鸭乙型肝炎病毒感染特异细胞介导免疫检测方法的建立

目的：建立简便、特异的鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染特异细胞介导免疫（CMI）检测方法。方法：分别从DHBV强阳性的血清和肝组织中纯化DHBsAg、DHBcAg,Bradford法定量后，用于急性DHBV感染重庆麻鸭CMI的检测。结果：急性感染后10d鸭外周血单个核细胞（PBMC）快速出现对DHBsAg、DHBcAg的不同程度增殖反应，5周内下降至正常水平。7份刺激细胞上清DuIFN-γ检测结果为阳性，OD540nm读数介于0．062－0．108之间，细胞因子的表达水平与PBMC增殖反应强度呈现较好的相关性。结论：DHBV感染重庆麻鸭CMI检测方法的建立，为了解感染鸭特异免疫应答状态提供了重要参考。     

HBeAg阴性的慢性乙型肝炎血清HBV-DNA定量检测及意义

目的　为探讨ＨＢｅＡｇ 阴性ＣＨ－ Ｂ 患者血清ＨＢＶ－ ＤＮＡ 定量检测的意义。方法　应用定量ＰＣＲ法对经肝穿活检确诊的５２ 例ＨＢｅＡｇ 阴性,３３ 例ＨＢｅＡｇ 阳性ＣＨ－ Ｂ 血清进行了ＨＢＶ－ ＤＮＡ 含量检测,并将ＨＢｅＡｇ 阳性与阴性患者ＨＢＶ－ ＤＮＡ 含量、ＨＢｅＡｇ 阴性ＨＢＶ－ ＤＮＡ 高水平与低水平患者肝脏病理损害分别进行了比较。结果　ＨＢＶ－ ＤＮＡ 含量ＨＢｅＡｇ 阳性患者显著高于阴性患者,ＨＢｅＡｇ 阴性ＨＢＶ－ ＤＮＡ 高水平患者肝脏病理损害明显重于低水平患者（ 均Ｐ＜ ００５） 。结论　提示血清ＨＢｅＡｇ 阳性;确为判断ＨＢＶ 复制的良好指标; ＨＢｅＡｇ 阴性ＨＢＶ－ ＤＮＡ 高水平者,尤以重视,及时给予抗病毒等治疗实属必要。     

非放射性分子杂交法检测HBV感染

用非放射性标记的ＨＢＶ－ＤＮＡ探针检测３７１份至少有一项ＨＢＶ免疫学标志阳性血清和５１０份对照血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果表明：５１０份对照血清和７９份仅抗－ＨＢｓ阳性血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ均为阴性，８２份ＨＢｓＡｇ阳性、ＨＢｅＡｇ阳性血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率为１００％，１０３份ＨＢｓＡｇ阳性、ＨＢｅＡｇ阴性血清的检出率为７９．６％，７６份ＨＢｓＡｇ阳性。ＨＢｅＡｇ阴性、但抗－ＨＢｅ阳性血清的检出率为８０．３％，２９２份ＨＢＶ不同感染阶段血清总检出率为７５％。非放射性分子杂交法可直接检测出ＨＢＶ的复制，由于该法亦可定量，故还可用于判断血清传染程度和血清病毒的含量。     

乙肝preS1检测试剂盒的初步应用

目前各级医疗单位乙肝的有关血清学标志物(HBVM)的检测开展已很普遍，但检测HBV-DNA判断乙肝HBV在体内复制的方法(斑点杂交法、PCR法等)在基层医院开展就有一定的难度。最近我们应用ELISA法检测血清“乙肝表面抗原preS1蛋白”与不同类型HBsAg阳性血清进行了比较，以观察HBV复制情况。     

