：采用薄膜分散冻干法制备反义寡核苷酸阴离子脂质体，包封率较高，质量稳定，反义寡核苷酸脂质体能逆转MRSA的耐药性，效果明显优于单用AS-ODNs，可作为反义寡核苷酸进入细菌的载体。     

Livin mRNA的反义核酸诱导MCF-7乳癌细胞凋亡作用

目的：以livin mRNA为靶点设计反义硫代脱氧寡核苷酸(PS—ODNs)，探讨其体外抗肿瘤效应及其机制。方法：设计以livin mRNA为靶点的反义核酸并作用于MCF-7乳癌细胞，用MTT、RT—PCR和流式细胞仪检测等方法对其进行评价研究。结果：在设计的一些反义核酸中，YMZ05能够有效地抑制livin基因的表达，增加caspase-3的活性，诱导MCF-7细胞凋亡，明显抑制其生长，结论：通过抑制livin基因的表达能够抑制MCF-7乳癌细胞生长、诱导其凋亡，livin可能会成为抗肿瘤的新靶点。     

反义药物作用中的“靶二级结构域”

目的　在计算机模拟mRNA二级结构与定量构效关系分析的基础上优化反义药物设计。方法　使用软件RNAstructure模拟mRNA二级结构,针对二级结构单元进行反义药物设计,用肺腺癌细胞株A5 49评价反义药物的体外抗肿瘤生物活性,用软件SPSS进行多元回归分析。结果　有效药物作用靶点相对集中地分布于由若干二级结构单元组成的局部二级结构区域。我们称之为“靶二级结构域(靶域)”。“靶域”结构相对稳定,但其中包含不稳定二级结构单元(ΔG°>0 )。针对不同“靶域”设计的反义药物显示不同的生物活性(P<0.01) ,但靶向同一“靶域”的反义药物生物活性无统计差别。结论　“靶域”现象有助于反义药物靶点的选择,并对探针、引物设计及mRNA局部功能的研究具有重要意义     

Adsorption of Oligonucleotides onto Polyisohexylcyanoacrylate Nanoparticles Protects Them Against Nucleases and Increases Their Cellular Uptake

Oligonucleotides can be adsorbed on polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles in the presence of hydrophobic quartenary ammonium salts. Oligonucleotides bound to nanoparticles are protected from nuclease attack both in buffer and in cell culture media. Cellular uptake of Oligonucleotides is increased when they are adsorbed onto nanoparticles as a result of the capture of nanoparticles by an endocytic/phagocytic pathway. Intracellular stability towards nucleolytic degradation is increased in the presence of nanoparticles. These results show that nanoparticles can be considered as convenient carriers for the protection and delivery of oligonucleotides to cells.