地高辛标记DHBVDNA探针的制备及应用

采用随机引物法制备地高辛标记含鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）基因片段的质粒ＰＢＲ３２２作为探针，建立ＤＨＢＶＤＮＡ斑点杂交试验，结果：探针可检出１．０ｐｇ同源ＤＮＡ片段，不与人乙肝病毒（ＨＢＶ）及鸭肝细胞ＤＮＡ发生杂交，与￣３５Ｓ－ＤＨＢＶＤＮＡ探针的灵敏度相似。该探针检出重庆地区２－３月龄麻鸭血清ＤＨＢＶ自然感染率为２５．４８％；用ＤＨＢＶ血清经腹腔感染１－２日龄雏鸭，１周后阳性感染率为８２．９０％，并可持续感染至少２月。     

对流免疫电泳技术检测鸭血清中DHBsAg

用CsCl密度梯度离心法提纯鸭血清中的鸭乙型肝炎病毒表面抗原(D-HBsAg)。以纯化的DHBsAg加等量弗氏佐剂对家兔免疫3次,第3次免疫2周后采血,分离血清,用正常鸭血清对其吸收,得到初步纯化的抗血清,用此作为抗DHBsAg之抗体,用对流免疫电泳技术(CIEP)检测DHBsAg,检测101份,与DHBV DNA斑点杂交法比较,结果:CIEP敏感度80.43%,特异度92.73%,一致性87.13%。重复试验结果相同,表明可用于对鸭血清中的DHBsAg的初步筛选。     

乙肝病毒标志物阳性产妇母乳喂养的研究

目的：探讨乙型肝炎（ 乙肝） 病毒携带孕妇胎儿宫内感染率和乳汁中乙肝病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 阳性率的相关性,分析研究乙肝血清学指标阳性产妇是否适于哺乳。方法：对５２ 例乙肝血清学指标阳性的产妇,应用酶联免疫吸附法和斑点杂交法分别检测脐血和初乳中的 Ｈ Ｂ Ｖ 标志物（ Ｈ Ｂ Ｖ Ｍ） 以及 Ｈ Ｂ Ｖ 脱氧核糖核酸（ Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ） ,并对比分析。结果：孕妇 Ｈ Ｂ Ｖ 阳性与相应的脐血和初乳中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｍ 阳性率以及 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的检出率呈高度的一致性（ Ｐ ＞ ００５） 。５２ 例 Ｈ Ｂ Ｖ Ｍ 阳性的孕妇中,脐血和初乳中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的检出率均以乙肝表面抗原（ Ｈ Ｂｓ Ａｇ） 、乙肝ｅ 抗原（ Ｈ Ｂｅ Ａｇ） 及乙肝核心抗体（ Ａｎｔｉ Ｈ Ｂｃ）３ 项阳性者最高（８５７１ ％ 和９２８６ ％ ） , Ｈ Ｂｓ Ａｇ 、 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 双项阳性者次之（８０ ％ ） , Ｈ Ｂｓ Ａｇ 单项阳性者最低（２０ ％ ） 。结论： Ｈ Ｂ Ｖ 宫内传播以及初乳排毒率与母亲的 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 和 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 状态密切相关。直接检测初乳中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 为指导哺乳的最可靠方法。血中 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 、 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 和 Ａｎｔｉ Ｈ Ｂｃ３ 项阳性以及 Ｈ Ｂｓ     

荧光定量PCR及斑点杂交检测HBV DNA与血清HBV标志物的关系

目的　比较荧光定量PCR和斑点杂交检测血清HBVDNA与血清HBV标志物 (HBVM )的相互关系。方法　采用荧光定量PCR(FQ -PCR)、斑点杂交和酶联免疫吸附法 (ELISA)同时检测 2 13份肝炎患者血清 ,并对结果进行分析比较。结果　 2 13份肝炎患者血清中FQ -PCR及斑点杂交法检测HBVDNA阳性数分别为 12 5例、80例 ,阳性检出率分别为 58.7%和 3 7.6% ,2种方法阳性检出率有显著性差异 (P <0 .0 5)。除HBsAg、HBeAg阳性组和HBsAb阳性组FQ -PCR和斑点杂交HBVDNA阳性检出率相同外 ,其余各组FQ -PCRHBVDNA检出率明显高于斑点杂交 (P <0 .0 5) ,HBeAg阳性 2组的 2种方法HBVDNA检出率明显高于HBeAg阴性各组 (P <0 .0 5)。随着FQ -PCR检测HBVDNA拷贝数的增加 ,斑点杂交法阳性检出率也明显增加。结论　FQ -PCR和斑点杂交法检测HBVDNA均可直接反映乙肝患者HBV感染、复制及病程变化 ,而FQ -PCR能真实地反映病毒的负荷量 ,对乙肝临床诊断及抗病毒治疗疗效观察较斑点杂交与HBVM更具有指导意义     

聚合酶链反应检测重型肝炎患者血清HBVDNA

采用ＰＣＲ法检测４８例重型肝炎患者血清中ＢＨＶＤＮＡ存在情况，并与斑点杂交检测进行比较，结果表明：ＰＣＲ检测３９例阳性，检出率为８１．３％（３９／４８）．ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（＋）组ＰＣＲ检测均阳性（８／８），ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（－）组阳性率为８８．０％（２２／２５），抗体阳性组检出率为７２．７％（８／１１），检测灵敏度为１．０ｆｇ；斑点杂交检测１５例阳性，阳性率３０．２％（１５／４８），各组斑点杂交阳性率均低于ＰＣＲ法．提示：（１）大多数重型肝炎患者血清中存在低滴度的病毒颗粒，对重肝发病有一定作用；（２）大部分ＨＢｅＡｇ阴性，抗体阳性的重型肝炎患者血清仍有传染性，应考虑抗病毒治疗．     

HBV感染者外周血单个核细胞中HBV DNA的检测

目的；研究乙型肝炎毒（ＨＢＶ）感染者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）中ＨＢＶ ＤＮＡ的存在及其与血清ＨＢＶ ＤＮＡ的关系。方法：用ＰＣＲ法及斑点杂交法对５０例ＨＢｓＡｇ（＋）的感染者ＰＢＭＣｓ ＨＢＶ ＤＮＡ进行检测。同时用ＰＣＲ法检测感染者血清ＨＢＶ ＤＮＡ。结果：ＰＣＲ法和斑点杂交法分别从３５份和３２份ＰＣＭＣｓ检出率均为６０．０％左右。ＰＣＲ法检测血清ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率为３６．０％。结论：Ｈ     

"911"抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研究

目的：评价药物“911”在鸭实验动物模型中抗鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的效果。方法：北京鸭足静脉注射DHBV，第1次试验随机分为空白，Ara-AMP对照和20，40，80mg/kg3个治疗组，于感染后第7d,给药后第5，10d和停药后第5d采血，第2次试验设空白对照和40．80mg/kg2个治疗组，用药后第5，10d及停药后第5d各组分别处死3只鸭取肝脏检测肝HDBV DNA，采用DOT EIA法检测血清DHBsAg，斑点分子杂交法检测DHBV DNA，Southern转膜杂交检测鸭肝DHBV DNA。结果：第1次试验结果表明，血清DHBsAg及DHBV DNA在20mg/kg组基本无变化，在40mg/kg组治疗后明显下降，但效果无80mg/kg组明显；80mg/kg组DHBsAg 及DHBV DNA水平治疗效果最明显，与用药前及空白对照比较均有统计学意义。第2次试验与第1次试验的结果基本吻合，鸭肝脏DHBV DNA检测表明，80mg/kg治疗组对鸭肝DHBV DNA复制有明显抑制作用。可减少鸭肝DHBV DNA含量。结论：“911”有较好的抗DHBV感染效果，具有明显的剂量反应关系和可重复性。     

一种快速、简便检测鸭乙型肝炎病毒抗原、抗体的方法

本文报道检测鸭乙型肝炎表面抗原(DHBsAg)及抗体的斑点酶免疫测定法(Dot Euzyme Immunoassay,Dot EIA)。以硝基纤维素膜为载体依次加被检血清、抗DHBV免疫血清、辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA-酶结合物),可测标本中DHBsAg。依次加纯化DHBV、被检血清、SPA-酶结合物则可测血清中抗体及效价。用此法检测自然感染鸭血清40份,实验感染鸭血清220份,并与DHBV核酸斑点杂交法比较分析,两种方法符合率94.2％。用本方法测定本室制备的兔抗DHBV免疫血清,抗体效阶为1/3200。Dot EIA简单、快速、敏感、特异,是研究DHBV较有实用价值的一种方法。     

Duck hepatitis B virus infection and duck hepatocellular carcinoma.

To study the relationship between duck hepatitis B virus (DHBV) infection and duck hepatocellular carcinoma (DHCC), histological examination and DHBV DNA hybridization were performed in 875 ducks from three flocks in Qidong County. Among them, 34 suffered from hepatoma, including 23 hepatocellular carcinoma, 8 cholangiocarcinoma and 3 hepatocellular-cholangiocarcinoma. Of the 34 ducks with hepatoma 27 were positive for DHBV DNA in the liver and/or serum. DHBV DNA was demonstrated in neoplastic nodules of 22 ducks. Southern blot analysis showed that 13 cases were of the integrated pattern of DHBV DNA in neoplastic nodules. The paratumor tissues of 14 ducks with massive tumor were analysed at the same time. Five cases showed integrated pattern, 4 cases free pattern and the other 4 cases both integration and free pattern of DHBV DNA. The hybridization pattern of DHBV DNA in tumor nodule was different from that in paratumor regions in 11 cases and identical in 3 cases. DHBV antigen was positive in 13 tumor nodules and 21 paratumor tissues in the 34 ducks with hepatic tumor by both victoria blue and orcein stain methods. Advanced liver diseases were found in 30 out of the 34 ducks with hepatoma, including 12 cirrhosis and 18 chronic active hepatitis. In southern blot analysis of 122 DHBV DNA positive Qidong ducks without hepatoma, only free pattern of DHBV was seen, while 44 control ducks from Changchun were negative for DHBV DNA. Neither hepatic tumor nor liver diseases were seen in the control ducks. The results suggest that hepatocellular carcinoma in ducks is similar to that in human HCC. They have a high frequency of viral DNA integrated into the host genome and a liver disease background.

     

THE ROLE OF RECOMBINANT HUMAN FUSION PROTEIN IL－6／IL－2（CH925） IN HEPADNA VIRUS INFECTION TREATMENT

ＴＨＥＲＯＬＥＯＦＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＨＵＭＡＮＦＵＳＩＯＮＰＲＯＴＥＩＮＩＬ－６／ＩＬ－２（ＣＨ９２５）ＩＮＨＥＰＡＤＮＡＶＩＲＵＳＩＮＦＥＣＴＩＯＮＴＲＥＡＴＭＥＮＴＭｉＺｈｉｂａｏ（米志宝），ＺｈａｏＣｈｕｎｈｕａ（赵春华），ＺｈａｎｇＸｉｔ...     

鹅血清中发现鸭乙型肝炎病毒样颗粒

用DNA斑点杂交、电镜、免疫电镜和斑点酶免疫法(Dot EIA),在鹅血清中发现一种与鸭乙型肝炎病毒(DHBV)相似的病毒颗粒。用DNA斑点杂交法和Dot EIA在鹅群中测得DHBV DNA和DHBsAg的阳性率均为32.43%(12/37)。对阳性血清进行电镜观察,见到直径30～60nm的球型颗粒,形态与DHBV相似。抗DHBsAg能使病毒颗粒发生凝聚。用CsCl密度梯度法对DHBV阳性血清进行超速离心,发现病毒颗粒分布在1.16～1.24g/ml的密度范围内,与DHBV的密度范围(1.15～1.25g/ml)接近一致,表明鹅血清中的病毒颗粒,不仅在形态学上与DHBV相似,且核酸序列与DHBV也有同源性,由其编码产生的表面抗原成分与DHBsAg有共同的抗原性。作者提出,这种病毒可能是1.独立存在于鹅体内的一种新的DNA病毒,与肝脏的关系有待探讨;2.作用于不同宿主的DHBV;3.DHBV的不同亚型。     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

逆向斑点杂交.斑点杂交和电镜检测鸭乙型肝炎病毒的比较

本文将逆向斑点杂交同时检测鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV DNA)及其特异DNA多聚酶(DNAp)的结果,与斑点杂交检测DHBV DNA和电镜检测DHBV颗粒的结果作了比较。174份鸭血清用逆向斑点杂交和斑点杂交进行了配对检测,两者结果在统计上无差别。77份用逆向斑点杂交和电镜作了配对检测,结果也无统计学差别。部分样品用三种方法重复检测多次,结果以逆向斑点杂交检测的重复性最好。并认为逆向斑点杂交具有方法简单、可靠、重复性好和一次能同时检测DHBY DNA和特异DNAp两个指标的优点,是研究体内嗜肝病毒复制较为理想的方法。     

外周血中鸭肝炎病毒动态与肝病理变化关系的研究

从山东地区产的成年鸭中分离出鸭乙肝病毒,人工感染当地1日龄雏麻鸭。用斑点酶法、斑点杂交法及用电子显微镜观察外周血中被感染鸭乙肝病毒不同时期的动态,并对不同感染阶段的肝组织病理变化进行了分析。结果表明,感染3周时鸭体内病毒复制较为活跃,此时肝组织病理损害也较严重。本实验为研究人类乙肝病毒的早期感染尤其是母婴传播过程外周血中乙肝病毒的动态与肝组织病理变化的关系提供了动物模型,为防治乙肝病毒早期感染提供了实验基础。     

乙型肝炎病毒DNA转染与鸭乙型肝炎病毒DNA感染原代鸭肝细胞对比研究

目的探讨HBVDNA复制和表达的跨种属特异性,为HBVDNA转染跨种属原代肝细胞模型的建立提供实践基础和理论依据.方法分离培养原代鸭肝细胞(PDH),电转线性HBVDNA(转染组,1.19×1012拷贝/1×107PDH)或急性感染DHBV(感染组,4×108病毒颗粒/1×107PDH),分别于转染/感染后ld、3d、5d等时点检测PDH培养上清或裂解液中HBsAg、HBeAg与DHBsAg(采用IMX系统或ELISA检测);并采用DotBlotting检测PDH裂解液中总HBVDNA.于转染/感染后2d提取PDH总DNA采用SouthemBlotting分析HBVDNA与DHBV复制型式.以单纯电击或未感染的PDH为对照组.结果转染后1d、3d和5d各时点转染组PDH裂解液中HBsAg分别为15.24、14.55和5.13(P/N值,阳性≥2.1),HBeAg均为阴性;PDH培养上清中HBsAg与HBeAg均阴性;感染组各时点PDH上清中DHBsAg分别为14.6、31.53、34.73(S/N值,阳性≥2.1);上述各项指标于对照组均为阴性.DotBlotting显示转染组与感染组PDH各时点的裂解液中HBVDNA与DHBVDNA均为阳性,对照组为阴性;SouthernBlot分析显示转染组HBVDNA与感染组DHBV均为游离复制型,可见4.0kb以下分子涂抹带,包括rcDNA、cccDNA(scDNA)和ssDNA等复制中间体;未见整合型HBVDNA-高分子区(4～24kg)涂抹带.结论HBVDNA在PDH中的复制和表达与DHBV感染组相似,可能为肝细胞内环境依赖性,无严格种属特异性限制.     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。